Разное

Модель лада: Модели LADA, снятые с производства – Официальный сайт LADA

Содержание

Лада Веста Спорт: цена Лада Веста Спорт, технические характеристики Лада Веста Спорт, фото, отзывы, видео

Технические характеристики Лада Веста Спорт

Цена

1 110 000 - 1 146 000

Мин. цена

1 110 000

Макс. цена

1 146 000

Модельный год2018
Тип кузоваСедан
Длина, мм4420
Ширина, мм1774
Высота, мм1478
Количество дверей4
Количество мест5
Объем багажника, л480
Экологич. классЕВРО 5
Страна сборки
Россия

Модификации Лада Веста Спорт

Лада Веста Спорт 1.8 MT

Цена от

1 110 000

Максимальная скорость, км/ч193
Время разгона до 100 км/ч, сек9.6
ДвигательБензиновый
Рабочий объем, см31774
Мощность, л.с. / оборотах145/6000
Момент, Н·м / оборотах184/3600
Расход комби, л на 100 км7.9
Тип коробки передачМеханическая, 5 передач
ПриводПередний
Показать все характеристики

Одноклассники Лада Веста Спорт по цене

От 1 050 000

До 1 496 000

Седан

Россия

Год: 2016

От 1 175 000

До 1 525 000

Седан

Россия

Год: 2018

От 979 900

До 1 069 900

Седан

Россия

Год: 2017

От 952 000

До 1 257 000

Седан

Россия

Год: 2017

Отзывы владельцев Лада Веста Спорт

Лада Веста Спорт, 2018 г

Купил я Лада Веста Спорт на днях и вот мои впечатления от авто: она как минимум не хуже иномарок в схожем ценовом сегменте. Подвеска глотает неровности дороги, но при этом остаётся в меру жёсткой и комфортной. Повороты - на ура. Реально, она очень хороша в поворотах, а боковые поддержки кресел цепко держат водителя и не дают ему потерять контроль над дорогой. Сейчас у авто обкатка, но даже не превышая рекомендуемые производителем 3500 об. машинка ведёт себя бодро и позволяет без опаски совершать любые маневры на дороге. Тормоза хорошие. Но скрипят, не знаю, с чем это связано. Возможно, обкатка, а дальше посмотрим. Расход в пределах 10,5 по городу, заправляю 95-ым. Свет у Лада Веста Спорт хороший, камера заднего вида даже в ночных условиях и при плохой освещённости показывает хорошую картинку. Руль и педали легковесны, почти воздушны, но достаточно информативны. Рычаг КПП наоборот требует чуть больших усилий. Пока пробег минимален (чуть больше 200 км), но этот автомобиль мне однозначно зашёл. Ну а теперь о ложке дёгтя: хотелось бы 6 передачу, ибо на трассе это вещь нужная. По городу с головой хватает 5-ти ступки.

Уже вышеупомянутый скрип при торможении. Я понимаю, что с подобной проблемой сталкиваются даже владельцы авто классом выше и в совсем другом ценовом сегменте. Почему-то отсутствует подогрев задних сидений, хотя в других моделях Лада его можно увидеть в качестве опции. Наверное, пока всё.

   Достоинства: экстерьер. Отличная подвеска. Управляемость. Кресла с боковой поддержкой.

   Недостатки: не хватает 6 передачи.

  Владимир, Невинномысск


Лада Веста Спорт, 2018 г

Ну вот и я стал обладателем долгожданной Лада Веста Спорт. Вкратце об автомобиле – «рулёжка» и тормоза это просто огонь. По поводу движка пока не наваливаю, так как на обкатке, но чувствуется, что тяга есть с низов. В общем, тачка огонь и то, что отдал за Лада Веста Спорт больше 1 млн. нисколько не жалею. На данный момент пробег 1600 км.

   Достоинства: классный экстерьер. Удобство в салоне. Эргономика. Сиденья. Управляемость. Резвый двигатель. КПП. Подвеска.

   Недостатки: пока еще рано что-то писать, позже посмотрим.

  Александр, Москва

 

Обои рабочего стола Лада Веста Спорт

 

 

1024x768

 

1280x1024

Обои Лада Веста Спорт

 

Lada Vesta Sport / Лада Веста Спорт

Седан Lada Vesta Sport, дебют которого состоялся на Международном московском автосалоне 2018, воплотил в себе лучшие инженерные достижения АвтоВАЗовцев. Как утверждают в Тольятти, данная модель строилась с применением гоночных технологий, при этом она отлично сбалансирована для ежедневной городской езды. Сравнивая Lada Vesta Sport со стандартной "Вестой" нельзя не отметить более стремительные пропорции, достигнутые за счет увеличенных кузовных арок, расширенной колеи обеих осей, эффектных легкосплавных дисков с колесами низкого профиля, особых аэродинамичных бамперов, заднего диффузора, агрессивных двойных патрубков выхлопной системы.

Вместе с тем, Lada Vesta Sport отличается слегка возросшими габаритами - по 10 мм прибавилось по длине и ширине, клиренс ожидаемо занизили, теперь он равен 140 мм, а это минус 31 мм по сравнению с классической Лада Веста. Для повышения динамики инженеры увеличили прижимную силу на передней (до 7.8 кг с 33) и зaдней осях (до 11.6 кг с 22.2). Впервые на Лада реализована функция подсветки поворотов - в зависимости от выворота руля в темное время суток дополнительно подключается левая или правая противотуманные фары.

Интерьер Lada Vesta Sport сочетает узнаваемую архитектуру и контрастные декоративные элементы, указывающие на спортивный характер автомобиля. Подвеска седана получила обновленные настройки - отныне водитель может выбрать один из трех режимов работы шасси: азарт, информативность или комфорт. Электронный помощник стабилизации в Лада Веста Спорт можно отключать, во включенном состоянии он срабатывает позже, чем обычно - это позволит получить максимум удовольствия в скоростном режиме езды.

1.8-литровый двигатель подвергнут модернизации - для лучшей отдачи в нем изменились алгоритмы фаз газораспределения, а также применены оригинальные распредвалы и повышено давлeние в топливной системе. Работать этой силовой установке предстоит с классической 5-скоростной механикой, автоматическая коробка не предусмотрена. Помимо всего, самая быстрая "Веста" получила улучшенные тормоза - спереди устанавливаются тормозные диски с увеличенным диаметром, задние остались неизменными.

Для спортивного седaна Лада Веста предусмотрены два варианта комплектаций: Luxe и Luxe Multimedia. В базовый состав оснащения вошли фирменные колесные диски R17, спойлер, комбинированная отделка интерьера (экокожа и алькантара), LED-подсветка салона, бортовой компьютер, две розетки 12V, мультифункциональный руль, аудиосистема с 6-ю динамиками. Дополнительный комфорт в салоне Lada Vesta Sport обеспечивается с помощью климатической системы, охлаждаемого вещевого ящика, 3-уровневого подогрева передних кресел, электростеклоподъемников передниx и задних дверей - все эти функции также вошли в стандартное оснащение модели.

В комплектации Luxe Multimedia дополнительно имеются обогрев лобового стекла, видеокамера заднего вида и многофункциональный медиакомплекс с навигацией (дисплей Touchscreen на 7 дюймов, USВ, AUX, функция Hands Free). Две передние подушки безопасности, система электроннoго контроля устойчивости, помощь при въезде на подъем, функция вспомогательного торможения, дисковые тормоза с повышенной производительностью, противотуманные фары и ДХО доступны во всех линиях исполнения Лада Веста Спорт.

Модельный ряд автомобилей Lada, модели Лада 2021 в наличии у официального дилера Лада Автомир Брянск

Новая Лада в Брянске

Lada — отечественная автомобилестроительная компания, известная благодаря производству надежных внедорожников, кроссоверов, седанов и универсалов. Автомобили компании прекрасно адаптированы к российским погодным условиям и прекрасно справляются с нашими дорогами.

Современный модельный ряд бренда представляют надежные, стильные и практичные автомобили, которые подойдут для каждого повода.

В списке доступных моделей:

  • Granta;
  • Vesta;
  • Niva Travel;
  • Niva Legend;
  • Largus;
  • X-Ray.

Модели выполняются в нескольких вариантах кузова, а также предоставляют большой выбор комплектаций на любой вкус. Среди автомобилей компании каждый автолюбитель сможет найти решение своих повседневных задач.

Гранта станет верным спутником в городе и за его пределами. Этот легкий и практичный автомобиль может быть седаном, хэтчбеком, лифтбеком или универсалом, — все зависит от предпочтений покупателя.

Веста — еще один универсальный представитель марки, который отличается универсальным характером. Модель предлагает большое разнообразие конфигураций кузова, а также окружает своих владельцев современными технологиями комфорта и безопасности.

Niva Travel — практичный компактный кроссовер, который уверенно чувствует себя в городе, но раскрывается полностью за его пределами. Просторный салон, вместительное багажное отделение, рейлинги, — у нее есть все, чтобы провести незабываемый отдых на природе.

Niva Legend считает своей стихией пересеченную местность. Трехдверный вариант подходит для активного исследования окружающего мира, поездок на охоту, рыбалку или трофи. Пятидверная модель может быть семейным автомобилем, который в нужное время станет надежным внедорожником.

Largus — закаленный универсал, готовый к любой роли. Конструкторы предусмотрели несколько вариантов конструкции кузова, в числе которых есть фургон. Эта модель как никто другой подходит для решения самых сложных задач по перевозке в городе.

Икс Рей — стильный кроссовер с активным духом. Он уверенно маневрирует в городском потоке, стремительно совершает обгоны и опережения на трассе, прекрасно ориентируется в ограниченном пространстве.

Чтобы купить один из современных российских автомобилей, обратитесь в центр официального дилера ГК «Автомир». Наш автосалон осуществляет продажу и обслуживание моделей бренда в Брянске. Чтобы узнать больше подробностей о выгодных предложениях центра, обратитесь в наш отдел продаж.

Новинки Лада 2018 года | Все автомобили Lada вышедшие в этом году

В последние годы концерн АвтоВАЗ переживает второе рождение. В модельном ряду появилось множество новинок, которые действительно нравятся россиянам и занимают лидирующие позиции по продажам. Но самое главное, – произошли серьезные качественные изменения – автомобили LADA стали более современными как внутри, так и снаружи. На них комфортно, безопасно и не стыдно ездить!

Еще одним изменением стала практика регулярных обновлений, которую исповедуют ведущие автопроизводители. Если раньше отдельные модели АвтоВАЗ десятилетиями выпускались без всяких изменений, то теперь почти каждый год компания предлагает если не глубокую модернизацию, то, как минимум, рестайлинг.

В 2018 году центральным событием стал Московский автосалон, где были представлены последние новинки LADA.

Всего их оказалось целых пять!

Новые модели LADA 2018 года

  • Новая «Нива». Главный фурор произвел концепт-кар LADA 4x4 Vision, производство которого намечено на 2022 год. Несмотря на свое название, он абсолютно не похож на свой классический оригинал, внешний вид которого не менялся с 70-х. Внедорожная LADA в новом кузове напоминает скорее Renault Duster, однако «вазовский» стиль последних лет также присутствует в виде «Икс-образных» выштамповок.
  • Обновленная Granta. Одна из наиболее ожидаемых новинок. Самую доступную машину в модельном ряду АвтоВАЗ наметили к покупке многие россияне и с волнением ждали цен. И не разочаровались – стоимость авто почти не изменилась (всего на 10 тысяч дороже). При этом были улучшены его ходовые качества и внешний вид. Новая LADA Ganta будет доступна в пяти версиях – седан, хэтчбек, лифтбек и универсал (обычный и Cross).
  • Спортивная Vesta. Новая LADA Vesta Sport унаследовала внешний вид представленного ранее концепт-кара Vesta Sport Concept. Ее внешний вид стал более агрессивным – появились спортивные накладки переднего бампера, 17-дюймовые литые диски с низкопрофильными шинами и расширенные колесные арки на передних крыльях.
  • Внедорожная Vesta. Еще одна модификация Vesta, но уже с прицелом на проходимость. 17-дюймовые колеса и увеличившийся до 203 мм клиренс позволяют новой LADA Vesta Cross уверенно себя чувствовать в условиях бездорожья. Модель оснащается системой контроля устойчивости ECS и полным комплектом фронтальных подушек безопасности.
  • Обновленный Xray. В 2018 новая LADA Xray Cross стала еще более «внедорожной», если можно так сказать. Ее клиренс увеличился до 215 мм, а подвеска обзавелась новыми передними рычагами, пружинами и амортизаторами. Также появились предустановки режимов движения для различных условий и дорожных покрытий. Из внешних изменений отметим 17-дюймовые колеса, новый передний бампер защитный пластиковый «пояс».

Уточнить цены и комплектации LADA 2018 года всех моделей вы сможете на сайте компании ФОРСАЖ, официального дилера АвтоВАЗ в Санкт-Петербурге.

Архивные модели LADA | официальный сайт Лада-Центр в Санкт-Петербурге

Архивные модели LADA | официальный сайт Лада-Центр в Санкт-Петербурге

Отправляя сообщение, я соглашаюсь с политикой обработки персональных данных, выражаю свое согласие и разрешаю АО «АВТОВАЗ», а также, по их поручению, третьим лицам осуществлять обработку моих персональных данных (фамилия, имя, отчество, год, месяц, дата и место рождения; адрес, номер паспорта и сведения о дате выдачи паспорта и выдавшем его органе; образование, профессия, место работы и должность; домашний, рабочий и мобильный телефоны; адрес электронной почты и другие данные, требуемые для отправки сообщения), включая сбор, систематизацию, накопление, хранение, уточнение, использование, распространение (в том числе трансграничную передачу), обезличивание, уничтожение персональных данных), в целях связанных с возможностью предоставления информации о товарах и услугах, которые потенциально могут представлять интерес, а также в целях сбора и обработки статистической информации и проведения маркетинговых исследований. Согласие на обработку персональных данных в соответствии с указанными выше условиями я предоставляю на 10 (десять) лет. Я уведомлен и согласен с тем, что указанное согласие может быть мной отозвано посредством направления письменного заявления заказным почтовым отправлением с описью вложения, либо вручено лично под подпись.

Отправляя сообщение, я соглашаюсь с политикой обработки персональных данных, выражаю свое согласие и разрешаю АО «АВТОВАЗ», а также, по их поручению, третьим лицам осуществлять обработку моих персональных данных (фамилия, имя, отчество, год, месяц, дата и место рождения; адрес, номер паспорта и сведения о дате выдачи паспорта и выдавшем его органе; образование, профессия, место работы и должность; домашний, рабочий и мобильный телефоны; адрес электронной почты и другие данные, требуемые для отправки сообщения), включая сбор, систематизацию, накопление, хранение, уточнение, использование, распространение (в том числе трансграничную передачу), обезличивание, уничтожение персональных данных), в целях связанных с возможностью предоставления информации о товарах и услугах, которые потенциально могут представлять интерес, а также в целях сбора и обработки статистической информации и проведения маркетинговых исследований. Согласие на обработку персональных данных в соответствии с указанными выше условиями я предоставляю на 10 (десять) лет. Я уведомлен и согласен с тем, что указанное согласие может быть мной отозвано посредством направления письменного заявления заказным почтовым отправлением с описью вложения, либо вручено лично под подпись.

Отправляя сообщение, я соглашаюсь с политикой обработки персональных данных, выражаю свое согласие и разрешаю АО «АВТОВАЗ», а также, по их поручению, третьим лицам осуществлять обработку моих персональных данных (фамилия, имя, отчество, год, месяц, дата и место рождения; адрес, номер паспорта и сведения о дате выдачи паспорта и выдавшем его органе; образование, профессия, место работы и должность; домашний, рабочий и мобильный телефоны; адрес электронной почты и другие данные, требуемые для отправки сообщения), включая сбор, систематизацию, накопление, хранение, уточнение, использование, распространение (в том числе трансграничную передачу), обезличивание, уничтожение персональных данных), в целях связанных с возможностью предоставления информации о товарах и услугах, которые потенциально могут представлять интерес, а также в целях сбора и обработки статистической информации и проведения маркетинговых исследований. Согласие на обработку персональных данных в соответствии с указанными выше условиями я предоставляю на 10 (десять) лет. Я уведомлен и согласен с тем, что указанное согласие может быть мной отозвано посредством направления письменного заявления заказным почтовым отправлением с описью вложения, либо вручено лично под подпись.

Тест-драйв всех моделей ЛАДА у официального дилера Автовек в Екатеринбурге

Тест-драйв Лада в автосалоне Автовек

Новые модели автомобилей завода АВТОВАЗ кардинально отличаются от продукции, которая выпускалась предприятием ранее. Дилерский центр Автовек предлагает провести тестовую поездку на машинах LADA, позволяющую оценить управляемость, комфорт за рулем, динамические возможности техники. Запись на тест-драйв Лада осуществляется по телефону автосалона +7 (343) 253 00 53 или через форму обратной связи на официальном сайте. Пробный заезд проводится в удобное для покупателя время с учетом графика работы автосалона и требований безопасности.

Перед посещением дилерского центра следует выбрать несколько моделей, установить приоритетные цели пробной поездки, что позволит определить сильные и слабые стороны машины. Если планируется эксплуатация техники на дорогах общего пользования, то подойдут модели Vesta или Granta. Модификации Cross или модель XRAY с увеличенным клиренсом справятся с грунтовыми дорогами с небольшой колеей. А для среднего бездорожья завод предлагает машины Niva Travel и Legend с системой полного привода и 2-скоростным раздаточным редуктором в трансмиссии.

Для детального ознакомления предлагается эксклюзивный длительный тест от салона Автовек, клиент может получить автомобиль на сутки или более. Предложение действует для покупателей, твердо решивших приобрести машину марки Лада, условия оговариваются с менеджером отдела продаж. В ходе расширенного тест-драйва покупатель оценивает вместимость багажного отделения либо удобство посадки за рулем при поездках на большие расстояния.

Правила проведения тест-драйва автомобилей Лада

При совершении тестовой поездки необходимо соблюдать правила дорожного движения, действующие на территории России. Клиент может управлять автомобилем с тем типом коробки передач, который указан в водительском удостоверении. Если в документах отсутствует подобная информация, то возможен тест-драйв на машине с любым видом трансмиссии. Клиент самостоятельно определяет модель, тип кузова автомобиля Лада для пробной поездки. В автосалоне Автовек доступны машины с кузовами седан, универсал и лифтбэк.

Как проходит тест-драйв Лада в автосалоне Автовек

При проведении тест-драйва оценивают:

  1. Эластичность двигателя в разных режимах движения. Проверку производят при разгоне с места, при ускорении со скорости 80 км/ч на разных передачах.
  2. Мощность мотора, от которой зависит интенсивность разгона.
  3. Динамику торможения, способность тормозов останавливать автомобиль на разных типах покрытия. Проверку проводят на пустынном участке дороги, предварительно убедившись в отсутствии попутного транспорта.
  4. Настройки ходовой части, влияющие на уровень комфорта и управляемость машины. Необходимо оценить поведение техники при преодолении неровностей на дороге.
  5. Габариты и маневренность автомобиля, в ходе поездки следует припарковаться в разрешенной зоне. Оценивается чувствительность управления, усилие для поворота рулевого колеса, работа электронных ассистентов.
  6. Вместимость салона, клиент может пересесть на задний ряд сидений и определить запас пространства для ног.

Предлагаемый салоном маршрут имеет протяженность 5 км, проходит по дорогам с твердым покрытием и небольшому участку укатанной грунтовки. Управлять автомобилем может человек, имеющий действующие права категории В, стаж или опыт вождения не учитываются. Испытать динамику, проверить шумоизоляцию салона автомобилей Лада можно в светлое время суток (с 9:00 до 18:00 зимой и с 9:00 до 20:00 летом). При выезде с территории автосалона и на первой половине маршрута за рулем находится менеджер, затем машину испытывает потенциальный покупатель.

одна платформа на всех — Авторевю

Сегодня Группа Renault представила свою очередную стратегию работы под названием Renaulution (то есть «революция Renault»). Казалось бы, прежний план был принят меньше года назад, но в июле 2020-го у компании сменился руководитель: в должность вступил Лука де Мео, перешедший из компании Seat. А как известно, новая метла по-новому метет.

В стратегии Renaulution много интересных моментов, но для нас наиболее любопытны планы, которые касаются АВТОВАЗа и бренда Лада (они входят в Группу Renault). И здесь точно намечается маленькая революция: в иерархии концерна Лада будет объединена с румынской маркой Dacia. Идеологически они близки и сейчас (оба бренда выпускают простые и недорогие автомобили), а впереди у них полная техническая унификация.

Сейчас Лада и Dacia используют четыре платформы на двоих. Все Дачии построены на тележке B0 (и ее производных), а у Лады также есть платформы Гранты, Весты и Нивы. При этом на Ладу приходится лишь четверть совокупного объема выпуска этих двух брендов. Впереди — оптимизация. По плану, к 2025 году обе марки полностью перейдут на модульную платформу CMF-B, которая уже использована для новых моделей Dacia Logan/Sandero. Общее количество моделей и типов кузова будет сокращено с 18 до 11, а совокупный объем производства превысит один миллион машин в год.

Что это значит для АВТОВАЗа? Через четыре года в Лету канут не только устаревшие Гранта и две Нивы, но и в целом удачная Веста. А собственный инжиниринг будет сводиться лишь к созданию новых «надстроек» для платформы CMF-B и адаптации машин для российских условий эксплуатации. Кстати, в плане Группы Renault марка Лада характеризуется как Rough & Tough («суровая и крепкая»).

Согласно плану Renaulution, в 2021 и 2022 годах АВТОВАЗ не представит ни одной полностью новой модели. Ближайшие премьеры назначены на 2023 год — это две модели B-сегмента (видимо, новая Гранта в двух вариантах). Еще одна B-машина запланирована на 2024 год: официально подтверждено, что это новая Нива, плюс показан новый рендер, который заметно отличается от концепт-кара трехлетней давности. А в 2025-м должна появиться Лада класса C — кроссовер. Напомним, все они будут созданы на единой реношной платформе.

Что касается марки Dacia, то в этом году на рынок выйдет серийный электромобиль Spring, по одной модели B-класса запланировано на 2022 и 2024 годы. А в 2025-м должна выйти первая Dacia класса C — тоже кроссовер. Общая цель союза Лада-Dacia — увеличение прибыли с трех до пяти миллиардов евро к 2025 году.

Статистика АЕБ | Топ-25 моделей

Модель Январь – май%Май%
2021202020212020
1Лада Гранта57 07538 444 48%12 8295 726 124%
2Лада Веста45 09934 173 32%10 0504 475 125%
3Kia Rio38 31628 291 35%6 6823 655 83%
4Hyundai Creta31 48523 137 36%5 7173 243 76%
5Hyundai Solaris26 33514 633 80%6 2321 924 224%
6Лада Нива24 70915 207 62%6 1692 747 125%
7Volkswagen Polo22 44716 350 37%5 1022 158 136%
8Skoda Rapid18 387227 8000%4 469227 1869%
9Лада Ларгус пасс.17 07112 151 40%4 8641 981 146%
10Toyota RAV 416 44113 422 22%2 2521 226 84%
11Volkswagen Tiguan15 37511 296 36%3 1231 199 160%
12Renault Duster14 8409 529 56%3 7841 470 157%
13Renault Logan14 2789 962 43%2 9051 396 108%
14Kia Sportage12 4518 768 42%2 084745 180%
15Kia K511 933-3 090-
16Toyota Camry11 6229 282 25%3 3631 103 205%
17Renault Sandero11 4978 461 36%2 2571 256 80%
18Лада ИксРэй11 1846 879 63%2 6361 094 141%
19Skoda Kodiaq9 3957 231 30%1 785678 163%
20Skoda Karoq8 9213 236 176%2 205579 281%
21Mazda CX-58 3926 868 22%--
22Renault Kaptur8 3906 733 25%1 785815 119%
23Nissan Qashqai8 1598 698 -6%1 532792 93%
24Kia Seltos7 5132 595 190%1 733809 114%
25Renault Arkana7 4655 627 33%1 678666 152%
Многоцветная модель FRET

Ensemble обеспечивает штрих-кодирование на экстремальных уровнях FRET

  • 1.

    Нолан, Дж. П. и Склар, La Технология подвесных массивов: эволюция парадигмы плоских массивов. Trends Biotechnol. 20 , 9–12 (2002).

    CAS Статья Google Scholar

  • 2.

    Уилсон, Р., Коссинс, А. Р. и Спиллер, Д. Г. Кодированные микроносители для высокопроизводительного мультиплексного обнаружения. Angew.Chem. Int. Эд. 45 , 6104–6117 (2006).

    CAS Статья Google Scholar

  • 3.

    Фултон, Р. Дж., МакДейд, Р. Л., Смит, П. Л., Кинкер, Л. Дж. И Кеттман, Дж. Р. Расширенный мультиплексный анализ с помощью системы FlowMetrix. Clin. Chem. 43 , 1749–1756 (1997).

    CAS Google Scholar

  • 4.

    Wu, W. et al. Анализ массива антител с обнаружением на основе меток и разрешением размера белка. Мол. Клетка. Протеомика 8 , 245–257 (2009).

    CAS Статья Google Scholar

  • 5.

    Ван, Л. и Тан, У. Многоцветные наночастицы диоксида кремния FRET путем возбуждения на одной длине волны. Нано. Lett. 6 , 84–88 (2006).

    CAS Статья Google Scholar

  • 6.

    Вайдья, С. В., Кузис, А. и Мальдарелли, К.Уменьшение агрегации и передачи энергии квантовых точек, включенных в шарики полистирола, за счет кинетического захвата из-за сшивки во время полимеризации. Langmuir 31 , 3167–3179 (2015).

    CAS Статья Google Scholar

  • 7.

    Клапп, А. Р., Мединц, И. Л., Маттусси, Х. Фёрстер, исследования резонансного переноса энергии с использованием флуорофоров с квантовыми точками. ChemPhysChem 7 , 47–57 (2006).

    CAS Статья Google Scholar

  • 8.

    Wagh, A. et al. Полимерные наночастицы с последовательным и множественным каскадным механизмом FRET для многоцветной и мультиплексной визуализации. Малый 9 , 2129–2139 (2013).

    CAS Статья Google Scholar

  • 9.

    Stuchlý, J. et al. Автоматический анализ протеомных данных на основе очень сложной проточной цитометрии. Cytom. А 81 , 120–129 (2012).

    Артикул Google Scholar

  • 10.

    Хан, М., Гао, X., Су, Дж. З. и Ни, С. Микрогранулы с квантовыми точками для мультиплексированного оптического кодирования биомолекул. Nat. Biotechnol. 19 , 631–635 (2001).

    CAS Статья Google Scholar

  • 11.

    Wang, G. et al. Высокоэффективная подготовка многомасштабных штрих-кодов с квантовыми точками для множественного обнаружения гепатита B. АСУ Нано 7 , 471–481 (2013).

    CAS Статья Google Scholar

  • 12.

    Фергюсон, Дж. А., Стимерс, Ф. Дж. И Уолт, Д. Р. Волоконно-оптический массив случайных микросфер ДНК высокой плотности. Анал. Chem. 72 , 5618–5624 (2000).

    CAS Статья Google Scholar

  • 13.

    Förster, T. Experimentelle und Theoretische Untersuchung des zwischengmolekularen übergangs von Elektronenanregungsenergie. Naturforsch. А Astrophys. Phys. Phys. Chem. 4a , 321–327 (1949).

    Google Scholar

  • 14.

    Вольбер П. и Хадсон Б. Аналитическое решение проблемы переноса энергии Ферстера в двух измерениях. Biophys. J. 28 , 197–210 (1979).

    CAS Статья Google Scholar

  • 15.

    Ватроб, Х. М., Пан, К. П.И Баркли, М. Д. Двухэтапный FRET как структурный инструмент. J. Am. Chem. Soc. 125 , 7336–7343 (2003).

    CAS Статья Google Scholar

  • 16.

    Фабиан, А., Хорват, Г., Вамози, Г., Вереб, Г. и Соллози, Дж. Измерения TripleFRET в проточной цитометрии. Cytom. А 83 , 375–385 (2013).

    Артикул Google Scholar

  • 17.

    Stein, I.H., Steinhauer, C. & Tinnefeld, P. Одномолекулярный четырехцветный FRET визуализирует пути передачи энергии на ДНК-оригами. J. Am. Chem. Soc. 133 , 4193–4195 (2011).

    CAS Статья Google Scholar

  • 18.

    Lee, J. et al. Одномолекулярный четырехцветный FRET. Angew. Chem. Int. Эд. 49 , 9922–9925 (2010).

    CAS Статья Google Scholar

  • 19.

    Uphoff, S. et al. Мониторинг нескольких расстояний в пределах одной молекулы с помощью переключаемого FRET. Nat. Методы 7 , 831–836 (2010).

    CAS Статья Google Scholar

  • 20.

    Bunt, G. & Wouters, F. S. FRET от одиночных до мультиплексированных сигнальных событий. Biophys. Ред. 9 , 119–129 (2017).

    Артикул Google Scholar

  • 21.

    Бакхаут-Уайт, С. и др. Сборка программируемых фотонных сетей на основе FRET с использованием дизайнерских каркасов ДНК. Nat. Commun. 5 , 5615–5630 (2014).

    CAS Статья Google Scholar

  • 22.

    Spillmann, C. M. et al. Расширение каскадов FRET на линейных фотонных проводах ДНК. Chem. Commun. 50 , 7246–7249 (2014).

    CAS Статья Google Scholar

  • 23.

    Райку, В. Эффективность резонансного переноса энергии в гомоолигомерных комплексах белков. J. Biol. Phys. 33 , 109–127 (2007).

    CAS Статья Google Scholar

  • 24.

    Лю, Дж. И Лу, Ю. Исследование FRET меченного трифторофором ДНКзима. J. Am. Chem. Soc. 124 , 15208–15216 (2002).

    CAS Статья Google Scholar

  • 25.

    Шапиро, Х. М. Практическая проточная цитометрия (Wiley, Hoboken, NJ, 2003).

    Книга Google Scholar

  • 26.

    Матюс Л. Измерения резонансного переноса энергии флуоресценции на поверхности клеток. Спектроскопический инструмент для определения взаимодействия белков. J. Photochem. Photobiol. 12 , 323–337 (1992).

    Артикул Google Scholar

  • 27.

    Berney, C. & Danuser, G. FRET или без FRET: количественное сравнение. Biophys. J. 84 , 3992–4010 (2003).

    CAS Статья Google Scholar

  • 28.

    Корри Б., Джаятилака Д. и Ригби П. Гибкий подход к расчету эффективности резонансной передачи энергии между несколькими донорами и акцепторами в сложной геометрии. Biophys. J. 89 , 3822–3836 (2005).

    CAS Статья Google Scholar

  • 29.

    Коппель Д. Э., Флеминг П. Дж. И Стритматтер П. Внутримембранные положения мембраносвязанных хромофоров, определяемые переносом энергии возбуждения. Биохимия 18 , 5450–5457 (1979).

    CAS Статья Google Scholar

  • 30.

    Nguyen, H.Q. et al. Программируемый микрофлюидный синтез более тысячи однозначно идентифицируемых спектральных кодов. Adv. Опт. Матер. 5 , 1600548 (2016).

    Артикул Google Scholar

  • 31.

    Lee, J. et al. Универсальная инертная к процессам архитектура кодирования полимерных микрочастиц. Nat. Матер. 13 , 524–529 (2014).

    CAS Статья Google Scholar

  • 32.

    Филдинг, А. Х. Кластеры и методы классификации для биологических наук Vol.53 (Cambridge Univ. Press, Кембридж, 2007).

  • 33.

    King, L.E. et al. Критические реагенты для анализа связывания лигандов и их стабильность: рекомендации и передовой опыт группы согласования Глобального консорциума по биоанализу. AAPS J. 16 , 504–515 (2014).

    CAS Статья Google Scholar

  • 34.

    Uhlen, M. et al. Предложение по валидации антител. Nat. Методы 13 , 823–827 (2016).

    CAS Статья Google Scholar

  • 35.

    Pla-Roca, M. et al. Микроматрица колокализации антител: масштабируемая технология для мультиплексного анализа белков в сложных образцах. Мол. Клетка. Протеомика 11, https://doi.org/10.1074/mcp.M111.011460 (2012).

    Артикул Google Scholar

  • 36.

    Юнкер, Д., Бержерон, С., Лафорте, В. и Ли, Х.Перекрестная реактивность в микрочипах антител и мультиплексных сэндвич-анализах: проливает свет на темную сторону мультиплексирования. Curr. Opin. Chem. Биол. 18 , 29–37 (2014).

    CAS Статья Google Scholar

  • 37.

    Schweitzer, B. et al. Мультиплексное профилирование белков на микрочипах путем амплификации по типу катящегося круга. Nat. Biotechnol. 20 , 359–365 (2002).

    CAS Статья Google Scholar

  • 38.

    Gonzalez, R.M. et al. Разработка и проверка сэндвич-микрочипов ELISA с минимальным вмешательством в анализ. J. Proteome Res. 7 , 2406–2414 (2008).

    CAS Статья Google Scholar

  • 39.

    Hardin, B.E. et al. Повышенный светосбор в сенсибилизированных красителем солнечных элементах с красителями для реле энергии. Nat. Фотон. 3 , 406–411 (2009).

    CAS Статья Google Scholar

  • 40.

    Лакович, Дж. Р. Принципы флуоресцентной спектроскопии (Спрингер, Нью-Йорк, Нью-Йорк, 2006).

    Книга Google Scholar

  • 41.

    Förster, T. in Modern Quantum Chemistry Part III: Action of Light and Organic Crystals (ed. Sinanglu, O.) 93–137 (Academic, New York, NY, 1965) ..

  • 42.

    Демпстер А., Лэрд Н. и Дональд Р. Максимальная вероятность получения неполных данных с помощью алгоритма EM. J. R. Statist. Soc. Сер. В 39 , 1–38 (1977).

    Google Scholar

  • Произошла ошибка при настройке пользовательского файла cookie

    Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности. Если ваш браузер не принимает файлы cookie, вы не можете просматривать этот сайт.


    Настройка вашего браузера для приема файлов cookie

    Существует множество причин, по которым cookie не может быть установлен правильно.Ниже приведены наиболее частые причины:

    • В вашем браузере отключены файлы cookie. Вам необходимо сбросить настройки вашего браузера, чтобы он принимал файлы cookie, или чтобы спросить вас, хотите ли вы принимать файлы cookie.
    • Ваш браузер спрашивает вас, хотите ли вы принимать файлы cookie, и вы отказались. Чтобы принять файлы cookie с этого сайта, нажмите кнопку «Назад» и примите файлы cookie.
    • Ваш браузер не поддерживает файлы cookie. Если вы подозреваете это, попробуйте другой браузер.
    • Дата на вашем компьютере в прошлом.Если часы вашего компьютера показывают дату до 1 января 1970 г., браузер автоматически забудет файл cookie. Чтобы исправить это, установите правильное время и дату на своем компьютере.
    • Вы установили приложение, которое отслеживает или блокирует установку файлов cookie. Вы должны отключить приложение при входе в систему или проконсультироваться с системным администратором.

    Почему этому сайту требуются файлы cookie?

    Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности, запоминая, что вы вошли в систему, когда переходите со страницы на страницу.Чтобы предоставить доступ без файлов cookie потребует, чтобы сайт создавал новый сеанс для каждой посещаемой страницы, что замедляет работу системы до неприемлемого уровня.


    Что сохраняется в файле cookie?

    Этот сайт не хранит ничего, кроме автоматически сгенерированного идентификатора сеанса в cookie; никакая другая информация не фиксируется.

    Как правило, в файлах cookie может храниться только информация, которую вы предоставляете, или выбор, который вы делаете при посещении веб-сайта.Например, сайт не может определить ваше имя электронной почты, пока вы не введете его. Разрешение веб-сайту создавать файлы cookie не дает этому или любому другому сайту доступа к остальной части вашего компьютера, и только сайт, который создал файл cookie, может его прочитать.

    Произошла ошибка при настройке пользовательского файла cookie

    Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности. Если ваш браузер не принимает файлы cookie, вы не можете просматривать этот сайт.


    Настройка вашего браузера для приема файлов cookie

    Существует множество причин, по которым cookie не может быть установлен правильно.Ниже приведены наиболее частые причины:

    • В вашем браузере отключены файлы cookie. Вам необходимо сбросить настройки вашего браузера, чтобы он принимал файлы cookie, или чтобы спросить вас, хотите ли вы принимать файлы cookie.
    • Ваш браузер спрашивает вас, хотите ли вы принимать файлы cookie, и вы отказались. Чтобы принять файлы cookie с этого сайта, нажмите кнопку «Назад» и примите файлы cookie.
    • Ваш браузер не поддерживает файлы cookie. Если вы подозреваете это, попробуйте другой браузер.
    • Дата на вашем компьютере в прошлом.Если часы вашего компьютера показывают дату до 1 января 1970 г., браузер автоматически забудет файл cookie. Чтобы исправить это, установите правильное время и дату на своем компьютере.
    • Вы установили приложение, которое отслеживает или блокирует установку файлов cookie. Вы должны отключить приложение при входе в систему или проконсультироваться с системным администратором.

    Почему этому сайту требуются файлы cookie?

    Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности, запоминая, что вы вошли в систему, когда переходите со страницы на страницу.Чтобы предоставить доступ без файлов cookie потребует, чтобы сайт создавал новый сеанс для каждой посещаемой страницы, что замедляет работу системы до неприемлемого уровня.


    Что сохраняется в файле cookie?

    Этот сайт не хранит ничего, кроме автоматически сгенерированного идентификатора сеанса в cookie; никакая другая информация не фиксируется.

    Как правило, в файлах cookie может храниться только информация, которую вы предоставляете, или выбор, который вы делаете при посещении веб-сайта.Например, сайт не может определить ваше имя электронной почты, пока вы не введете его. Разрешение веб-сайту создавать файлы cookie не дает этому или любому другому сайту доступа к остальной части вашего компьютера, и только сайт, который создал файл cookie, может его прочитать.

    DeepFRET, программное обеспечение для быстрой и автоматической классификации данных FRET одиночных молекул с использованием глубокого обучения

    Существенных изменений:

    1) Неясно, как предварительное обучение модели может учитывать бесконечное количество возможных состояний FRET / времени жизни / занятости / путей перехода / шума и т. Д.Как это может не смещать результаты, чтобы искать трассы, которые имеют отношение сигнал / шум и т. Д. К обучающим данным? Например, максимальная вероятность перехода между состояниями в наборе обучающих данных 0,2 может привести к смещению анализа в сторону долгоживущих состояний FRET. Авторы должны это прокомментировать.

    Это действительно очень верный комментарий, который является центральным для процесса, поскольку существует бесконечное количество возможных перестановок данных FRET, а неправильное обучение модели может привести к смещенному выбору трасс.Мы благодарим рецензентов за предоставленные нам дополнительные комментарии по этому поводу, поскольку это могло быть неясно в рукописи.

    Чтобы внести как можно меньшее смещение в сторону конкретных состояний FRET, мы стремились сгенерировать репрезентативную часть всей выборки пространства smFRET, равномерно большого количества бесконечных возможных перестановок данных ( состояний FRET / времени жизни / занятости / путей перехода / шума ) . Чтобы проверить это и дополнительно охарактеризовать данные обучения, мы предприняли ряд осторожных шагов, которые описаны ниже:

    a) Состояния и занятость FRET .Количество состояний FRET в данной трассе выбиралось равномерно от 1 до 4 состояний. Каждому состоянию случайным образом присваивалось значение FRET путем равномерной выборки от 0 до 1. Для трасс с более чем одним состоянием требовалось минимальное расстояние 0,1 FRET между состояниями (т. Е. Случайная единообразная выборка повторялась до тех пор, пока требование не было выполнено). способен отличать реальные переходы от шумовых колебаний. Мы проверили, что все состояния FRET, а также занятость 150 тыс. Трасс в обучающих данных были равномерно распределены между 0 и 1, как показано на рисунке 1 - приложение к рисунку 3A.Мы поняли, что это могло быть неясно в исходной заявке, поэтому мы подробно описали это в подразделе «Материалы и методы» «Генерация синтетических данных smFRET» в новой версии. Кроме того, мы исправили легенду рисунка 1 - добавление к рисунку 3A: «Трассы smFRET были сгенерированы с 1–4 случайно определенными состояниями FRET […]», поскольку из-за ошибки формулировки в нем говорилось, что трассы были сгенерированы с 1, 2 или 3 говорится в исходном сообщении.

    б) Вероятность перехода и время жизни. Мы благодарим рецензентов за то, что они заметили ошибку формулировки в исходном материале «с вероятностью перехода ниже 0 и 0,2». Вероятность перехода для каждого кадра трассы из заданного состояния в другое равномерно дискретизируется между 0 и 0,2. Вероятности перехода соответствуют между состояниями, так что в системе с 4 состояниями с максимально допустимыми вероятностями перехода 0,2, объединенная вероятность перехода в любом заданном кадре составляет 0,2 * (4-1 состояния) = 0.6. С другой стороны, в системе с двумя состояниями с вероятностями перехода между состояниями 0,01, объединенная вероятность перехода в любом заданном кадре составляет 0,01 * (2–1 состояния) = 0,01. Таким образом, средний срок службы вышеупомянутых систем составляет 1 / 0,6 = 1,7 кадра и 1 / 0,01 = 100 кадров соответственно. Распределение времени жизни всех обучающих данных представляет собой равномерно взвешенное среднее по экспоненциальным затуханиям для каждого возможного количества состояний FRET и вероятностей перехода, как показано на рисунке 1 - приложение к рисунку 3B.Моделирование методом Монте-Карло на 10 000 трассировок с вероятностями перехода сэмплирования равномерно между 0 и 0,2 на 2–4 трассах состояний подтверждает, что наши обучающие данные соответствуют базовой модели (рисунок 1 - приложение к рисунку 3B). Следовательно, мы выбираем широкий диапазон вероятностей переходов, равномерно охватывающий как долгоживущие, так и короткоживущие состояния FRET, стремясь походить на большинство экспериментальных данных без внесения смещения в сторону конкретных времен жизни. Признавая, что это могло быть неясно в рукописи, мы добавили новый рисунок 1 - дополнение к рисунку 3B с распределениями времени жизни и моделированием Монте-Карло вместе с кратким описанием того, как они были получены в подразделе «Материалы и методы» «Синтетический smFRET». генерация данных ».

    c) Путь перехода следует цепи Маркова, которая генерируется случайным образом из матрицы перехода с вероятностями, выбранными, как описано выше. Марковская цепь каждой моделируемой трассы генерируется с использованием реализации скрытой марковской модели пакета Python с открытым исходным кодом под названием pomegranate. Чтобы убедиться, что обучающие данные представляют собой подмножество всех возможных путей перехода единообразно, мы построили график плотности переходов для n = 10 000 смоделированных трасс. Это убедительно иллюстрирует полностью случайный и однородный путь перехода, как и ожидалось.Признавая, что эта критически важная информация не была реализована в первоначальном представлении, мы добавили график как новый рисунок 1 - рисунок в приложении 3C, и внесли дополнительные пояснения в подраздел «Материалы и методы» «Генерация синтетических данных smFRET».

    г) Уровень шума. Экспериментальные данные могут включать широкий диапазон уровней шума в зависимости от биологической системы, оборудования, экспериментальной установки и т. Д. Чтобы охватить широкий диапазон возможных уровней шума, мы предприняли следующие шаги: Во-первых, были сгенерированы интенсивности доноров и акцепторов для каждой трассы. из основных истинных значений FRET.Затем к интенсивности был добавлен шум путем выборки из нормального распределения со значениями σ, равномерно распределенными между 0,01 и 0,30. Для имитации дробового шума поверх был добавлен дополнительный слой гамма-шума с вероятностью 0,8. Чтобы обосновать выбранный диапазон значений σ, мы построили моделируемые распределения FRET для различных уровней шума, как показано на рисунке 1 - приложение к рисунку 4. Широкий диапазон уровней шума, который мы выбираем в обучающих данных, напоминает большинство экспериментальных данных, не внося смещения в сторону конкретное SNR из-за единообразной выборки, поддерживающей наши обучающие данные, и, таким образом, модель не смещена в сторону конкретного SNR в заданном диапазоне значений σ.В пересмотренной версии как в подразделе «Производительность DeepFRET», так и в разделе «Обсуждение» мы разъяснили, что в режиме, в котором скорости перехода аналогичны временному разрешению визуализации, динамические трассы smFRET могут быть неправильно классифицированы моделью как зашумленные. Имитация трассировки и повторное обучение модели (или изменение настроек визуализации) решат эту проблему.

    Мы признаем, что, несмотря на наши строгие попытки внести как можно меньшую систематическую ошибку путем единообразной выборки всех параметров, специализированные пользователи могут иметь лучшее суждение и знание своих конкретных систем, уровней шума, времени жизни состояний или вероятностей перехода среди других параметров.При обучении модели может существовать некоторая систематическая ошибка, определяющая пределы интервалов для выбранных параметров. Таким образом, если опытный пользователь хочет адаптировать модель для лучшего удовлетворения своих конкретных потребностей, DeepFRET реализует удобный интерфейс моделирования трассировки, в котором новые трассы FRET могут быть легко смоделированы на основе определяемых пользователем параметров (см. Рисунок 1 - приложение к рисунку 6). и используется для переобучения модели DNN в соответствии с нашими инструкциями (https://github.com/hatzakislab/DeepFRETModel). Мы дополнительно подчеркнули это в новом абзаце в разделе «Обсуждение».

    2) Сравнение DeepFRET с человеческой точностью в выборе «чистых следов» не кажется подходящим сравнением (и, очевидно, быстрее). Ручной выбор трассировки, как правило, больше не является стандартным средством анализа данных smFRET с учетом свободно доступных автоматизированных альтернатив с открытым исходным кодом (например, HAMMY, ebFRET, SPARTAN и т. Д.). Сравнение с другими доступными программными пакетами важно, чтобы убедить пользователей в превосходной или, по крайней мере, эквивалентной производительности DeepFRET при автоматическом выборе трассировки.Авторы должны включить такое сравнение в исправленную версию рукописи.

    Мы хотим подчеркнуть, что основная цель этой рукописи - предоставить интуитивно понятную платформу, требующую минимального вмешательства человека, что, как отметили рецензенты, «[…] может снизить порог для экспертизы smFRET, позволяя большему количеству ученых воспользуйтесь преимуществами этого мощного инструмента », вместо того, чтобы доказывать неправоту существующих надежных программных пакетов, разработанных и эксплуатируемых экспертами в данной области.Мы также признаем, что ручной выбор трассировки не должен быть стандартным средством анализа данных smFRET, но, несмотря на широкий спектр доступных пакетов программного обеспечения для анализа данных smFRET, только некоторые из них реализуют расширенную автоматическую сортировку трасс. HAMMY и ebFRET как рецензенты предложили сосредоточиться на извлечении кинетической скорости и предложить простые пороговые значения, основанные на интенсивности и значениях FRET. Удаление следов за пределами этих простых пороговых значений часто требует дополнительного ручного выбора. iSMS предлагает более совершенную сортировку по интенсивности донора / акцептора, среднему FRET и средней стехиометрии для данных ALEX, а также автоматическое обнаружение фотообесцвечивания. SPARTAN предлагает более обширные реализации для автоматической сортировки (всего 26 параметров) и оптимизирован для данных, не относящихся к ALEX. Однако фактические пороговые критерии могут значительно различаться для каждой группы и экспериментальной системы (Fessl et al., 2018; Gouge et al., 2017; Schärfen and Schlierf, 2019; Tsuboyama et al., 2018; Yao et al., 2015). Специализированные группы хорошо обучены ориентироваться в этих множественных критериях и точно определять свои собственные, которые оптимизированы для работы с их конкретными системами (Aznauryan et al., 2016; Fessl et al., 2018; Gouge et al., 2017; Schärfen and Schlierf, 2019; Tsuboyama et al., 2018; Wu et al., 2018; Yao et al., 2015). Однако разнообразие этих критериев сортировки может внести ненужную систематическую ошибку в и без того сложную серию обработки данных, особенно с учетом того, что появление коммерческих инструментов быстро расширило сферу smFRET.

    Чтобы напрямую ответить на комментарии рецензентов, мы выполнили два типа экспериментальных проверок. Сначала мы сравнили DeepFRET напрямую с возможностями сортировки HAMMY, ebFRET, SPARTAN и iSMS на смоделированных данных, где достоверная информация известна. Затем мы сравнили SPARTAN и iSMS, у которых есть расширенные возможности сортировки, на наборах экспериментальных данных, опубликованных другими группами.

    В первом случае мы объединили 200 смоделированных наземных трассировок smFRET с 1800 смоделированными трассами nonmFRET (Рисунок 4 - дополнение к рисунку 3A и Материалы и методы для распределений FRET и описаний параметров, соответственно) и реконструированные файлы TIF, которые будут соответствовать в необработанные данные smFRET.Мы смоделировали как данные ALEX, так и данные, не относящиеся к ALEX, поскольку iSMS оптимизирован для данных ALEX, в то время как HAMMY, ebFRET и SPARTAN оптимально работают с данными, не относящимися к ALEX. Файлы tif были загружены в соответствующие программные пакеты и использованы для извлечения и сортировки трасс с применением показателя качества 0,80 в DeepFRET, параметров сортировки по умолчанию в SPARTAN (кроме порога фонового шума), пороговых значений интенсивности, стехиометрии и FRET в iSMS, пороговых значений интенсивности. в порогах HAMMY и FRET в ebFRET. Мы обнаружили, что DeepFRET, SPARTAN и iSMS восстанавливают базовое истинное распределение FRET до различных уровней детализации, в то время как простые значения интенсивности и пороговые значения FRET для HAMMY и ebFRET потребуют дальнейшей сортировки для получения оптимальных результатов.В частности, было обнаружено, что DeepFRET сортирует трассы, по крайней мере, так же или лучше, чем SPARTAN и iSMS, без какой-либо настройки параметров (рис. 4 - приложение к рисунку 3B). Мы настоятельно отмечаем, что опытные пользователи смогут точно настроить все возможные пороговые значения, чтобы лучше соответствовать достоверным данным. Однако в реальном эксперименте, где достоверная информация неизвестна, задача становится более сложной, и параметры точной настройки могут быть искажены, особенно для неспециализированных пользователей. Классификация на основе единого порога, предлагаемая DeepFRET, может иметь решающее значение для большего числа ученых, чтобы воспользоваться этим инструментом.

    Во втором случае мы сравнили производительность трех программных пакетов, предлагающих расширенную сортировку, на экспериментальных данных, опубликованных другими группами. Выбор наборов данных, отличных от ALEX и ALEX, опубликованных Kilic et al. (Kilic et al., 2018) и Hellenkamp et al. (Hellenkamp et al., 2018), соответственно, обеспечивает надлежащее тестирование в различных настройках FRET и наборах данных. Мы использовали практически настройки по умолчанию в обоих программах и обрезали данные до первых 10 кадров каждой кривой, минимизируя обесцвечивание без использования жесткого порога по умолчанию при FRET <0.2 в СПАРТАНСКОМ. Наш анализ показывает, что все три пакета программного обеспечения способны воспроизводить опубликованные распределения FRET из необработанных файлов tif с небольшими расхождениями (рисунок 4 - приложение к рисунку 4). DeepFRET демонстрирует производительность, эквивалентную или превосходящую существующие сложные программные пакеты, также на экспериментальных данных. Мы подчеркиваем, что существующие программные пакеты очень надежны, и опытные пользователи смогут перемещаться и оптимизировать все необходимые настройки для отдельных наборов данных.Сила DeepFRET заключается в его способности анализировать как данные ALEX, так и данные, не относящиеся к ALEX, воспроизводимым образом, требуя лишь минимального вмешательства человека и, следовательно, минимального опыта в установке пороговых значений, - , что позволяет большему количеству ученых воспользоваться преимуществами этого мощного инструмент. Признавая отсутствие сравнения с существующим программным обеспечением, мы добавили новый рисунок 4 - рисунки 3-4. Мы также переименовали подраздел «Производительность DeepFRET на реальных данных» в «Производительность DeepFRET на реальных данных, сравнение с существующим надежным программным обеспечением для анализа smFRET», а также добавили новый параграф в раздел, в котором подробно обсуждается сравнение на смоделированных реальных данных и опубликованные данные.

    3) Аналогичным образом, лучший способ доказать возможности анализа трассировки DeepFRET - это взять несколько наборов данных и сравнить результаты анализа HAMMY, ebFRET и т. Д. С DeepFRET. Авторы должны включить такой сравнительный анализ более чем одного набора данных в исправленную версию рукописи.

    Чтобы ответить на комментарий рецензентов, мы напрямую сравнили производительность DeepFRET с опубликованными результатами на двух экспериментальных наборах данных (ALEX и не-ALEX) в разных группах (рисунок 4 - приложение к рисунку 4 и ответ на комментарий 2).Мы обнаружили, что DeepFRET смог воспроизвести опубликованные распределения smFRET с использованием простого порога качества 0,80 без дополнительного вмешательства человека, и, более того, так же или лучше, чем существующее программное обеспечение (см. Также ответ на комментарий рецензента 2). Эти данные дополнительно подтверждают производительность и мощность DeepFRET по сравнению с другим существующим программным обеспечением, требующим определенных пользователем пороговых значений, что может потребовать специальных знаний от пользователей. Мы объяснили сравнение в основном тексте и добавили новый рисунок 4 - приложение к рисунку 4 в рукописи.

    4) Было бы полезно, если бы в разделе «Обсуждение» авторы могли обсудить ограничения инструмента. Обсуждение случаев, когда их инструмент может дать сбой, будет полезным для исследователей, которые хотят использовать свой инструмент или развить его. Например, в разделе «Материалы и методы» отмечается, что фотофизические эффекты, которые иногда наблюдаются в экспериментах с smFRET, могут быть проблематичными для метода (похоже, что инструмент, скорее всего, классифицирует их как бесполезные трассы, даже если они могут отражать «истинный» сигнал от эксперимента [e.грамм. наблюдение PIFE в работе от группы TJ Ha]).

    После комментария рецензентов мы добавили новый абзац в раздел «Обсуждение», в котором излагаются ограничения текущей версии DeepFRET и что можно сделать в будущем для ее улучшения. Как отмечалось в предыдущих разделах, DeepFRET точно работает как с смоделированными, так и с экспериментальными двухцветными данными smFRET в нескольких лабораториях. Ограничения, обсуждаемые в обновленной версии рукописи, могут быть устранены опытными пользователями путем моделирования новых обучающих данных и повторного обучения модели DNN в соответствии с нашими инструкциями (https: // github.com / hatzakislab / DeepFRET-Model), как описано в разделе Материалы и методы.

    Артикул:

    Азнаурян, М., Сондергаард, С., Ноер, С.Л., Шиотт, Б., Биркедал, В., 2016. Прямой взгляд на сложную многопутевую укладку теломерных G-квадруплексов. Nucleic Acids Res. 44, 11024–11032. DOI: 10.1093 / nar / gkw1010

    Фессл, Т., Уоткинс, Д., Оутли, П., Аллен, В.Дж., Кори, Р.А., Хорн, Дж., Болдуин, С.А., Рэдфорд, С.Е., Коллинсон, И., Тума, Р., 2018. Dynamic действие механизма Sec во время инициации, транслокации белка и терминации. eLife 7. doi: 10.7554 / eLife .35112

    Гуж, Дж., Гутерц, Н., Крамм, К., Дергай, О., Абаскаль-Паласиос, Г., Сатиа, К., Кузен, П., Эрнандес, Н., Громанн, Д., Ваннини, А., 2017. Молекулярные механизмы Bdp1 в сборке TFIIIB и инициации транскрипции РНК-полимеразы III. Nat. Commun. 8, 130.

    DOI: 10.1038 / s41467-017-00126-1

    Schärfen, L., Schlierf, M., 2019. Мониторинг в реальном времени вызванных белком конформационных изменений ДНК с использованием одномолекулярного FRET.Методы 169, 11–20.

    DOI: 10.1016 / j.ymeth.2019.02.011

    Цубояма, К., Тадакума, Х., Томари, Ю., 2018. Конформационная активация аргонавта посредством различных, но скоординированных действий систем шаперонов hsp70 и hsp90. Мол. Ячейка 70, 722-729.e4. DOI: 10.1016 / j.molcel.2018.04.010

    Ву, С., Лю, Дж., Ван, В., 2018. Анализ ферментного катализа, модулируемого конформационной динамикой, с помощью одномолекулярного FRET. J. Phys. Chem. В 122, 6179–6187.

    DOI: 10.1021 / ACS.jpcb.8b02374

    Яо, К., Сасаки, Х.М., Уэда, Т., Томари, Ю., Тадакума, Х., 2015. Одномолекулярный анализ целевой реакции расщепления ферментным комплексом Drosophila RNAi. Мол. Cell 59, 125–132. DOI: 10.1016 / j.molcel.2015.05.015

    https://doi.org/10.7554/eLife.60404.sa2

    FRETboard: полу-контролируемая классификация следов ладов

    Abstract

    Фёрстеровский резонансный перенос энергии (FRET) - полезное явление в биомолекулярных исследованиях, так как его можно использовать для измерений в наномасштабе.Оптические сигналы, создаваемые такими экспериментами, могут быть проанализированы путем подбора статистической модели. Существует несколько программных инструментов, позволяющих адаптировать такие модели неконтролируемым образом, но их требования к установке, зависящие от операционной системы, и отсутствие гибкости препятствуют их широкому распространению. Здесь мы предлагаем адаптировать такие модели более эффективно и интуитивно, применяя полууправляемый подход, при котором пользователь интерактивно направляет модель, чтобы она соответствовала заданному набору данных, и представляем FRETboard, веб-инструмент, который позволяет пользователям предоставлять такие рекомендации.Мы показываем, что наш подход может точно воспроизводить статистику FRET в широком диапазоне смоделированных сценариев с одной молекулой и правильно оценивать параметры до одиннадцати состояний. По данным in vitro мы извлекаем параметры, идентичные параметрам, полученным путем трудоемкой ручной классификации, за долю от необходимого времени. Более того, мы разработали FRETboard, чтобы его можно было легко расширить на другие модели, что позволяет адаптировать его к будущим разработкам в области измерения и анализа FRET.

    1 Введение

    За последние десятилетия эксперименты с одномолекулярным резонансным переносом энергии Ферстера (smFRET) предоставили фундаментальное понимание биомолекулярной структуры и многих молекулярных механизмов [например, 1–6]. Хотя все эксперименты по существу основываются на одном и том же принципе - эффективности передачи энергии в зависимости от расстояния между флуоресцентными донорными и акцепторными красителями - использование различных схем маркировки позволяет применять их в различных областях. Например, красители, прикрепленные к двум точкам на одной молекуле, могут предоставлять пространственную информацию, ценную для решения ее структуры [2, 4], или регистрировать структурную динамику, поскольку молекула выполняет свою биологическую функцию [1].Фиксированный на отдельных молекулах, FRET может предоставить информацию о возникновении и природе молекулярных взаимодействий [3, 5, 6]. Если одна пара красителей предоставляет недостаточную информацию, множество пар красителей можно даже считывать одновременно, используя стохастически мигающие красители [7].

    Поскольку такие разные схемы маркировки производят данные разного характера, из этого следует, что широко применяемое программное обеспечение для анализа данных smFRET должно быть достаточно гибким, чтобы адаптироваться к этому разнообразию. Существует несколько программных пакетов, многие из которых полагаются на некоторую разновидность скрытой марковской модели (HMM) для извлечения характеристик эффективности FRET и молекулярной кинетики для посещаемых молекулярных конформаций [8–12].Некоторые методы анализируют только эффективность передачи энергии, измеряемую как долю интенсивности излучения акцептора от общей интенсивности [8, 10]. Другие используют дополнительные данные, содержащиеся в индивидуальных донорных и акцепторных каналах излучения [9, 11, 12]. Все они направлены на то, чтобы ограничить влияние пользователя на настройку параметров, определяющих процесс настройки, и, таким образом, принять процедуру настройки без присмотра.

    Здесь мы показываем, что HMM может быть приспособлен к любому конкретному набору данных FRET с использованием контролируемого или частично контролируемого подхода, т.е.е. позволяя пользователю вручную настраивать классификацию ограниченного количества трасс для управления подгонкой модели (рис. 1). Такое прямое вмешательство на уровне классификации делает подгонку модели гибким, интуитивно понятным и легким в вычислительном отношении процессом. Мы дополнительно повышаем точность, вводя более сложную структуру HMM, которая, насколько нам известно, ранее не применялась к данным smFRET. Использование нескольких дополнительных функций, полученных из исходного сигнала, еще больше повышает точность и гибкость адаптации к данным различных схем маркировки.Наш метод доступен для использования через веб-инструмент FRETboard. FRETboard - это комплексное решение для анализа smFRET, которое также поддерживает утилиты фильтрации данных и построения графиков. Поскольку область smFRET быстро развивается и диверсифицируется, мы разработали FRETboard, чтобы расти вместе с потребностями сообщества пользователей; позволяя любому легко расширять FRETboard с помощью существующих или будущих алгоритмов классификации, наш инструмент может и дальше служить объединяющим веб-интерфейсом для высокоуровневых пользователей, которые нуждаются как в нишевой, так и в универсальной классификации.

    Рисунок 1:

    Наш рабочий процесс полууправляемой классификации для классификации трассировки FRET, реализованный в FRETboard, разделен на 4 этапа. (1a) трассировки FRET загружаются на веб-сервер, после чего параметры ( θ ) исходной модели адаптируются без учителя и (1b) прогнозируется начальная классификация трасс. Подходящая модель, созданная во время предыдущего запуска FRETboard, также может быть предоставлена, чтобы пропустить первоначальную настройку. (2) Затем пользователю отображается прогнозируемая классификация кривой с индексом n, X n , с продолжительностью T n , для которой модель была самой плохой на основе нормализованной по продолжительности трассы вероятность с учетом текущих параметров модели ( P ( X n | θ ) / T n ), и требуется ручная корректировка.(3) Кураторская трассировка затем используется для повторной инициализации модели, которая (4) затем обучается (полу) контролируемым образом. Шаги 2–4 могут повторяться до тех пор, пока пользователь не сочтет подгонку модели удовлетворительной.

    2 Метод анализа

    Представленный здесь метод анализа трассировки FRET отличается от предыдущих методов по трем параметрам: полу-контролируемый подход к обучению, структура подбираемых моделей и функции, на которых они были обучены. Здесь мы объясняем и обосновываем свой выбор в каждом из этих аспектов.

    2.1 Подгонка модели с полууправлением

    Вкратце, процедура подбора HMM должна оценивать матрицу перехода, которая содержит вероятности перехода между каждым состоянием и одно распределение вероятностей признаков для каждого состояния. Существующие методы классификации FRET на основе HMM используют реализацию максимизации ожидания (EM) для альтернативной классификации данных и подгонки матрицы перехода и распределений вероятностей к данным до тех пор, пока параметры не перестанут изменяться.

    Мы обращаемся к двум заметным недостаткам неконтролируемой подгонки в контексте анализа трассировки FRET. Во-первых, необходимы первоначальные предположения о переходных и эмиссионных параметрах. Без предварительных знаний они могут быть сгенерированы случайным образом, однако их выбор может оказать значительное влияние на конечные параметры модели. Неудачная инициализация может привести к достижению плохого локального оптимума, вероятность которого возрастает по мере уменьшения отношения сигнал / шум. Повторная инициализация и выбор модели с наибольшей вероятностью может смягчить эту проблему, но увеличивает вычислительные затраты.Во-вторых, наиболее вероятная последовательность состояний после оптимизации параметров может не соответствовать классификации обученным человеческим глазом; Ограниченные данные могут вызвать неконтролируемую процедуру подбора для объединения состояний, которые эксперт сочтет показательными для различных молекулярных конфигураций, или, наоборот, разбить состояние, соответствующее одной конфигурации. В этом случае комбинация параметров, которая воспроизводит экспертную маркировку, просто достигает другого (то есть не обязательно более высокого) оптимума в ландшафте вероятности.

    Обучение без учителя позволяет решить обе проблемы. Первоначальные распределения выбросов и вероятности перехода могут быть оценены на основе помеченного вручную подмножества всех трасс. Затем можно продолжить обучение с использованием процедуры EM на помеченных и немаркированных данных. Метки классифицированных примеров не нужно переоценивать и продолжать направлять процедуру обучения к поиску модели, которая воспроизводит классификацию в помеченных трассах, но при этом может соответствовать образцам, которые присутствовали только в немаркированных трассах.

    Мы дополнительно улучшаем этот план анализа, выбирая для наблюдения трассы, которым модель присвоила самую низкую нормированную по длительности вероятность последовательности. Поскольку эти следы наименее хорошо описываются моделью, более вероятно, что руководство пользователя направит модель в сторону лучшего соответствия. Процедура подбора кратко представлена ​​на рисунке 1 и более формально описана в приложении C.

    2.2 Структуры модели

    Мы оцениваем производительность двух структур HMM в условиях полууправляемого обучения (рисунок 2).Каждая структура реализует переходы и / или выбросы по-разному и может быть расширена до произвольного числа состояний. «Ванильная» структура дает прямолинейный полностью подключенный HMM без каких-либо дополнительных модификаций. Структура «GMM-HMM» моделирует выбросы с использованием модели смеси Гаусса (GMM) и добавляет дополнительные состояния между соседними состояниями, которые фиксируют распределение функций на границах между переходами. Число гауссиан на GMM определяется для каждого состояния с использованием процедуры выбора байесовского информационного критерия (BIC).

    Рисунок 2:

    Скрытые структуры графов марковской модели, используемые в этой работе: ( A ) простая «ванильная» структура и ( B ) структура «GMM-HMM», в которой каждое состояние содержит распределение гауссовой смеси. и дополнительные состояния для распределений функций при переходах между состояниями. Кружки обозначают состояния с характерным распределением признаков, ребра обозначают переходы. Здесь показаны трехуровневые структуры, однако могут быть построены аналогичные структуры с произвольным числом состояний.

    2.4 Реализация

    Чтобы упростить применение нашего метода, мы разработали FRETboard, графический интерфейс пользователя (GUI) на основе браузера для частично контролируемого обучения алгоритмов сегментации и классификации (рисунок S1). В дополнение к интуитивно понятному наблюдению за примерами FRETboard предлагает пользователям гибкость выбора между структурами модели и выбором функций для включения. Поскольку мы предвидим, что в будущем могут быть предложены более подходящие контролируемые классификаторы для растущего числа схем маркировки, мы также предлагаем пользователям возможность писать собственные алгоритмы и обучать их через тот же интерфейс FRETboard.Однако из-за риска внедрения кода, присущего запуску такого настраиваемого кода, пользователям рекомендуется разрешать эту опцию только на частных машинах, не подключенных к общедоступной сети.

    Трассы могут быть загружены в обычном текстовом, двоичном 64-битном формате или в формате Photon-HDF5 [13]. Учитывая данные о переменном лазерном возбуждении (ALEX), FRETboard может также корректировать оптические данные для перекрестных помех флуоресцентных красителей, прямого возбуждения акцептора, эффективности обнаружения и фоновой эмиссии (приложение D).

    После процедуры обучения пользователь может сгенерировать отчет с подробным описанием распределения функций по состояниям и скорости перехода. Частоты переходов выводятся путем взятия вероятностей переходов из подобранной матрицы переходов HMM ( A ), преобразования от дискретных к непрерывным скоростям и умножения на частоту кадров f с , таким образом, получая скорректированные частоты перехода F (Уравнение 1) [9]. Здесь I - единичная матрица, а log - операция логарифмирования натуральной матрицы.95% доверительные интервалы (ДИ) скорости перехода оцениваются путем многократного извлечения частот перехода из данных самонастройки. Затем CI сообщается с использованием стандартного отклонения начальной загрузки для каждого параметра. Обратите внимание, что самонастройка CI применима практически к любой (полу) контролируемой модели, поэтому любой определяемый пользователем алгоритм может использовать тот же метод.

    FRETboard доступен в виде веб-инструмента (https://www.bioinformatics.nl/FRETboard), что освобождает пользователей от бремени установки и обслуживания, но также может использоваться и размещаться на частном сервере.FRETboard был написан на Python 3.7 (https://www.python.org). Графический интерфейс пользователя был реализован с использованием библиотеки интерактивной визуализации Bokeh (v1.4.0) [14] (рис. S1). Включенные структуры модели HMM были реализованы с использованием pomegranate (v0.13.4) [15] и scikit-learn (v0.21.2) [16].

    3 Анализ данных и оценка производительности

    Ниже мы проверяем наш метод анализа на четырех наборах данных in silico и четырех in vitro . Чтобы продемонстрировать гибкость нашего метода, различные наборы были смоделированы или записаны с учетом множества реалистичных схем маркировки.Все используемые здесь наборы данных находятся в свободном доступе (https://git.wageningenur.nl/lanno001/fretboard_data). Все запуски FRETboard выполнялись на ноутбуке под управлением Ubuntu 18.04 на четырех ядрах ЦП (Core i7 1,80 ГГц, Intel Corp.) с 4 ГБ памяти. Всего мы контролировали десять трассировок для каждого набора данных (3% и 10% от общего числа считываний для наборов данных in silico, и in vitro, соответственно), используя четыре описанные функции ( E PR , F сумма , C и).

    Мы оценили, насколько хорошо полууправляемые HMM могли воспроизводить основные параметры истинности, полученные из смоделированных последовательностей состояний или, в случае данных in vitro, , из ручной маркировки. Чтобы проверить, достигают ли предсказанные распределения E PR среднего, сравнимого с наземной истиной, мы применяем два односторонних теста t (TOST) [17]. То есть для заданного состояния s вычисляются прогнозируемое среднее и основное истинное среднее ( µ s ), и два односторонних теста t используются для проверки и против.Отказ от обеих гипотез означает, что разница между средними значениями выбросов значительно меньше, чем δ E PR процентных пунктов. Здесь мы проверяем максимальное отклонение в пять или десять процентных пунктов ( δ = 0,05 и δ = 0,1 соответственно), что мы считаем достаточно точным для многих текущих приложений. Мы сообщаем значение TOST p для данного δ = δ * как p δ = δ * .Сообщенные 95% доверительных интервалов для расчетных скоростей перехода были рассчитаны с использованием встроенного метода начальной загрузки FRETboard с размером начальной загрузки 100.

    3.1 Производительность на

    in silico данных

    Чтобы продемонстрировать гибкость нашего подхода, мы смоделировали трассировки FRET на основе на трех различных схемах разметки с использованием процесса Монте-Карло цепи Маркова для генерации последовательностей состояний с добавленным гауссовым шумом и их классификации с использованием полууправляемой ванильной HMM. Вкратце, первые два набора данных содержат два и три состояния FRET соответственно, которые можно разделить на основе только E PR (рисунок S2A, B).Третий набор данных содержит три состояния, из которых третье идентично второму по степени близости, но имеет другую скорость перехода, что делает его «вырожденным состоянием» (рисунок S2C). Полное описание методологии моделирования см. В приложении A.

    Во всех случаях расчетное среднее E PR значительно отличалось менее чем на 5 процентных пунктов от основного истинного среднего ( p δ = 0,05 << 0,001) (Рисунок 3 AC).Большинство коэффициентов перехода на наземную информацию находились в пределах начальных 95% -ных доверительных интервалов, близких к прогнозируемым (рис. 3 E-G). Если присутствовали вырожденные состояния (рис. 3 C, G), оценки скорости перехода несколько отклонялись от основной истины, указывая на то, что структура модели, которая лучше оснащена для их обнаружения, подходит для таких случаев [например, 11]. Помимо ручного курирования, не требовалось никакой дополнительной настройки параметров или другого ввода данных пользователем, что демонстрирует, что полу-контролируемое обучение обеспечивает ожидаемую гибкость при сохранении точности.

    Рисунок 3: Оценки плотности ядра

    для E PR распределений на состояние ( AD ) и скорости перехода ( EH ), оцененные с помощью полууправляемой скрытой марковской модели на четырех смоделированных наборах данных на основе разные схемы маркировки; ( A , E ), создающие два типа пространственно разделимых событий FRET, то есть с разными коэффициентами близости ( E PR ), ( B , F ) три пространственно разделимых состояния, ( C , G ) три состояния, одно из которых не содержит донорного или акцепторного сигнала, а другие демонстрируют только кинетическое различие, т.е.е. разделимы скоростью перехода и ( D, H ) одиннадцатью пространственно разделимыми состояниями. Параметры наземной достоверности показаны пунктирными линиями на каждом рисунке. В D символы над распределениями E PR обозначают, насколько расчетные средние значения существенно отличаются от истинного значения (: 0,05, ✶: 0,1). Сплошные черные линии в E-G указывают на 95% бутстрэпированных CI. Поверхность круга в H указывает скорость перехода.

    Для стресс-тестирования нашего метода в более сложном случае мы сгенерировали набор данных, в котором присутствовали одиннадцать состояний FRET с разными уровнями E PR (рисунок S2D).Средние значения E PR были распределены таким образом, чтобы их соответствующие донорно-акцепторные расстояния были распределены равномерно, в результате чего нижние и верхние концы спектра E PR были более плотно заполнены состояниями. Кроме того, донорные и акцепторные сигналы были сгенерированы с использованием смесей гауссианов для имитации шума в менее идеальных условиях измерения.

    Во время обучения стало ясно, что структуре стандартной модели не хватает сложности, чтобы должным образом соответствовать этому набору данных, поскольку каждая трасса, представленная после нового цикла обучения, продолжала требовать корректировки со стороны пользователя без дальнейшего повышения точности обучения.Действительно, скорости перехода и распределения E PR , оцененные с использованием ванильной структуры, значительно отличаются от основных истинных значений (Рисунок S3). Таким образом, мы продолжили наш анализ, используя структуру GMM-HMM. Шесть из одиннадцати E PR средние распределения значимо отличались менее чем на пять процентных пунктов от наземных истинных средних ( p δ = 0,05 << 0,001, рисунок 3D), а остальные пять различались меньше. более десяти процентных пунктов ( p δ = 0.1 << 0,001) и оценки скорости перехода были ближе к базовым значениям, чем обычные оценки HMM (3H). Это демонстрирует еще одну силу нашего метода; когда пользователь обнаруживает, что более простые модели не обеспечивают желаемой точности, процедура обучения становится достаточно легкой, чтобы можно было выбрать более сложную модель на лету, после чего анализ можно продолжить без дополнительных усилий.

    3.2 Эффективность на

    in vitro данных

    Мы дополнительно проверили наш метод на экспериментальных данных, полученных при схемах иммобилизации, часто используемых в одномолекулярном FRET, каждая из которых отмечена различными проблемами классификации.Подобно нашему моделированию, наши данные in vitro содержат до двух типов событий FRET, которые можно различить по коэффициенту близости или скорости перехода. Не зная о последовательности состояний, мы вручную классифицировали наши наборы данных и называем эту классификацию основной истиной. Более подробное описание экспериментальных методов можно найти в приложении B. Все экспериментальные данные были проанализированы с использованием структуры модели GMM-HMM, так как ванильная структура не показала удовлетворительного повышения качества классификации по мере обучения (рисунок S4).

    Сначала мы разработали эксперимент, в котором одноцепочечная (ss) ДНК, меченная донором (Cy3), содержащая целевой сайт A, иммобилизована посредством конъюгации биотин-стрептавидин на кварцевом предметном стекле (рис. 4A). При связывании меченой акцептором (Cy5) восьминуклеотидной цепи «imager» с сайтом A возникают события FRET, отмеченные антикоррелированными донорскими и акцепторными сигналами (фиг. 4D). Подобные схемы маркировки ранее применялись для накопления точек для построения изображений в методах наномасштабной топографии (PAINT) и для изучения внесения и отклонения ( k на и k off ) в биологических системах [18, 19].В этой схеме маркировки часто происходит обесцвечивание донорного красителя из-за непрерывного возбуждения, что может отрицательно повлиять на кинетический анализ. Вместо того, чтобы требовать от пользователя кропотливого удаления событий обесцвечивания, мы фиксируем их в отдельном состоянии во время обучения нашей HMM. Это обесцвеченное состояние можно затем отбросить перед дальнейшим анализом. Следуя этому подходу, мы обнаружили, что скорость перехода наземной истины для состояния заземления в состояние с высоким FRET и наоборот действительно находится в пределах их соответствующих расчетных CI (0.119 с -1 по сравнению с CI : (0,095 - 0,122) и 0,546 с -1 по сравнению с CI : (0,468-0,578) соответственно, рисунок 4M). Оценочные значения E PR (0,151 и 0,816 для основного состояния и высокого FRET соответственно) значительно отличаются менее чем на пять процентных пунктов от основных истинных значений p δ < 0,05 << 0,01, рисунок 4I).

    Рисунок 4:

    Используемые схемы маркировки ( AD ), примеры событий, правильно обнаруженных с помощью полууправляемой классификации HMM ( EH ), оценки плотности ядра E PR распределений на состояние ( IL ) и предполагаемые скорости перехода ( MP ) для четырех различных схем маркировки, на которых был оценен наш метод подбора HMM с полуконтролем.Слева направо эти схемы мечения производили события FRET одного типа с использованием иммобилизованного донора ( A ) или иммобилизованного акцептора ( B ), два типа событий, производящих события с высоким и средним FRET ( C ). ) и два типа кинетически различных событий ( D ). В J-L состояние без FRET опущено, поскольку значения E PR не имеют смысла для схем маркировки, в которых донор не иммобилизован. В I-P пунктирные линии представляют основные истинные значения, основанные на ручной маркировке, а в M-P сплошные линии обозначают 95% доверительных интервалов с начальной загрузкой.

    Мы также выполнили обратный эксперимент, в котором акцептор иммобилизован, а донор прикреплен к цепи изображения (рис. 4B). Хотя эта схема маркировки не так сильно страдает от обесцвечивания красителя, ожидается, что отсутствие антикорреляции в сигнале повысит сложность классификации. Тем не менее, и здесь прогнозируемое среднее распределение E PR состояния с высоким FRET (0,844) отличалось от основного истинного значения менее чем на 5 процентных пунктов ( p δ = 0.05 << 0,01, рис. 4J). Поскольку при этой схеме маркировки в основном состоянии краситель не наблюдается, его значение E PR не имеет смысла и здесь не анализируется. Скорость перехода основного истинного состояния от высокого FRET к основному состоянию попала в прогнозируемый 95% ДИ (0,367 с -1 по сравнению с ДИ : (0,333 - 0,429)), в то время как скорость для основного состояния в состояние с высоким FRET был немного занижен (0,012 с -1 по сравнению с ДИ : (0.007 - 0,011), Фиг.4N).

    Затем мы оценили производительность в двух сценариях, где присутствуют два состояния FRET. Для этих экспериментов мы следовали той же экспериментальной процедуре, но одновременно промывали два типа связанных с донором свободно плавающих нитей имидж-сканера в соотношении 1: 1 (рис. 4D, E).

    В первом эксперименте вторая цепь формирователя изображения была комплементарна второму целевому сайту В на расстоянии 15 нт от акцептора - на 10 нт дальше, чем целевой сайт А - где связывание цепи формирователя изображения должно приводить к промежуточному соединению E PR (рис. 4F).После анализа модель GMM-HMM обнаружила, что E PR означает 0,85 и 0,72 для состояний 2 и 3 соответственно, что соответствует основному среднему истинному состоянию ( p δ < 0,05 < 0,01 , Рисунок 4J). Большинство оценок скорости перехода попадали в прогнозируемые 95% доверительные интервалы, за исключением перехода из среднего FRET (3) в основное состояние (1) (0,439 с -1 по сравнению с CI : (0,483 - 0,780)). При просмотре трасс мы обнаружили, что несколько коротких событий среднего FRET были ошибочно обнаружены на зашумленных участках основного состояния - обычное явление в анализе smFRET и, следовательно, не учитывались явным образом e.грамм. удаление следов из анализа вручную.

    Во втором эксперименте сайт A был нацелен второй цепью формирователя изображения длиной 7nt - на 1nt короче, чем его аналог - что должно увеличить скорость отклонения и привести к вырожденному состоянию (рис. 4G). Здесь также наш GMM-HMM произвел оценки параметров, близкие к истинным значениям на трассах, содержащих вырожденные состояния, что удивительно, учитывая наши результаты для данных in silico . Прогнозируемая скорость перехода из состояния 2 в основное состояние была выше на 2.22 с −1 ( CI : 1,87 - 2,57), чем у состояния 3 - 0,43 с −1 ( CI : 0,382 - 0,479) -, что похоже на скорости перехода, наблюдаемые в других in vitro эксперимента (Фиг.4O). Предположительно, состояние 2 соответствует отжигу более короткой жилы формирователя изображения 7nt. Оба находятся в тесном соответствии с наземными коэффициентами истинности (2,24 с -1 и 0,411 с -1 соответственно).

    4 Обсуждение

    Мы показываем, что полууправляемые модели классификации, в частности скрытые марковские модели (HMM), способны фиксировать свойства событий FRET в широком спектре реалистичных экспериментальных сценариев, используя комбинацию входных характеристик, полученных из исходные интенсивности излучения донорных и акцепторных красителей.Мы также предоставляем структуру HMM, которая в целом лучше подходит для полууправляемого обучения, чем прямая полностью подключенная модель, и обеспечивает особое преимущество в зашумленных реальных и сложных наборах данных, содержащих более двух состояний.

    Важное предостережение нашей оценки производительности - и контролируемого обучения в целом - заключается в том, что предполагается, что пользователь знает количество состояний, которые ему подходят, и какие характеристики следует искать при ручной маркировке. С помощью нашего метода мы возлагаем на пользователя ответственность за правильную классификацию, учитывая плюсы и минусы пользовательского ввода; с одной стороны, он обеспечивает эффективное обучение и дает результаты, соответствующие интуиции пользователя, с другой стороны, он соответствует ошибкам, которые пользователь может совершить.Такие ошибки могут произойти, например, при классификации следов после отбеливания красителей. Если пользователя интересует только средняя эффективность FRET событий, не связанных с основным состоянием, может иметь смысл классифицировать обесцвеченные участки как основное состояние - курс действий, для которого, в частности, подходит структура GMM-HMM благодаря своей гибкости. Однако, если важны оценки кинетической скорости, результаты будут более точными, если отбеливанию присвоено собственное состояние, которое затем можно удалить перед анализом, как это было сделано в представленном здесь анализе.

    Чтобы приспособиться к интенсивному взаимодействию с пользователем, необходимому для этого метода, мы разработали FRETboard, интуитивно понятный инструмент на основе браузера, который позволяет подготовку данных, обучение модели, классификацию и создание отчетов. Важно отметить, что FRETboard может быть легко расширен на другие модельные конструкции, отличные от представленных в этой работе; поскольку существует множество контролируемых разновидностей HMM и совершенно разных классификаторов, которые могут лучше подходить, чем модели, включенные в настоящее время для определенных экспериментальных данных, мы рекомендуем пользователям разрабатывать свои собственные классификаторы и обучать их через интерфейс FRETboard.По согласованию с авторами таких настраиваемых классификаторов они также могут быть включены в будущие выпуски FRETboard. Это позволило бы ему стать универсальным интерфейсом для анализа трассировки FRET с поддержкой серверной части для расширяющегося разнообразия экспериментальных методов smFRET.

    Приложения

    Моделирование трассировки

    Моделируемые трассы были созданы с использованием специального кода, написанного в Matlab (R2019b, The MathWorks, Inc.). Процедура Монте-Карло цепи Маркова (MCMC) использовалась для генерации путей скрытых состояний системы в соответствии с заданной матрицей переходов.Следы интенсивности флуоресценции донора и акцептора затем генерировались из скрытых путей с использованием заданных распределений излучения одиночного или смешанного гауссова на состояние. Ширина гауссовых распределений была установлена ​​равной квадратному корню из среднего, чтобы имитировать вклад дробового шума фотонов. Дополнительный случайный фоновый шум был дополнительно добавлен для имитации темнового счета фотодетектора и дробового шума электроники. Затем следы были уменьшены до одной десятой исходной длины, чтобы моделировать поведение дискретных измерений в непрерывном биологическом процессе.Для каждой схемы маркировки красителем было создано 300 следов одиночных молекул, которые использовали для тестирования производительности FRETboard. Длина каждой отдельной трассы была случайным образом выбрана в диапазоне от 12000 до 18000 точек данных перед понижающей дискретизацией во всех случаях, за исключением случая с 11 состояниями, для которого использовалось от 24000 до 36000 точек данных. Код моделирования предоставляется бесплатно по запросу.

    B Расширенные экспериментальные методы

    B.1 Одномолекулярная установка

    Все эксперименты проводились на специально созданной установке микроскопа.Используется инвертированный микроскоп (IX73, Olympus) с полным внутренним отражением на основе призмы. В сочетании с лазером DPSS с длиной волны 532 нм (Compass 215M / 50 мВт, Coherent). Водный иммерсионный объектив 60x (UPLSAPO60XW, Olympus) использовался для сбора фотонов от красителей Cy3 и Cy5 на поверхности, после чего длиннопроходный фильтр 532 нм (LDP01-532RU-25, Semrock) блокировал возбуждающий свет. Дихроичное зеркало (635 dcxr, Chroma) отделяет сигнал флуоресценции, который затем проецируется на камеру EM-CCD (iXon Ultra, DU-897U-CS0- # BV, Andor Technology).Серию изображений EM-CDD записывали с помощью специальной программы на Visual C ++ (Microsoft). Следы времени были извлечены из изображений EM-CDD с использованием IDL (ITT Visual Information Solution).

    B.2 Сбор данных по одной молекуле

    Чтобы избежать неспецифического связывания ДНК с поверхностью, кварцевые предметные стекла были ПЭГилированы, как описано ранее [20]. Вкратце, кварцевые слайды, протравленные кислотой пираньи (Finkenbeiner), дважды пассивировали полиэтиленгликолем (PEG). Первый цикл ПЭГилирования выполняли с mPEG-SVA (Laysan) и ПЭГ-биотином (Laysan), затем следовали второй цикл ПЭГилирования с помощью MS (PEG) 4 (ThermoFisher).После сборки микрофлюидной камеры слайды инкубировали с 20 мкл л стрептавидина (0,1 мг / мл, ThermoFisher) в течение 2 минут. Избыток стрептавидина удаляли с помощью 100 мкл л Т50. Затем для экспериментов с одной молекулой мы иммобилизовали 50 мкл мкл 100 мкМ Cy5 (или Cy3) целевой ДНК в течение 2 минут, несвязавшуюся ДНК промыли 100 мкл мкл Т50, а затем 100 мкл мкл буфера. A (50 мМ Трис-HCl, pH 8,0, 500 мМ NaCl). Затем мы вводили 50 мкл л 5 нМ цепей имидж-сканера в буфере для визуализации (50 мМ трис-HCl, pH 8.0, 500 мМ NaCl, 0,8% глюкозы, 0,5 мг / мл глюкозооксидазы (Sigma), 85 µ г / мл каталазы (Merck) и 1 мМ Trolox (Sigma)). Одномолекулярные FRET-эксперименты проводились при комнатной температуре (23 - 2 ° C).

    C Подгонка модели с полууправлением

    Если доступны маркированные вручную трассы, набор всех параметров ( θ ) для скрытой марковской модели (HMM) может быть настроен контролируемым образом; вероятности выбросов могут быть оценены путем подбора распределения вероятностей к характеристикам для каждого состояния, в то время как вероятности перехода выводятся из последовательности состояний.Чтобы подогнать гауссовские распределения к нашим характеристикам для каждого состояния i с учетом маркированных трасс X n , n = 1 … N , переменной длины T n , мы вычисляем среднее и стандартное отклонение по всем измерениям x nt , из которых соответствующая метка L nt равна i : Здесь равно 1, если L nt = i , и 0, если L nt i .Вероятности переходов оцениваются как отношение переходов между двумя состояниями к количеству появлений состояния ухода: Здесь обозначает предполагаемую запись ( i, j ) в матрице перехода HMM, то есть вероятность перехода из состояния i в j . Наконец, начальные вероятности для каждого состояния можно получить, взяв долю помеченных трассировок, которые начинаются с данного состояния: Ручная маркировка достаточного количества данных, чтобы зафиксировать все отличительные закономерности в трассировках, является трудоемкой задачей, поэтому HMM часто устанавливаются без присмотра, используя реализацию максимизации ожидания, известную как обучение Баума-Велча.Путем итеративного чередования переоценки параметров модели и получения наиболее вероятной маркировки заданных параметров и данных модели можно подобрать HMM без предварительного знания правильной маркировки последовательности или параметров модели. В этом случае вклад каждой выборки в параметры распределения выбросов класса i и данного перехода a ij взвешивается вероятностями отнесения к этому классу γ i ( n, t ) и переход, происходящий ξ ij ( n, t ) соответственно, с учетом текущих параметров модели: Подгонка с использованием контролируемой процедуры эффективно устанавливает вероятности наблюдаемых состояний и переходов равными 1, а для всех остальных - 0 с помощью в уравнениях 2 и 3.

    Как отмечено в основном тексте, тренировка Баума-Велча требует начальных значений параметров перехода и выбросов, и, учитывая ее жадный характер, может не приблизиться к удовлетворительному оптимуму. Если используется полу-контролируемое обучение, начальные распределения выбросов и вероятности перехода могут быть оценены с использованием помеченного вручную подмножества всех трасс и уравнений 2 и 3. Затем обучение может продолжаться с использованием процедуры Баума-Велча для помеченных и немаркированных данных, где метки классифицированных примеров не нужно переоценивать (уравнения 6).Таким образом, процедура обучения может быть направлена ​​на поиск модели, которая воспроизводит классификацию в помеченных трассах, но при этом может соответствовать образцам, которые присутствовали только в немаркированных трассах. здесь N обозначает количество трасс, помеченных вручную, а M обозначает количество трасс без меток. Мы можем увеличить дополнительный параметр настройки λ , если мы обнаружим, что модель больше не воспроизводит наши помеченные последовательности достаточно хорошо.Обратите внимание, что для λ = 1 процедура использует полностью контролируемую подгонку, которая не требует обучения Баум-Велча. По умолчанию λ установлено на 0,5, что означает, что все контролируемые и неконтролируемые трассы имеют одинаковый вес.

    D Фильтрация следов с использованием FRETboard

    Поскольку на эффективность FRET влияют фоновая освещенность, различия в эффективности детекторов, перекрестные помехи между акцепторными и донорными каналами, прямое возбуждение акцепторных красителей и фоновая эмиссия, рекомендуется применить некоторую форму фильтрации к необработанные трассировки до обучения классификатора.

    FRETboard предлагает автоматический метод вычитания фона для каждой трассы отдельно для донорных и акцепторных каналов. Используя алгоритм кластеризации DBSCAN, определяется и вычитается самый низкий уровень интенсивности в канале. Предпосылкой для правильного функционирования этого адаптивного фильтра является то, что кривая действительно содержит участок освещенности на уровне фона. Строгость этого фильтра контролируется настраиваемым параметром ϵ , который определяется как максимальное расстояние между центральной точкой кластера и удаленными точками этого же кластера.Было обнаружено, что предустановленное значение ϵ = 15 работает во всех представленных здесь данных.

    Если доступны данные с переменным лазерным возбуждением (ALEX), FRETboard может автоматически применять поправки на перекрестные помехи, прямое возбуждение и эффективность детектора, как описано в [21], отмечая определенные состояния как D (onor) -only и A (рецептор) - только. Впоследствии FRETboard выполнит необходимые вычисления для оценки и применения поправочных коэффициентов.

    E Дополнительные рисунки

    Рисунок S1:

    Элементы управления в графическом пользовательском интерфейсе разделены на три этапа: (1) загрузка данных и структуры модели, (2) итеративное обучение выбранной структуре модели распознавать события по своему усмотрению и ( 3) сохранение отчета со статистикой и готовыми к публикации цифрами, необработанных классифицированных данных для дальнейшей обработки и модели для будущего использования с аналогичными наборами данных.

    Рисунок S2:

    Примеры разделов смоделированных трасс FRET и базовой классификации истинности для четырех сценариев: (A) одно состояние FRET, (B) одно состояние FRET с иммобилизованным акцептором и мобильным донором (C) два состояния FRET и (D) десять состояний FRET. Белый фон обозначает основное состояние, а разные оттенки серого обозначают разные состояния.

    Рисунок S3:

    Оценки плотности ядра для E PR распределений на состояние ( A ) и скорости перехода ( B ), оцененные с помощью полууправляемой ванильной скрытой марковской модели на имитируемом наборе данных, содержащем одиннадцать разделимые состояния.Параметры наземной достоверности показаны пунктирными линиями на каждом рисунке. В B поверхность круга указывает скорость перехода. Для сравнения, анализ с использованием структуры модели GMM-HMM (рис. 3D, H) вернул оценки параметров, более близкие к истинным значениям как для скоростей перехода, так и для распределений E PR на состояние.

    Рисунок S4:

    Используемые схемы маркировки ( AD ), оценки плотности ядра для E PR распределений на состояние ( EH ) и расчетные скорости перехода ( IL ) для четырех различных схем маркировки, на которых был оценен наш полууправляемый метод подбора HMM с ванильной структурой.Слева направо эти схемы мечения производили события FRET одного типа с использованием иммобилизованного донора ( A ) или иммобилизованного акцептора ( B ), два типа событий, производящих события с высоким и средним FRET ( C ). ) и два типа кинетически разных событий ( D ). В E-L пунктирные линии представляют основные истинные значения на основе ручной маркировки, а в M-P сплошные линии обозначают 95% доверительных интервалов с начальной загрузкой. Для сравнения, анализ с использованием структуры модели GMM-HMM (рис. 4I-P) вернул оценки параметров, близкие к основным истинным значениям как для скоростей перехода, так и для распределений E PR на состояние.

    Вы играли на гитаре Тейлора с 12 ладами?

    Вы играли на 12 ладах Тейлора?

    Все больше и больше музыкантов в восторге от вдохновляющего звучания и звучания 12-ладовых гитар Grand Concert Тейлора. Как только вы сыграете в нее, вы поймете, почему. Дизайн с 12 ладами отличается другим соотношением шеи к корпусу, что приводит к дополнительному обтекаемому ощущению рук и удивительно теплому и мощному голосу для гитары с маленьким корпусом. Выбирайте из более чем дюжины вариантов модели Taylor с 12 ладами, в которых представлены богатые сочетания различных вкусов древесины.

    Видео: Энди Пауэрс из Taylor объясняет привлекательность 12-ладовой игры

    12-ладовая основа

    Что такое 12 ладов?

    Это положение, в котором гриф встречается с корпусом гитары. На других моделях Taylor со стальными струнами гриф встречается с корпусом на 14-м ладу. Гриф из 12 ладов также немного короче, чем гриф из 14 ладов, при этом общее количество ладов на два лада меньше (18 против 20). Различное расположение грифа по отношению к корпусу смещает перемычку от звукового отверстия ближе к центру нижней части выступа.Это придает гитаре отличительную музыкальную индивидуальность.

    Что стоит за дизайном 12 ладов?

    Его корни уходят в ранний период создания гитары со стальными струнами. Начиная с 1930-х годов дизайн был постепенно заменен грифом с 14 ладами, как часть эволюции в сторону более длинных грифов, на которую повлияли дизайны мандолины и банджо. В результате 12-ладовый инструмент стал известен как старомодный дизайн, но в последние годы музыканты заново открыли для себя его уникальные музыкальные достоинства.Наши 12-ладовые гитары включают в себя современные элементы, такие как вырезанный корпус, обеспечивающий доступ к верхнему регистру.

    Как дизайн 12 ладов меняет ощущение и звук гитары?

    Между чуть более короткой шкалой 24-7 / 8-дюймовой длины Grand Concert и перемещением бриджа в более гибкое место на деке, ощущение руки немного мягче и изящнее, что облегчает формирование аккордов и сгибание струн. . Различное положение бриджа также меняет способ движения деки, производя удивительное количество мощности, тепла и сустейна для компактного корпуса.

    Кому понравится 12-ладная гитара?

    Широкий спектр плееров. Мастерам маникюра понравятся изящные ручки и отзывчивость. Все, от новичков до продвинутых игроков, обнаружат, что уменьшенное натяжение струн и сжатый интервал между ладами облегчают формирование аккордов. Любой, кто хочет уменьшить нагрузку на свою раздражающую руку, обязательно получит удовольствие от игры. Мы призываем всех опробовать 12-ладовый инструмент Тейлора - уникальное ощущение и звук обещают вдохнуть новую жизнь в вашу игру.

    Моделирование грифа с ЧПУ - Fusion 360

    Это руководство проведет вас через процесс моделирования безупречного грифа с прямым радиусом в Fusion 360, но принципы проектирования можно использовать в любой среде САПР и даже применить к грифам ручной сборки.

    Этот процесс состоит из трех частей - эскиза основы, эскизов выдавливания и радиуса, а также нарезки ладов. Пошаговое руководство составлено таким образом, чтобы абсолютные новички также могли следить за ним, поэтому этап создания набросков может показаться некоторым из вас немного утомительным.Если вы знаете ярлык или видите возможности для улучшения процесса, не стесняйтесь присылать сюда любые предложения по электронной почте!

    В этом руководстве используется наш калькулятор расстояния на грифе , но есть еще несколько вариантов (особенно если вы хотите работать в метрических единицах, а не в британских единицах). Мы используем пример измерений ладовой проволоки от Steward MacDonald .

    Я бы посоветовал всем, кто хочет узнать больше о технических аспектах вашего инструмента, получить пробную версию Fusion 360 (которая не определена для любителей) и попробовать смоделировать ее.Даже если вы не собираетесь его использовать.

    Сначала сделайте замеры грифа

    В нашем примере мы будем использовать шкалу 25,5 дюйма / 9,5 дюйма, но не стесняйтесь настраивать эти характеристики по своему вкусу, если вы будете следовать указаниям. Прежде чем приступить к созданию модели, вам нужно знать следующий набор чисел:

    Прежде чем мы начнем, нам нужны наши измерения. Длина шкалы и радиус грифа на самом деле являются лишь вопросом предпочтений - в этом руководстве рассматриваются только накладки на грифе с прямым радиусом.Если вы делаете гитару с помощью одного из наших бесплатных шаблонов, ширину порожка можно измерить после печати или в такой программе, как Adobe Illustrator.

    Ширина бриджа будет зависеть от того, какое оборудование вы выберете для гитары. Если у вас еще нет моста для измерения, производители обычно размещают точные диаграммы и / или измерения на своих веб-сайтах.

    Высота бриджа, зазор струны и толщина грифа

    Когда вы делаете гитару вручную, вам не обязательно записывать всю математику на бумаге с самого начала, но вы должны точно знать, какой мост вы используете. собираюсь использовать заранее.Таким образом, вы можете быть уверены, что между гайкой и седлами будет идеально ровная плоскость.

    Это ничем не отличается от проектов САПР - вы хотите знать, что у вас будет зазор на строку и вы сможете играть в действии, прежде чем совершать фиксацию.

    Следует учесть высоту регулировки вашего бриджа, прежде чем направлять карман на шее, наклонять гриф или толщину грифа. Высота основания бриджа будет определять многое по длине шкалы в отношении зазора между струнами, и ее лучше всего использовать в качестве отправной точки для планирования остальной части вашей гитары.

    Звучит как много измерений и расчетов, но если вы посмотрите на первую диаграмму в этой статье (эту), вы увидите, что вы можете проверить зазор, установив детали всухую и поместив линейку на грифа и продлевая линию до седел моста. Если сомневаетесь, сделайте гриф толще и запланируйте немного сбрить нижнюю часть с помощью ленточной шлифовальной машины, чтобы получить нужную высоту при пробной установке.

    Как смоделировать идеальный гриф (версия с прямым радиусом)

    Щелкайте изображения в галереях ниже и просматривайте их с помощью клавиш со стрелками.

    Добавить комментарий

    Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *