Характеристика лада х рей: LADA XRAY кроссовер — Официальный сайт LADA

Лада Х Рэй: технические характеристики

Февраль 2016 года ознаменован появлением на российских рынках автомобилей нового хэтчбека: Lada XRAY. Пользовавшийся популярностью предшественник 2012 года кажется совсем не похожим на обновленного «брата», к тому же здесь уже используется французская платформа B0.

Модель отлично принята покупателями: в 2017 году Икс-рей занял девятую позицию в рейтинге продаж, показав результат в 33 319 экземпляров.

 

 

Сравнение двух моделей: XRAY и Sandero, их сходства и отличия

Данный хэтчбек – родственник с Renault Sandero Stepway, однако Икс-рей отличается оригинальностью кузова, перенастройкой шасси и собственной линейкой двигателей.

По статусу Икс-рей можно поставить ниже, чем его французский аналог. Такой вывод можно сделать, приглядевшись к мелочам. Икс-рей меньше похож на кроссовер, автомобиль не имеет защитного некрашеного обвеса. Но, по словам производителя, XRAY имеет прямое отношение к классу кроссоверов.

При том, что в базовой комплектации Sandero установлены колеса 16-ти дюймов, а диски имеют стиль литых, то рассматриваемая модель Икс-рей оснащена лишь 15-дюймовым вариантом, а колеса 16 и 17 дюймов можно приобрести только при покупке более дорогой версии.

Сопоставив колесную базу двух автомобилей, можно сделать выводы: Лада стоит на шасси основательнее – по габаритам авто длиннее на 8,5 см и шире на 0,7 см, а задняя колея увеличена здесь на 3,8 см. В чем же задумка данного апгрейда? Теперь у Икс-рея больше объем багажника (361 литр вместо 320). Клиренс сравним с французским автомобилем – 19,5 см.

Внутреннее оснащение автомобиля

Отличным от концепта выдался и интерьер Икс-рея. Вместо зачастую футуристичных деталей теперь предложен более практичный и традиционный вариант. Смотрится этот маневр уместно, стильно и современно. Клавиши управления подогревом сидений расположены не очень удобно, также имеются недочеты при функционировании мультимедиа с системой навигации. Камера заднего вида с экраном в 7 дюймов предоставляет хорошее изображение, но необходимо регулярно отслеживать камеру на предмет загрязнений – она размещена не слишком удачна и в моменты непогоды постоянно загрязняется.

Салон автомобиля оборудован нишами и карманами, а также вместительным бардачком. Климат-контроль присутствует исключительно в более дорогой комплектации, являясь только однозонным. Отсутствует центральный подлокотник на задних сиденьях. Кожаная отделка руля и рычага механической коробки передач имеется только в самых дорогостоящих комплектациях.

Ширина салона позволяет с комфортом разместить трех пассажиров на задних креслах.

Багажник автомобиля выполнен очень аккуратно, отличается вместительностью. Для более дорогой версии добавлено выгодное решение: двойной пол и съемная верхняя часть. Запаска представлена в полном размере, но при базовом диске 15-дюймов, независимо от того, какие колеса предусмотрены комплектацией.

Пару слов о езде по бездорожью

Сами производители повлекли увеличение стоимости эксплуатации автомобиля, заявив Икс-рей как кроссовер. Теперь при посещении автомойки автомобиль принадлежит к более дорогому классу. Но по характеристикам данная модель с натягом походит на хэтчбек. В комплектации отсутствуют характерные для кроссоверов элементы: пластиковая защита кузова, рейлинги.

 

 

Однако что касается езды по бездорожью, здесь не лишними будут короткая база и приподнятый кузов данного автомобиля. Но тогда понадобятся качественные шины с подходящим протектором для бездорожья.

Увеличенный клиренс (до 19,5 см) и стальная защита моторного отсека предназначены для уверенного движения по пересеченной местности. Если дно выглядит плоским, то здесь есть свои нюансы: проводка одного из датчиков на выхлопном тракте собирает по пути все ветки, камни и другие элементы бездорожья. Известны случаи, когда тормозная трубка на задней балке была сорвана в колее. Более того, нижняя губа становится слабым местом автомобиля не только на бездорожье, но и в случае парковки в городе – возможно повредить ее о бордюр.

В базовую комплектация автомобиля входят: фронтальные подушки безопасности, ESP (с возможностью отключения), система помощи при старте с уклонной поверхности, автоматическая блокировка дверных замков, светодиодные ходовые огни, бортовой компьютер. Имеются также регулировка по высоте кресла водителя, дистанционный ключ, передние электрические подъемники стекол, аудиосистема (с поддержкой USB, AUX и Bluetooth), складная спинка заднего дивана (в пропорции 40/60) и даже розетка в багажном отсеке.

 

Оценить статью

Понравилась статья? Поделиться с друзьями:

Двигатели Лада Х-рей — подробные характеристики

На модель Лада Х-рей устанавливают сразу два отечественных бензиновых силовых агрегата: ВАЗ 21129 объемом 1.6 литров 106 л.с. 148 Нм и ВАЗ 21179 объемом 1.8 литров 122 л.с. 170 Нм. Также тут встречается мотор Рено Н4М объемом 1.6 литра мощностью 110-113 л.с. 150-152 Нм.

Двигатель Лада Х-рей 1.6 литра

Этот силовой агрегат является адаптацией известного по Приоре мотора ВАЗ 21127 к ЕВРО 5, то есть дальним родственником агрегата 21083. Здесь конечно увеличенный рабочий объем, новая ГБЦ с парой распредвалов и гидрокомпенсаторами, впускной тракт переменной длины, а также датчик абсолютного давления и температуры воздуха вместо уже устаревшего ДМРВ.

Основными проблемами данного двигателя являются небольшой ресурс помпы, жор масла, троение на холодную и нередко лопающиеся расширительные бачки охлаждающей жидкости.

Первое время Lada Xray оснащалась силовым агрегатом от Renault-Nissan с индексом h5Mk, хорошо известным по ряду моделей франко-японского концерна. Этот алюминиевый мотор с цепным приводом ГРМ и фазорегулятором на впускном валу не имеет гидрокомпенсаторов, поэтому здесь требуется периодически производить регулировку тепловых зазоров клапанов.

Летом 2019 года франко-японский двс с индексом Н4М вернулся в модельную гамму в связи с установкой на X-RAY вариатора Jatco JF015E. Его мощность повысили до 113 л.с. и 152 Нм.

Список типичных неисправностей этого силового агрегата нельзя назвать слишком большим. Можно припомнить разве что проблемы с заводкой в сильный мороз, небольшой жор масла и нежное реле блока зажигания, а еще быстрый износ подушек двигателя и ремня генератора.

Хэтчбек до рестайлинга 2015 — 2019

	1.6 л 21129 МКП5	1.6 л h5M МКП5
Тип	инжектор	инжектор
Топливо	бензин АИ-92	бензин АИ-92
Расположение	поперечное	поперечное
Цилиндры	4 в ряд	4 в ряд
Клапана	16	16
Рабочий объем	1596 см³	1598 см³
Мощность	106 л.с.	110 л.с.
Крутящий момент	148 Нм	150 Нм
Разгон до 100 км/ч	11.4 с	11.1 с
Скорость (макс)	176 км/ч	181 км/ч
Экологич. класс	Евро 5	Евро 4
Расход город	9.3 л	8.9 л
Расход трасса	5.9 л	5.6 л
Расход смешанный	7.2 л	6.8 л

Технические характеристики Лада Х-Рей — расход топлива, размеры кузова, двигатели

Параметр	Лада Х-Рей 1.6 106 л.с.	Лада Х-Рей 1.8 122 л.с.
Двигатель
Код двигателя	21129	21179
Тип двигателя	бензиновый
Тип впрыска	распределенный
Наддув	нет
Количество цилиндров	4
Расположение цилиндров	рядное
Количество клапанов на цилиндр	4
Объем, куб. см.	1596	1774
Мощность, л.с. (при об/мин)	106 (5800)	122 (6050)
Крутящий момент, Н*м (при об/мин)	148 (4200)	170 (3700)
Трансмиссия
Привод	передний
Коробка передач	5МКПП	5МКПП	5РКПП
Подвеска
Тип передней подвески	независимая типа МакФерсон
Тип задней подвески	полузависимая
Тормозная система
Передние тормоза	дисковые вентилируемые
Задние тормоза	барабанные
Рулевое управление
Тип усилителя	электрический
Шины
Размер шин	185/65 R15 / 195/65 R15 / 205/55 R16 / 205/50 R17
Размер дисков	6.0Jx15 / 6.0Jx15 / 6.0Jx16 / 6.5Jx17
Топливо
Тип топлива	АИ-92
Экологический класс	Евро-5
Объем бака, л	50
Расход топлива
Городской цикл, л/100 км	9.3	9.3	8.6
Загородный цикл, л/100 км	5.9	5.8	5.8
Смешанный цикл, л/100 км	7.0	7.4	6.8
Габаритные размеры
Количество мест	5
Количество дверей	5
Длина, мм	4165
Ширина, мм	1764
Высота, мм	1570
Колесная база, мм	2592
Колея передних колес, мм	1484/1492
Колея задних колес, мм	1524/1532
Передний свес, мм	834
Задний свес, мм	739
Объем багажника (мин/макс), л	361/1207
Дорожный просвет (клиренс), мм	195
Масса
Снаряженная (мин/макс), кг	1190/1250
Полная, кг	1650
Максимальная масса прицепа (оборудованного тормозами), кг	800
Максимальная масса прицепа (не оборудованного тормозами), кг	600
Динамические характеристики
Максимальная скорость, км/ч	172	185	186
Время разгона до 100 км/ч, с	11.7	10.4	12.3

Технические характеристики новой Lada Xray 2021 года

Новинка АвтоВАЗа пришлась по вкусу на российском авторынке. Она достаточно быстро стала одним из самых популярных автомобилей отечественного рынка в 2021 году засчет своей относительно недорогой цены.

Компактный кроссовер или высокий хэтчбек лада х Рей имеет технические характеристики присущие современным иномаркам. Однако статус полноценного внедорожника мешает получить отсутствие полного привода. По своим характеристикам автомобиль скорее относятся к высокому хэтчбеку, поскольку обладает лишь передним приводом.

Технические характеристики лады Xray

Автоваз представил множество комплектаций, которые отличаются по техническим характеристикам. Основу составляют следующие особенности:

• Все модели оснащены бензиновыми двигателями разной мощности.
• На выходе машина, в среднем, получает 10,8 до сотни.
• Средний расход в городском цикле – 9,0.
• Классический передний привод, осуществленный на базе МакФерсон, что положительно отражается на цене ремонта.
• 195 мм честного клиренса (что, к слову, больше чем дорожный просвет у Сандеро).
• Важная техническая характеристика, которая позволила осуществить полноценный климат контроль и постоянный подогрев сидений – укомплектованность мощной аккумуляторной батареей.
• Коробка передач, в зависимости от комплектации, может быть механикой или роботом. Автомат не установлен ни на одной из комплектаций.
• Максимальная скорость – 170 км в час.

В ремонте технические аспекты не вызывают сложностей, так как все создано максимально просто, по проверенным временем технологиям.

ВАЗ-21129. Высокая экономичность

Главная изюминка данного ДВС – специально разработанная впускная система. Воздух, в отличие от классической схемы, при функционировании мотора на пониженных оборотах, подразумевает подачу в камеры сгорания по более длинным каналам. Когда количество оборотов повышается, система направляет воздух по коротким каналам. Оба варианта, следовательно, различаются разным составом и концентрацией смеси. Первый вариант – обедненная смесь, количество кислорода минимально. Второй вариант – насыщение кислородом, смесь обогащена. Сделано это для того, чтобы можно было поднять КПД двигателя, экономя бензин. Отказ от использования такой доработки позволил бы двигателю выдавать всего 98 л. с. вместо 106.

Данная модификация производится исключительно вместе с КПП от Renault (5 скоростей). Максимальная скорость, развиваемая кроссовером с двигателем 21129, достигает 170 километров в час.

Параметры ВАЗ-21129:

• Рабочий объем ДВС: 1,6 л.
• Кол-во цилиндров: 6 шт.
• Ко-во клапанов: 16
• Тип привода ДВС: ремень
• Диаметр цилиндра: 82 мм.
• Мощность: 106 л. с.

Lada XRay с таким мотором набирает 100 км/час за 11,9 секунд. Двигатель, как уже упоминалось, щадит кошелек водителя при заправке. Ниже расположена таблица расхода топлива для этой модификации ДВС:

Цикл	Расход (л)
Город	8,5
Смешанный режим	7,3
Трасса	5,7

Комплектации и их особенности

Сегодня всего представлено 5 различных комплектаций, которые существенно отличаются друг от друга. К основным комплектациям относятся:

• Оптима;
• Оптима Адванс;
• Люкс;
• Люкс Престиж;
• Юбилейная.

Все комплектации xRay имеют:

• Подушки безопасности водителя и переднего пассажира;
• Трёхточечные ремни безопасности для всех пассажиров и водителя.
• Систему ЭРА-Глонасс и систему автоматического открывания дверей во время ДТП;
• HWF-систему, которая отвечает за включение аварийной сигнализации во время экстренного торможения.

Расположение комплектаций соответствует их ценовой релевантности. С ростом цен, в салоне уменьшается количество ненатуральных составляющих, которые заменяются на более дорогие материалы.

В дополнение, производится оснащение различными дополнительными функциями, которые, в пересчете на самостоятельное оснащение, стоят весьма дорого. Так, в самой бедной комплектации нет практически ничего, однако переплачивать большую сумму за спорного качества дополнительное оборудование – дело личное каждого.

Комплектация	Двигатель	Цена
	бензиновый 1.6, 106 л.с.	599 900
	бензиновый 1.6, 106 л.с.	660 900
1.6 Optima Advanced MT	бензиновый 1.6, 122 л.с.	685 900
	бензиновый 1.8, 122 л.с.	710 900
	бензиновый 1.6, 106 л.с.	735 900
	бензиновый 1.6, 106 л.с.	739 900
1.8 Luxe MT	бензиновый 1.8, 122 л.с.	760 900
1.8 Luxe Prestige MT	бензиновый 1.8, 122 л.с.	773 900
	бензиновый 1.8, 122 л.с.	798 900
1.6 Юбилейная	бензиновый 1.6, 110 л.с.	799 000
1.6 Юбилейная AMT	бензиновый 1.6, 122 л.с.	829 000

Двигатель ВАЗ-21129

Этот мотор, предназначенный для установки на Lada Xray, отличается от аналогов особой системой впуска. Во время его работы на низких оборотах подача воздуха производится иначе – по удлиненным впускным каналам. В случае повышения оборотов воздух начинает поступать по коротким каналам. Вследствие чего изменяется состав и консистенция топливной смеси, в первом случае она является слабо насыщенной кислородом, а во втором наоборот. Такой принцип работы позволяет существенно увеличить мощность агрегата при сравнительно небольшом потреблении топлива. При отсутствии такой системы аналогичный аппарат выдает не более 98 лошадей.

Этот двигатель в Ладе Икс Рей будет выпускаться только в тандеме с коробкой передач от Рено, имеющей 5 скоростных передач. Силовой агрегат ВАЗ-21129 имеет следующие характеристики:

• объем – 1597 кубических сантиметров;
• цилиндры в количестве 4 штук;
• 16 клапанов;
• ременный привод;
• цилиндр имеет диаметр в 82 миллиметра;
• мощность – 106 л.с.

Лада Икс Рей, оснащенная таким движком, способна набирать скорость до ста км/ч за 11,9 сек. При таких параметрах автомобиль крайне экономичен. Циклы езды и потребление топлива:

Цикл	Расход (л)
Город	8,5
Смешанный режим	7,3
Трасса	5,7

При этом, Лада Икс Рей в сочетании с этим движком способна развить скорость до 170 км/ч.

Внутренний вид салона

Уж сколько раз твердили миру, что подлокотнику быть в машине, но Автоваз решил лишить водителей этого удобного атрибута. Так, пространство салона кажется несколько более просторным, но функционал от этого не выигрывает.

Касательно обивки – она не отличается роскошью, но выполнена в лучших традициях бюджетного авто, однако не стоит ждать боковой поддержки и полного комфорта, так как вылет подголовников составляет еще одну проблему машины. К слову, водителя будет оберегать подушка безопасности, которая удачно расположена в передней части авто. На задних сиденьях водители отмечают особый простор, который создается за счет функционального расположения багажника. Переднюю панель обрамляет дисплей, наделенный функциями бортового компьютера и отвечающий за множество других аспектов, способных сделать езду максимально комфортной.

Фото салона xRay

Гарабаритные размеры Лада х Рей

Лада была построена на платформе Рено Сандеро, которая уже проявила себя практичной и надежной. Производитель внес лишь в нее некоторые уникальные изменения. Так колесная база составила 2592 миллиметра.

Габаритная длинна и ширина машины составила 4165 и 1764 мм. Передняя колея 1492 миллиметра, а задняя 1532 миллиметра, что позволяет без особого труда покорять загородные дороги, не боясь увязнуть в грязи. Ширина дорожного просвета равна 195 миллиметрам. Общая масса полного автомобиля равна 1650 килограмм, порожняя – до 1200. Удачное распределение по осям в соотношении 51% к 49%. Спереди у автомобиля дисковые тормоза, сзади – барабанные.

Таблица ТТХ: Технические характеристики Lada XRay

Автомобиль Лада XRAY: Технические характеристики
Объем двигателя	1.6 (106 л.с.)	1.6 (114 л.с.)	1.8 (123 л.с.)
Тип кузова	5-дверный хэтчбек
Число мест	5
Длина, мм	4164
Ширина, мм	1764
Высота, мм	1570
Колесная база, мм	2592
Дорожный просвет (клиренс), мм	190
Снаряженная масса, кг	1140	1156	1135
Тип двигателя	бензиновый, с распределенным впрыском
Расположение	спереди, поперечно
Число и расположение цилиндров	4, в ряд
Рабочий объем, куб. см.	1596	1598	1774
Число клапанов	16	16	16
Максимальная мощность, л. с. (кВт) / об/мин	106 (78)	114 (84)	123 (90)
Максимальный крутящий момент, Нм / об/мин	148	155	178
Коробка передач	механическая, 5-ступенчатая
Привод	передний
Шины	195/65 R16, 205/55 R16
Максимальная скорость, км/ч	170	171	183
Время разгона 0-100 км/ч, с	11,9	10,3	10,9
Расход топлива в смешанном цикле, л/100 км	7,5	6,9	7,1
Емкость топливного бака, л	50
Тип топлива	бензин, АИ-95

Подробнее о Ладе «Икс Рей»

Технические данные Лада Х Рей – характеристики, объем двигателя, клиренс (фото, видео)

Обзор Лады Х Рей – оригинальный дизайн и технические характеристики

Коричневый Лада Х Рей – часть цветовой гаммы новой модельной линии Lada, фото, видео, отзывы

Оцинкован ли кузов новой Lada XRay?

Стоимость новой Лады Х Рей — дорого или доступно?

Размер кузова х Рея

Кузов
Колесная формула / ведущие колеса	4 x 2 / передние
Расположение двигателя	переднее поперечное
Тип кузова / количество дверей	кроссовер / 5
Количество мест	5
Длина / ширина / высота, мм	4165 / 1764 / 1570
База, мм	2592
Колея передних / задних колес, мм	1484…1492 / 1524…1532
Дорожный просвет, мм	195
Объем багажного отделения в пас. / груз. вариантах в л.	361 / 1207

То, что авто является продолжателем нашумевшей «х» серии, видно с первого взгляда. По бокам Xray красуются объемные иксы, которые придают автомобилю футуристический вид. В дополнение к боковым тиснениям кузова, разработчики также дополнили переднюю часть, с заходом на бампер, в которых также отчетливо читается происхождение авто от серии «Х». Говоря об эстетической составляющей – красиво, но практично ли?! В народе эту машину уже успели окрестить «кошмаром жестянщика», и на это есть веские причины. При малейшем повреждении геометрии части кузова, которая участвует в образовании знаменитого икса, владелец должен быть готов к тому, что полное восстановление будет возможно только по средствам приобретения новой части кузова.

Ни один, даже самый профессиональный жестянщик, не сможет, положив руку на сердце, гарантировать идеальный результат починки. Соответственно, кузов весьма нежен и требует аккуратного вождения, во избежание больших вливаний средств.

Статьи по теме: Тюнинг лада Икс Рей

[ads2]

Еще одним приятным моментом стала оптика. Сзади, под определенным углом, можно сказать, что новинка от Lada даже «отдает» Кайеном. К созданию оптики производители подошли с полной ответственностью, наделив машину качественным светом и стеклом.

Говоря о недостатках, которые владельцы успели выявить, следует выделить следующие пункты:

• первые модели выпускались со слишком маленьким радиусом дисков, вследствие чего авто теряло свой внешний вид – колесные арки «пустовали»;
• отсутствуют накладки на низ кузова.

Говоря об этих проблемах, следует упомянуть, что производитель назвал свое детище кроссовером, что обязывает к определенным требованиям. Так, даже при клиренсе, который превосходит прародителя (см. Х рей или Сандеро), отсутствие накладок не спасет машину от настоящего бездорожья. И дело даже не в том, базовая комплектация или иная – абсолютно все версии не приспособлены к трудностям, так как низ кузова будет нещадно обрамлен сколами, на крашеном покрытии.

Lada XRay: технические характеристики

Платформа для машины была взята от Renault Sandero, что уже означает энергоёмкость, отличную управляемость и высокий дорожный просвет Лада Х Рей. Днище и силовая составляющая изменились мало. Кузов получил увеличенную жёсткость благодаря подрамнику, который выполняет ещё и другие важные функции. Доработке подверглись подвеска, кузов и некоторые составляющие. Изменилась линейка двигателей.

Модельный ряд будет представлен только типом кузова «хэтчбек», «универсал» и «седан» не предусмотрены. Кузов спроектирован с помощью Рено и Ниссан при использовании инновационных цифровых технологий. При общей платформе с другими моделями АВТОВАЗа производители попытались добиться максимальных внешних различий и улучшения технических характеристик.

Заявлено, что в конструкции присутствует около 600 оригинальных деталей, которые впервые используются на ВАЗе. Производитель планирует, что более 70% комплектующих будет изготавливаться на российских заводах.

Габаритные размеры Лада Х Рей

Габариты Лада Х Рей:

• Длина/ширина/высота – 4165/1764/1570 мм.
• Величина колёсной базы составляет 2592 мм.
• Размер колеи передних/задних колес – 1484/1524 мм с колёсами R16 и 1492/1532 мм с колёсами R15.
• Клиренс Лада Х Рей составляет 195 мм в незагруженном состоянии и 170 мм при максимальной загрузке.
• Масса распределяется между осями в соотношении: передняя – 51%, задняя – 49%.
• Передний/задний свесы – 830/743 мм.
• Величины углов въезда/съезда – 21/34° (без загрузки).

Как видим, ХРей Лада, размеры которой мы привели выше, можно отнести к переднеприводным компактным кроссоверам.

Подвеска Лада Х Рей

Передняя подвеска Лада Х Рей – независимая, типа МакФерсон. Она имеет существенные отличия от всех выпускаемых сегодня переднеприводных моделей Лада. В доработанной подвеске появись рычаги, которые крепятся к подрамнику посредством сайлентблоков. На конце рычага – шаровый палец. Задняя подвеска – полузависимая скручиваемая балка. Такая подвеска надёжна и улучшает ходовые качества.

Какой двигатель стоит на Лада Х Рей?

Производитель остановился на трёх возможных вариантах двигателей. Все они бензиновые и достаточно мощные:

• Базовый ВАЗ-21129, хорошо зарекомендовавший себя и широко используемый в других моделях АВТОВАЗа.
• Модернизация системы впуска позволила увеличить мощность двигателя с 98 л.с. до 106 л.с. При низких оборотах подача воздуха осуществляется по длинным впускным каналам, а при высоких – по коротким, что обеспечивает изменение состава топливной смеси. Двигатель работает с 5-ступенчатой коробкой передач от Renault, которую собирают на АВТОВАЗе.
• Бензиновый двигатель, разработанный Рено-Ниссан (у Ниссан он называется HR16, у Рено – h5M). Разработка 2006 года массово устанавливается на автомобили Двигатель работает в тандеме с 5-МКПП от Рено.
• Современный и самый мощный двигатель ВАЗ-21128. Характеристики двигателя были улучшены посредством модернизации, направленной на увеличение хода поршня. Используется шатунно-поршневая группа от компании Federal-Mogul, производство осуществляет дочернее предприятие АВТОВАЗа.

Двигатель работает в паре с роботизированной автоматической трансмиссией. АМТ (коробка-робот) является отечественной разработкой. За основу была взята ВАЗовская МКПП, а над управляющей электроникой поработала немецкая компания ZF. Коробку собирают в Тольятти.

Варианты двигателей Lada Xray

В АвтоВАЗе было принято решение выпустить новый автомобиль с тремя вариантами моторов:

• HR4 – 1.6 л. двигатель, мощностью 110 л.с. имеет самый низкий расход топлива, всего 6.9 литра на 100 км. пути в смешанном стиле вождения. Разогнать новую Ладу с места до 100 км/ч он может за 10.3 секунды, а предельная скорость составляет 171 км/ч. Этот двигатель также устанавливается на Ниссан Сентара, но обладает дополнительными 4 л.с. мощности (установка двигателя на Lada xRay прекращена в 2021 году)
• 21129 – 1.6 л. двигатель обладает мощностью 106 л.с. Расход топлива у данного мотора самый высокий среди представленных вариантов, и составляет 7.5 литров. Максимальная скорость 170 км/ч, а разгон с места до ста занимает 11.9 секунд. Отличительной особенностью данного мотора стала французская механическая коробка передач х рей. Решиться на такую замену пришлось из-за высокой шумности ВАЗовского варианта механики.
• 21179 – 1.8 л. двигатель является ТОПовым вариантом для xRay, он выдает мощность в 122 л.с. Разгон до ста 10.9 секунды при максимальной скорости в 183 км/ч. Однако максимальныt показатели не стали причиной максимального расхода топлива, на 100 км/ч расход составил только 7.1 литра.

Lada (ВАЗ) XRay / Лада XRay

XRay: параметры, тесты (тестдрайв, краштест), отзывы, автосалоны, фото, видео, новости.

Лада XRay

— начало выпуска 2021 г. В нем сочетается стиль и новые технологии, благодаря разработкам компании Лада вы получаете отличный коктейль из отличного дизайна и высоких технических показателей. Среди существующих базовых цветов XRay вы легко найдете тот что вас устроит, но скорее всего можно и подобрать под заказ. У нас вероятнее всего представлены не все комплектации этой модели Лада XRay, среди которых представлены различные варианты сборки XRay: коробка переключения передач может быть автоматической или механической, отделка салона кожой или вставки дерева, диски и другие дополнительные элементы кузова XRay, которые непременно отразятся в цене XRay. Техничекая характеристика это хорошо, но не забываем о безопасности XRay или объеме двигателя который потом даст о себе знать по затратам в эксплуатации в будущем, а так же ремонт XRay и техническое обслуживание с гарантийным сроком. Так как преобретение производится не на несколько месяцев, а на несколько лет, поэтому предусмотрите для себя что вы будете делать в летний и зимний период,
какие поездки совершать на XRay
. Ниже в таблице приведены в сравнении несколько комплектаций XRay, среди параметров отражены: какие габаритные размеры у XRay, какой расход топлива по городу, трассе или смешанный, объем двигателя, максимальная скорость и время разгона до 100 км/час, снаряженная или полная масса XRay, колесная база, колея передних и задних колес, тип трансмиссии (кпп/какая коробка передач), какой привод, размер шин, какая мощность или крутящий момент и какая цена. Помимо всех цифр можно прочитать отзывы автовладельцев о XRay, просмотреть видео или новости, тесты (тестдрайв, краштест).

Багажник Лады Икс Рей

Хотя объем – это не один из главных показателей практичности багажного отделения. Общее пространство является не менее важным критерием. В лада х рей скрыты колесные арки, что делает пол идеально ровным и более вместительным, нежели в других марках автомобилей. Получается, что каждый сантиметр багажника будет использован по прямому его назначению.

Верх багажного отделения ограничивается и отделяется специальной пластиковой полкой багажника. Конечно же, при необходимости ее можно демонтировать под самое стекло, но в этом случае нужно быть аккуратным, дабы не разбить его.

Также, в багажнике имеется дополнительная функция – двойной пол лада х Рей. При этом на верхней части есть специальные фиксаторы и ремни, благодаря которым можно надежно прикрепить груз во время транспортировки во избежание его поломки.

Было бы преимущественно хорошо, если бы при сложенном заднем диване образовывался полностью ровный пол багажника. Ведь спинка дивана устанавливается под небольшим углом. Хотя этого все-таки можно избежать, убрав подушки заднего кресла. Багажник Lada xRay практически одинаковый по размеру и своему объему с автомобилем Лада Калина.

При разложенном заднем диване, в багажник вполне можно разместить запасное колесо, ряд инструментов и других личных вещей водителя.

Дизайн Лада Х Рей 2016-2017

Передняя часть автомобиля смело заслуживает пятёрки. Если не обращать внимания на габаритные размеры, то оценив автомобиль с этого ракурса впервые можно подумать, что пред нашим взором предстал тяжелоатлет с мощным телосложением.

Лада Икс Рей 2016-2017, вид спереди

Но осматривая дальше иллюзия становится очевидной. На темном фоне спереди можно увидеть целостный образ буквы «Х» это уже вошло в моду и появилось на новых кроссоверах Lexus RX, Mitsubishi Outlander. Отлично смотрится и световая оптика, представляющая собой по форме неправильный четырёхугольник. Дополнительное освещение выполнено в форме бумеранга. Нижняя часть бампера перекрывается защитой, что позволяет кроссоверу двигаться в совершенно различных условиях.

Новая Икс Рэй 2016-2017, вид сбоку

Линейности на боковых частях ещё более выражено, чем спереди. Завихрения начинаются от фар спереди и сзади и доходят до колёс. Двери новинки резкие, с остренькими углами по краям. На нижней части двери красуется хромированный обод, располагающийся до колёсных арок. Размер боковых стекол второго ряда маловат и не очень впечатляет. Порадовать Лада может крупными колёсными арками, хотя установленные на серийную модель небольшого размера колеса уже не так впечатляют как это было у концепта. Зато клиренс выдался отличный для езды в условиях бездорожья.

Lada XRay, вид сзади

На крыше сзади имеется козырек с функцией дополнительной подсветки. Бампер внушительного размера. Основную часть сзади занимает дверь багажного отделения. Фары бумерангообразной формы, одна из частей заползает на дверь багажника, а вторая на корпус машины. Окно сзади выполнено в темных оттенках, посередине красуется логотип фирмы. Выхлопные трубы по форме напоминают параллелограмм. В качестве окраски кузова доступны следующие варианты: белый, огненно — красный, серо — бежевый, черный металлик и серебристо — бежевый.

Коробка передач в Lada xRay и ее особенности.

В паре со 110-ти и 106-ти сильными моторами АвтоВАЗ решил установить пятиступенчатую механическую коробку передач. Однако только на 110-сильный мотор будет установлена родная механика, 106-сильный мотор будет обладать французским аналогом с доработками автоконцерна. На самый мощный вариант двигателя будет установлен автомат х рей, над которым серьезно поработала компания ZF. Трансмиссия выполнена в лучших традициях качества. На выбор предлагаются вариант с механической КПП и роботизированной коробкой автомат.

В обоих вариантах владельцы отмечают приемистость авто, которое словно подстраивается под водителя. Рулевое управление четкое – машина реагирует на приложенные усилия без задержек. Отмечается чрезвычайная живучесть рулевой рейки, которая несколько туговата для авто данного веса, однако в ходе знакомства, чувствуется что она подстроена под особенности управления.

Подвеска Х Рея

В Lada xRay установлена независимая подвеска МакФерсон. Данная подвеска в х рей значительно повышает управляемость авто, а простота подвески завоевала имя самой надежной на отечественном рынке.

Чувствительность автомобиля в поворотах повышена благодаря креплению ступицы к кузову при помощи рычагов и шарниров. В подвеске нет ничего необычного – она полностью скопирована (за исключением клиренса) с Сандеро.

Типичные передние МакФерсон и задняя полузависимая не привносят особого комфорта, но и не страдают болезнями многорычажек, которые дорого обходятся любителям эксплуатации нежного оборудования на российских дорогах.

Из минусов, необходимо отметить слабоватую поперечную устойчивость. Так, при определенной скорости, машина всем своим поведением будет намекать на то, что она не создана для маневренной езды.

Если вы любитель резко входить в повороты – этот авто не для вас. При сильных перегрузах водитель будет ощущать определенные вибрации, которые будут свидетельствовать о серьезном крене, поэтому можно сделать вывод, что на этой машине комфортнее ездить по прямым дорогам.

Здесь были установлены L-образные рычаги на подобии спортивных моделей автомобилей. Они изготовлены из высокопрочной стали и чугуна, что позволяет прослужить этому элементу долгие годы. Такие же рычаги устанавливаются на Приору, Калину и Гранту.

Задняя подвеска использует торсионно-рычажный вариант крепления. К ее преимуществам можно отнести лучшие кинематические характеристики, простота в обслуживании, а также низкую массу. В перспективе имеется проект полного привода в автомобиле, выпуск которого намечен на 2021 год.

Главной особенностью подвески в х Рей является не возможность полного отключения противобуксовочной TCS системы. Ее недостатки особенно сильно проявляются зимой, поскольку во время пробуксовки на снегу, система блокирует колесо, что только усугубит ситуацию. В паре с этой системой работает АБС и система курсовой устойчивости ESC.

Похожие статьи:

Лада х рей фото цены характеристики комплектации

Похожие записи

Причина, по которой Автоваз исключает двигатель 1.8 у Lada Vesta

Lada Xray Cross Instinct – детальный обзор комплектации

Характеристики ВАЗ Xray

Показ предсерийной версии Lada XRAY состоялся в рамках выставки Moscow Off-Road Show в августе 2014 года. В начале ноября 2015 года производитель представил серийный вариант, а в середине декабря в Тольятти стартовал конвейерный выпуск модели.

«АвтоВАЗ» позиционирует Lada XRAY как хэтчбек B-класса, выполненный в стиле SUV. В основе автомобиля лежит переднеприводная платформа «B0», позаимствованная у партнеров Renault-Nissan. Это же шасси легло в основу автомобилей Renault Sandero Stepway и Logan. Длина хэтчбека составляет 4164 мм, ширина – 1764 мм, высота – 1570 мм, колесная база – 2592 мм. Клиренс равен 195 мм в «походном» состоянии (при полной загрузке – 170 мм).

Дизайн экстерьера Lada XRAY спроектирован российскими разработчиками под руководством Стива Маттина. Основная «фишка» внешности – Х-образная фронтальная часть кузова и аналогичное оформление боковых панелей кузова. Сильно наклоненное ветровое стекло, короткие свесы и покатая крыша добавляют силуэту динамичности. Гармонично смотрится узкая головная оптика, выполненная в форме неправильного четырехугольника. Корма хэтчбека выглядит аккуратно и подтянуто за счет фонарей в форме бумеранга, компактной крышки багажника и бампера с накладкой из некрашеного пластика. Дизайнерам удалось создать образ не лишенный индивидуальности.

Интерьер Lada XRAY получился лаконичным и продуманным. Приборы помещены в три «колодца», с правой стороны располагается дисплей бортового компьютера. Рулевое колесо с четырехспицевым дизайном получило выраженный рельеф, а в «топовых» версиях несет клавиши управления мультимедийными функциями. Отсутствует регулировка руля по вылету, что частично компенсирует регулировка по высоте водительского кресла.

Эргономика водительского места на достойном уровне. На передней панели нет лишних деталей и кнопок. По центру расположился 7-дюймовый экран информационно-развлекательного комплекса. Ниже разместили миниатюрный блок «климата». Но это в «насыщенных» комплектациях, базовая версия предлагает магнитолу и кругляши «печки» или кондиционера.

В отделке хэтчбека использован преимущественно жесткий, но текстурный пластик, сиденья обтянуты приятной на ощупь и качественной тканью. К подгонке элементов торпедо, обивки дверей и других частей салона нареканий нет. Шумоизоляция на порядок выше, чем у машин, ранее выпускавшихся автоконцерном.

Кресла передних пассажиров имеют большой диапазон регулировок, но слабовыраженную боковую поддержку. Задний диван грамотно спрофилирован и предлагает седокам достаточный запас пространства, но втроем на нем тесновато.

Специальные боксы для хранения вещей помогут рационально использовать внутреннее пространство: в дверях – объемные карманы с подстаканниками, под передним пассажирским сиденьем – выдвигающийся бокс, а под центральной консолью – пара ниш и еще несколько подстаканников.

Объем багажника хэтчбека равен 376 литров, а при сложенных спинках заднего дивана размер отсека увеличивается до 1382 л. При этом получается ровная площадка, а под фальшполом скрывается «подполье». На дне лежит полноценная 15-дюймовая «запаска», хотя стандартно автомобиль оснащается колесами R16.

Базовым силовым агрегатом стал 16-клапанный двигатель объемом 1,6 литра мощностью 106 л.с. Он работает в паре с 5-ступенчатой «механикой» производства Renault и разгоняет автомобиль до 100 км/ч за 11,9 с. Расход топлива в смешанном цикле – 7,5 литра на «сотню».

Промежуточный вариант силовой установки представлен 1,6-литровым мотором мощностью 114 л.с. Он также комплектуется МКПП на 5 ступеней. Заявленный средний расход топлива – 6,9 литра на 100 км. Разгон до сотни занимает 10,3 секунды.

Топовым стал 123-сильный мотор рабочим объемом 1,8 литра, который уже опробовали на модели Priora. Этот двигатель сочетается с 5-диапазонной роботизированной трансмиссией, потребляя в среднем 7,1 л на 100 км. Динамика – 10,9 секунды на разгон с места до 100 км/ч.

Передняя ось хэтчбека XRAY укомплектована независимой подвеской со стойками типа McPherson, а задняя ось – полунезависимой архитектурой с балкой кручения. Рулевой механизм имеет реечное строение с интегрированным электрогидравлическим усилителем управления. На колесах спереди монтированы вентилируемые диски тормозной системы, сзади – барабанные устройства.

Для Lada XRAY (на старте продаж) предусмотрено две основные комплектации – «Optima» и «Top». Плюс два дополнительных пакета – «Comfort» и «Prestige».

В список оснащения базовой версии входят: две фронтальные подушки безопасности, иммобилайзер, бортовой компьютер, дневные ходовые огни, ABS с EBD, функция стабилизации (ESV), технология помощи при старте в гору, электрогидравлический усилитель руля, система ЭРА-ГЛОНАСС, электрические стеклоподъемники на передних дверях, «музыка» с четырьмя динамиками и 16-дюймовые диски.

Автомобиль в версии «Optima» + «Comfort» в дополнение к базовому оборудованию получает кондиционер, подогрев передних кресел и охлаждаемый вещевой ящик.

Исполнение «Top» предлагает: противотуманные фары, задние электростеклоподъемники, электропривод и электрообогрев наружных зеркал, датчики парковки сзади, мультимедийный комплекс с сенсорным 7-дюймовым дисплеем, навигацию.

В арсенале комплектации «Top» + «Prestige» есть: обогрев ветрового стекла, климат-контроль, датчики дождя и света, камера заднего вида и усиленная тонировка стекол.

Пока производитель предлагает XRAY только с передним приводом. Но на этом останавливаться не собирается, так как планирует запустить в серию еще одну модели – XRAY Cross, которая как раз получит полный привод.

Итоги

Таким образом, машина уникальна в своей природе. Являясь новым дыханием Лады, она действительно заслужила свое законное место в сердцах автолюбителей.

С одной стороны, отсутствие новейших технологий может расстроить притязательного владельца, с другой – значительно уменьшает итоговый чек за обслуживание и ремонт (конечно, если только речь не идет о кузовном ремонте, который по стоимости будет бить все рекорды).

Разнообразие начинок и стремление к совершенству однозначно заслуживают уважения и похвалы производителя, в действиях которого проявляется стремление угодить своему покупателю.

В целом модель Lada xRay получилась весьма удачной, и быстро завоевывает популярность на российском рынке.

Статьи по теме: х-Рей против конкурентов: тест драйв xRay и Renault Sandero

Лада х рей фото

Технические характеристики Лада Икс Рей (ВАЗ (Lada) Xray) 2020 годов выпуска

ВАЗ (Lada) Xray #Club 1.6 MT механика бензин хэтчбек, 1596 см3, 106 л.с., 2015 — 2020 г.в	хэтчбек	1596 см3	106 л.с.	2015 — 2020
ВАЗ (Lada) Xray Advansed 1.6 MT механика бензин хэтчбек, 1596 см3, 106 л.с., 2015 — 2018 г.в	хэтчбек	1596 см3	106 л.с.	2015 — 2018
ВАЗ (Lada) Xray Classic 1.6 MT механика бензин хэтчбек, 1596 см3, 106 л.с., 2015 — 2020 г.в	хэтчбек	1596 см3	106 л.с.	2015 — 2020
ВАЗ (Lada) Xray Classic Air conditioner 1.6 МТ механика бензин хэтчбек, 1596 см3, 106 л.с., 2015 — 2020 г.в	хэтчбек	1596 см3	106 л.с.	2015 — 2020
ВАЗ (Lada) Xray Comfort 1.6 MT механика бензин хэтчбек, 1596 см3, 106 л.с., 2015 — 2020 г.в	хэтчбек	1596 см3	106 л.с.	2015 — 2020
ВАЗ (Lada) Xray Luxe 1.6 MT механика бензин хэтчбек, 1596 см3, 106 л.с., 2015 — 2020 г.в	хэтчбек	1596 см3	106 л.с.	2015 — 2020
ВАЗ (Lada) Xray Luxe Prestige 1.6 MT механика бензин хэтчбек, 1596 см3, 106 л.с., 2015 — 2020 г.в	хэтчбек	1596 см3	106 л.с.	2015 — 2020
ВАЗ (Lada) Xray Optima 1.6 MT механика бензин хэтчбек, 1596 см3, 106 л.с., 2015 — 2019 г.в	хэтчбек	1596 см3	106 л.с.	2015 — 2019
ВАЗ (Lada) Xray Optima Air Conditioner 1.6 MT механика бензин хэтчбек, 1596 см3, 106 л.с., 2015 — 2019 г.в	хэтчбек	1596 см3	106 л.с.	2015 — 2019
ВАЗ (Lada) Xray Standart 1.6 MT механика бензин хэтчбек, 1596 см3, 106 л.с., 2015 — 2020 г.в	хэтчбек	1596 см3	106 л.с.	2015 — 2020
ВАЗ (Lada) Xray Top 1.6 MT механика бензин хэтчбек, 1596 см3, 106 л.с., 2015 — 2017 г.в	хэтчбек	1596 см3	106 л.с.	2015 — 2017
ВАЗ (Lada) Xray Optima 1.6 MT механика бензин хэтчбек, 1598 см3, 110 л.с., 2015 — 2015 г.в	хэтчбек	1598 см3	110 л.с.	2015 — 2015
ВАЗ (Lada) Xray top 1.6 MT механика бензин хэтчбек, 1598 см3, 110 л.с., 2015 — 2015 г.в	хэтчбек	1598 см3	110 л.с.	2015 — 2015
ВАЗ (Lada) Xray Юбилейная 1.6 MT механика бензин хэтчбек, 1598 см3, 110 л.с., 2015 — 2017 г.в	хэтчбек	1598 см3	110 л.с.	2015 — 2017
ВАЗ (Lada) Xray #Club 1.8 AMT робот бензин хэтчбек, 1774 см3, 122 л.с., 2015 — 2020 г.в	хэтчбек	1774 см3	122 л.с.	2015 — 2020
ВАЗ (Lada) Xray #Club 1.8 MT механика бензин хэтчбек, 1774 см3, 122 л.с., 2015 — 2020 г.в	хэтчбек	1774 см3	122 л.с.	2015 — 2020
ВАЗ (Lada) Xray Advanced 1.8 AMT робот бензин хэтчбек, 1774 см3, 122 л.с., 2015 — 2018 г.в	хэтчбек	1774 см3	122 л.с.	2015 — 2018
ВАЗ (Lada) Xray Advanced 1.8 MT механика бензин хэтчбек, 1774 см3, 122 л.с., 2015 — 2018 г.в	хэтчбек	1774 см3	122 л.с.	2015 — 2018
ВАЗ (Lada) Xray Comfort 1.8 AMT робот бензин хэтчбек, 1800 см3, 122 л.с., 2015 — 2020 г.в	хэтчбек	1800 см3	122 л.с.	2015 — 2020
ВАЗ (Lada) Xray Comfort 1.8 MT механика бензин хэтчбек, 1774 см3, 122 л.с., 2015 — 2020 г.в	хэтчбек	1774 см3	122 л.с.	2015 — 2020
ВАЗ (Lada) Xray Exclusive 1.8 AMT робот бензин хэтчбек, 1774 см3, 122 л.с., 2015 — 2019 г.в	хэтчбек	1774 см3	122 л.с.	2015 — 2019
ВАЗ (Lada) Xray Exclusive 1.8 MT механика бензин хэтчбек, 1774 см3, 122 л.с., 2015 — 2019 г.в	хэтчбек	1774 см3	122 л.с.	2015 — 2019
ВАЗ (Lada) Xray Luxe 1.8 AMT робот бензин хэтчбек, 1774 см3, 122 л.с., 2015 — 2019 г.в	хэтчбек	1774 см3	122 л.с.	2015 — 2019
ВАЗ (Lada) Xray Luxe 1.8 MT механика бензин хэтчбек, 1774 см3, 122 л.с., 2015 — 2020 г.в	хэтчбек	1774 см3	122 л.с.	2015 — 2020
ВАЗ (Lada) Xray Luxe Prestige 1.8 AMT робот бензин хэтчбек, 1774 см3, 122 л.с., 2015 — 2020 г.в	хэтчбек	1774 см3	122 л.с.	2015 — 2020
ВАЗ (Lada) Xray Luxe Prestige 1.8 MT механика бензин хэтчбек, 1774 см3, 122 л.с., 2015 — 2020 г.в	хэтчбек	1774 см3	122 л.с.	2015 — 2020
ВАЗ (Lada) Xray Optima 1.8 AMT робот бензин хэтчбек, 1774 см3, 122 л.с., 2015 — 2018 г.в	хэтчбек	1774 см3	122 л.с.	2015 — 2018
ВАЗ (Lada) Xray Optima 1.8 MT механика бензин хэтчбек, 1774 см3, 122 л.с., 2015 — 2018 г.в	хэтчбек	1774 см3	122 л.с.	2015 — 2018
ВАЗ (Lada) Xray Optima Air Conditioner 1.8 AMT робот бензин хэтчбек, 1774 см3, 122 л.с., 2015 — 2019 г.в	хэтчбек	1774 см3	122 л.с.	2015 — 2019
ВАЗ (Lada) Xray Optima Air Conditioner 1.8 MT механика бензин хэтчбек, 1774 см3, 122 л.с., 2015 — 2019 г.в	хэтчбек	1774 см3	122 л.с.	2015 — 2019
ВАЗ (Lada) Xray Prestige 1.8 AMT робот бензин хэтчбек, 1774 см3, 122 л.с., 2015 — 2018 г.в	хэтчбек	1774 см3	122 л.с.	2015 — 2018
ВАЗ (Lada) Xray Top 1.8 AMT робот бензин хэтчбек, 1774 см3, 122 л.с., 2015 — 2017 г.в	хэтчбек	1774 см3	122 л.с.	2015 — 2017
ВАЗ (Lada) Xray Юбилейная 1.6 АМТ робот бензин хэтчбек, 1800 см3, 122 л.с., 2015 — 2017 г.в	хэтчбек	1800 см3	122 л.с.	2015 — 2017

Lada Xray технические характеристики

Эксплуатационные характеристики Лада Икс Рей

Максимальная скорость: 176 км/ч
Время разгона до 100 км/ч: 11.4 c
Расход топлива на 100км по городу: 9.3 л
Расход топлива на 100км по трассе: 5.9 л
Расход топлива на 100км в смешанном цикле: 7.2 л
Объем бензобака: 50 л
Снаряженная масса автомобиля: 1190 кг
Допустимая полная масса: 1650 кг
Размер шин: 195/65 R15, 205/55 R16, 205/50 R17

Характеристики двигателя

Тип двигателя: бензиновый
Расположение: спереди, поперечно
Объем двигателя: 1596 см3
Мощность: 106 л.с.
Количество оборотов: 5800
Крутящий момент: 148/4200 н*м
Система питания: Распределенный впрыск (многоточечный)
Турбонаддув: нет
Расположение цилиндров: Рядный
Количество цилиндров: 4
Диаметр цилиндра: 82 мм
Ход поршня: 75.6 мм
Степень сжатия: 10.5
Количество клапанов на цилиндр: 4
Рекомендуемое топливо: АИ-95

Модификации двигателя

Комплектация	Двигатель	Коробка	Привод
Optima	1.6 106 л.c. бензин	механика	передний
Optima Advanced	1.6 106 л.c. бензин	механика	передний
Optima Advanced	1.8 122 л.c. бензин	механика	передний
Optima Advanced	1.8 122 л.c. бензин	робот	передний
Luxe	1.6 106 л.c. бензин	механика	передний
Luxe	1.8 122 л.c. бензин	механика	передний
Luxe	1.8 122 л.c. бензин	робот	передний
Top	1.6 106 л.c. бензин	механика	передний
Luxe Prestige	1.8 122 л.c. бензин	механика	передний
Luxe Prestige	1.8 122 л.c. бензин	робот	передний
Top Юбилейная	1.6 110 л.c. бензин	механика	передний
Top Юбилейная	1.8 122 л.c. бензин	робот	передний

Тормозная система

Передние тормоза: Дисковые вентилируемые
Задние тормоза: Барабанные
АБС: есть

Рулевое управление

Тип рулевого управления: Шестерня-рейка
Усилитель руля: есть

Трансмиссия

Привод: Передний
Количество передач: механическая коробка — 5, робот — 5

Подвеска

Передняя подвеска: независимая, пружинная
Задняя подвеска: полунезависимая, пружинная

Кузов

Тип кузова: хэтчбек
Количество дверей: 5
Количество мест: 5
Длина машины: 4165 мм
Ширина машины: 1764 мм
Высота машины: 1570 мм
Колесная база: 2592 мм
Колея передняя: 1484 мм
Колея задняя: 1524 мм
Дорожный просвет (клиренс): 195 мм
Объем багажника: 361 — 1207 л

Производство

Год выпуска: с 2015

Технические характеристики новой Lada X-RAY

Автомобиль Лада Х-Рей – первый отечественный кроссовер, выпущенный АвтоВАЗом еще летом, 2012 года. Над созданием его дизайна работали как наши инженеры, так и коллеги из Италии. В 2014 году, модель Lada X-REY выступила на московской выставке, в качестве главного экспоната, собрав на себе большое количество взглядов и внимания. Для того, чтоб узнать данный кроссовер получше, давайте проведем его обзор в данной статье.

Двигатель и трансмиссия

Технические характеристики двигателя xrey имеют три заводские вариации, обзор которых вы сможете увидеть далее. Самая первая, с наиболее низкой мощностью – 16-ти клапанный бензиновый мотор, рабочим объемом 1,6 литра. При его максимальной нагрузке, кроссовер мог развивать до 170 км/час максимальной скорости, и получать до 106 лошадиных сил мощности. Такие характеристики достигались при вращении коленчатого вала, со скоростью 5800 об/мин.

Максимально эффективный крутящий момент двигателя xrey, достигался на 4200 об/мин, а далее мотор работает через силу. Даже несмотря на то, что Лада Х-Рей – это кроссовер, до первой сотни он доходил, буквально за 11,9 секунды. Такие характеристики не сильно отличались от характеристик отечественного седана, такого как Лада Веста или Гранта.

Что касается расхода топлива, на каждую сотню, то он не превышал 7,5 литров, при работе в смешанном режиме. Рекомендуемый бензин для двигателя Lada X-REY – не менее АИ – 95. Данная комплектация оснащалась 5-ти ступенчатой механической коробкой передач. Максимальный объем топливного бака всех вариаций – 50 литров. На этом, обзор первого варианта двигателя xrey окончен, и можно переходить ко второму.

Второй вариант мотора Лада Х-Рей, имеет практически такие же технические характеристики, как и первый. Его рабочий объем – 1600 кубов, а количество клапанов – 16. При максимальной работе второй вариации мотора, кроссовер Lada X-REY сможет развить 171 км/час, что вовсе не ощущается по сравнению с первым вариантом. Мощность, также увеличена не существенно – 110 лошадей, вместо 106.

Плюс второй вариации xrey в том, что его максимальные технические характеристики достигаются при меньшей скорости вращения коленчатого вала – при 5500 об/мин, тем самым экономя на каждой сотне пробега по 0,6 литра бензина, что значительно ощущается при длительных поездках.

Максимальный крутящий момент Lada X-REY, во втором варианте мотора, также уменьшен до 4000 тыс., что позволяет машине разгонятся до сотни быстрее – за 10,3 секунды. Данная модификация, также имеет 5-ти ступенчатую механику. Обзор второго варианта также завершен, и мы переходим к последнему, самому мощному варианту мотора xrey.

Технические характеристики третьей вариации мотора Лада Х-Рей, значительно отличаются от предыдущих. Рабочий объем всех четырех цилиндров, составляет 1800 кубических сантиметров, а количество клапанов, также равно 16-ти. При максимальной нагрузке такого агрегата, кроссовер достигает максимальной скорости в 183 км/час, и развивает номинальную мощность в 122 лошадиные силы, что на 12 лошадей больше, чем во второй вариации.

Максимальный крутящий момент, Lada X-REY получает при скорости вращения коленчатого вала, в 6000 об/мин. При этом, машина потребляет около 7,1 литра топлива, на каждую сотню километров пробега. Как нам показал обзор предыдущих вариантов, разница практически не значительная.

Разгон до первой сотни, занимает порядка 10,9 секунд. Такой показатель довольно высокий, учитывая тип кузова xrey. Данная модификация, в отличии от предыдущих, оснащена автоматической коробкой передач, имеющей 5 ступеней. На этом, обзор модификаций моторов окончен, и теперь давайте изучим остальные характеристики Lada X-REY, такие как: максимально допустимый вес, габаритные размеры, и т.д.

Кузов и грузоподъемность

Машина Лада Х-Рей, имеет кузов, типа: 5-ти дверный хэтчбек. Ее габаритные размеры, очень схожие с размерами Renault Sandero. Длина кузова xrey, достигает 4165 мм, ширина – 1764 мм, а высота – 1570 мм. даже несмотря на то, что Lada X-REY – это кроссовер, его высота всего на 70 мм больше, чем у стандартного отечественного седана.

Большой плюс данной модели – высокий клиренс – 195 мм. Он позволяет преодолевать значительные препятствия на бездорожье, а также высокие бордюры в городе. Кстати, клиренс у Renault Sandero имеет точно такие же размеры, как и у xrey.

Lada X-REY базовой версии, выпускается в двух вариациях колес – R15 и R16. При этом, размеры колеи у обоих вариаций, будут несколько разные. При варианте в R15, размеры передней колеи будут равны 1592 мм, а задней – 1532 мм. А вот при варианте в R16, передняя колея будет иметь 1484 мм, и задняя – 1524 мм. На этом, обзор габаритов окончен, и можно перейти к грузоподъемности.

Максимально допустимый вес, который способен «поднять» xrey, равен 590 кг. Сам же вес автомобиля довольно невелик – всего 1190 кг. В цифру 590 кг, входит вес всех пассажиров, и вес груза, положенного в багажное отделение, объемом 350 литров.

Нагрузка на обе оси автомобиля Лада Х-Рей, распределена примерно так: 51 % на переднюю ось, и 49 % веса на заднюю ось. То есть, вес автомобиля, практически поровну разделен между обеими осями, что дает машине преимущество на бездорожье.

Также, на модель Lada X-REY предусмотрено прицепное устройство, позволяющее перевозить дополнительный груз, вес которого не будет превышать 300 кг. Конечно, при подсоединении прицепа, длина машины значительно увеличится, и снизится ее маневренность. Кстати, стоит отметить, что дополнительный вес на прицепном устройстве, практически не влияет на клиренс. На этом, обзор габаритов Лада Х-Рей завершен.

Подводя итоги…

Проведя детальный обзор автомобиля Lada X-REY, можно сделать некоторые выводы. При разработке данной модели, инженеры максимально постарались над вариациями мотора, которые позволяют выдавать такие же характеристики, как и у отечественных седанов, последнего поколения.

Также, несмотря на то, что Лада Х-Рей – кроссовер, его габаритные размеры также невелики, что увеличивает комфорт управления, и ездовые качества по бездорожью. Вес автомобиля, также положительно сказывается на его проходимости, так как он не превышает нормы седана. Таким образом, модель Лада Х-Рей, можно смело считать удачным отечественным кроссовером, способным конкурировать с зарубежными оппонентами.

Резонансный перенос энергии флуоресценции – обзор

2.1 Разработка зонда FRET для мониторинга активации каспаз

Технология FRET может предоставить ценную информацию о динамике и характере ферментативной активности. Ранние зонды FRET для активации каспазы использовали гибридный белок, то есть белок с усиленной голубой флуоресценцией (ECFP) в качестве донора FRET и белок с усиленной желтой флуоресценцией (EYFP) в качестве акцептора FRET, связанные пептидами, содержащими расщепление каспазы-3. последовательность, DEVD (Luo, Yu, Pu, & Chang, 2001; Rehm et al., 2002; Тиас и др., 2000). Наиболее важной характеристикой зонда FRET является специфичность к молекуле-мишени. Молярный коэффициент экстинкции акцепторного белка является важным фактором для определения эффективности FRET; однако молярный коэффициент экстинкции EYFP, обычного флуоресцентного белка в акцепторах FRET, демонстрирует высокую чувствительность к протонам и ионам хлора, особенно в физиологических условиях (Jayaraman, Haggie, Wachter, Remington, & Verkman, 2000; Llopis, McCaffery, Miyawaki, Фаркуар и Цзянь, 1998).В нескольких сообщениях предполагается, что подкисление происходит во время апоптоза (Matsuyama, Llopis, Deveraux, Tsien, & Reed, 2000; Perez-Sala, Collado-Escobar, & Mollinedo, 1995; Vincent, TenBroeke, & Maiese, 1999) и что хлорид/ бикарбонатный обменник участвует в апоптотических событиях (Araki et al., 2002; Maeno, Ishizaki, Kanaseki, Hazama, & Okada, 2000). Поскольку изменение концентрации хлорида также происходит в нейронах, было бы крайне важно использовать нечувствительный к хлориду индикатор для мониторинга активации каспазы в нейронах.Из-за этих особенностей исследователи должны с осторожностью использовать EYFP в качестве акцептора FRET, особенно для визуализации апоптоза in vivo .

Чтобы преодолеть эти ограничения, Венера была использована в качестве акцептора FRET в зонде SCAT3 (рис. 12.1; Takemoto et al., 2003), поскольку она демонстрирует низкую чувствительность к протонам и ионам хлора (Nagai et al., 2002). Действительно, SCAT3 показал высокую стабильность in vitro и в живых клетках по сравнению с ранее описанным зондом ECFP-EYFP (Takemoto et al., 2003). Разработка индикаторов SCAT3 позволила исследователям отслеживать активацию каспазы в живых клетках и в естественных условиях в режиме реального времени (Campbell & Okamoto, 2013; Koto, Kuranaga, & Miura, 2009; Kuranaga et al., 2011; Nakajima, Kuranaga, Sugimura, Miyawaki, & Miura, 2011; Ohgushi et al., 2010; Takemoto et al., 2007; Yamaguchi et al., 2011).

Характеристики расстояния и динамики белков, полученные в результате эксперимента FRET с одной молекулой: Scilight: Vol 2018, No 7 многочисленные функции, включая передачу сигналов и транскрипцию.Однако этим белкам не хватает определенной структуры, что ограничивает методы, доступные для их характеристики.

Одним из эффективных методов описания того, как складываются и функционируют IDP, является резонансная передача энергии Фёрстера (FRET). Эффективность этого процесса переноса энергии между донорными и акцепторными хромофорами указывает на расстояние, на которое происходит перенос. Однако точная интерпретация расстояний и динамики по данным FRET остается сложной задачей. Международная коллаборация описывает в The Journal of Chemical Physics новый, более простой метод, который они разработали для определения расстояния от конца до конца, а также показателя Флори и радиуса вращения белка из одного эксперимента FRET.

В этом подходе используется распределение расстояний с переменным коэффициентом масштабирования, называемым показателем масштабирования Флори. Это позволяет определить распределение из эксперимента, а не предполагать его с самого начала, но требует только информации о средней эффективности FRET или времени жизни флуоресценции. Масштабный показатель может варьироваться в зависимости от условий решения, в которых изучается белок.

Неявное и явное моделирование растворителя для 30 различных белковых последовательностей подтвердило правильность этого подхода.Было обнаружено, что метод команды, дающий радиусы вращения в пределах 10 процентов от истинных значений, не только более точен, чем обычно используемые модели полимеров, но и возвращает показатель масштабирования, который согласуется с показателями, определенными непосредственно из молекулярных ансамблей. При использовании аналитического распределения расстояний отпадает необходимость в требовательных к вычислительным ресурсам молекулярных симуляциях.

Авторы намерены исследовать аналогичный подход для малоуглового рассеяния рентгеновских лучей, еще одного метода, который предоставляет структурную информацию о IDP.

Источник: «Вывод свойств неупорядоченных цепей на основе эффективности переноса FRET», Венвэй Чжэн, Гюль Х. Зерце, Алессандро Борджиа, Джитайн Миттал, Бенджамин Шулер и Роберт Б. Бест, Журнал химической физики (2018 г.) ). Доступ к статье можно получить по адресу https://doi.org/10.1063/1.5006954.

1. © 2018 Автор(ы). Опубликовано AIP Publishing (https://publishing.aip.org/authors/rights-and-permissions).

Пособие по микроскопии молекулярных экспрессий: специализированные методы микроскопии — FRET

Флуоресцентно-резонансная микроскопия с переносом энергии (FRET)

Вводные концепции

Точное местонахождение и природа взаимодействий между конкретными молекулярными видами в живых клетках представляет большой интерес во многих областях биологических исследований, но исследования часто затруднены из-за ограниченного разрешения инструментов, используемых для изучения этих явлений.Обычная широкопольная флуоресцентная микроскопия позволяет локализовать флуоресцентно меченные молекулы в пределах оптического пространственного разрешения, определяемого критерием Рэлея, приблизительно 200 нанометров (0,2 микрометра). Однако, чтобы понять физические взаимодействия между белками-партнерами, вовлеченными в типичный биомолекулярный процесс, относительная близость молекул должна быть определена более точно, чем позволяют традиционные методы оптической визуализации с ограничением дифракции.Метод резонансного переноса энергии флуоресценции (чаще обозначаемый аббревиатурой FRET ) применительно к оптической микроскопии позволяет определить сближение двух молекул в пределах нескольких нанометров (см. рис. 1), расстояние, достаточно близкое для происходят молекулярные взаимодействия.

Типичные методы флуоресцентной микроскопии основаны на поглощении флуорофором света на одной длине волны (возбуждение) с последующим испусканием вторичной флуоресценции на более длинной длине волны.Длины волн возбуждения и излучения часто разнесены друг от друга на десятки-сотни нанометров. Мечение клеточных компонентов, таких как ядра, митохондрии, цитоскелет, аппарат Гольджи и мембраны, специфическими флуорофорами позволяет локализовать их в фиксированных и живых препаратах. При одновременном мечении нескольких субклеточных структур отдельными флуорофорами, имеющими отдельные спектры возбуждения и испускания, можно использовать специальные комбинации флуоресцентных фильтров для изучения близости меченых молекул в одной клетке или срезе ткани.С помощью этого метода молекулы, которые находятся ближе друг к другу, чем предел оптического разрешения, кажутся совпадающими, и эта кажущаяся пространственная близость подразумевает, что молекулярная ассоциация возможна. Однако в большинстве случаев нормальное разрешение флуоресцентного микроскопа, ограниченное дифракцией, недостаточно, чтобы определить, действительно ли имеет место взаимодействие между биомолекулами. Резонансный перенос энергии флуоресценции представляет собой процесс, при котором происходит безызлучательная передача энергии от флуорофора в возбужденном состоянии ко второму хромофору, находящемуся в непосредственной близости.Поскольку диапазон, в котором может происходить передача энергии, ограничен примерно 10 нанометрами (100 ангстрем), а эффективность передачи чрезвычайно чувствительна к разделяющему расстоянию между флуорофорами, измерения резонансной передачи энергии могут быть ценным инструментом для исследования молекулярных взаимодействий. .

Механизм резонансной передачи энергии флуоресценции включает флуорофор донора в возбужденном электронном состоянии, который может передавать свою энергию возбуждения соседнему акцептору хромофору безызлучательным образом посредством дальнодействующих диполь-дипольных взаимодействий.Теория, поддерживающая передачу энергии, основана на концепции рассмотрения возбужденного флуорофора как колеблющегося диполя, который может обмениваться энергией со вторым диполем, имеющим аналогичную резонансную частоту. В этом отношении резонансная передача энергии аналогична поведению связанных осцилляторов, таких как пара камертонов, вибрирующих на одной частоте. Напротив, радиационный перенос энергии требует испускания и реабсорбции фотона и зависит от физических размеров и оптических свойств образца, а также от геометрии контейнера и путей прохождения волнового фронта.В отличие от радиационных механизмов, резонансный перенос энергии может дать значительный объем структурной информации о паре донор-акцептор.

Резонансный перенос энергии не чувствителен к окружающей растворяющей оболочке флуорофора и, таким образом, производит молекулярную информацию, уникальную по сравнению с той, которая выявляется зависимыми от растворителя событиями, такими как тушение флуоресценции, реакции в возбужденном состоянии, релаксация растворителя или анизотропные измерения. Основное влияние растворителя на флуорофоры, участвующие в резонансном переносе энергии, заключается в влиянии на спектральные свойства донора и акцептора.Безызлучательный перенос энергии происходит на гораздо большие расстояния, чем короткодействующие эффекты растворителя, а диэлектрическая природа компонентов (растворитель и макромолекула-хозяин), расположенных между вовлеченными флуорофорами, очень мало влияет на эффективность резонансного переноса энергии, которая зависит в первую очередь от расстояние между донорным и акцепторным флуорофором.

Явление флуоресцентного резонансного переноса энергии не опосредовано испусканием фотонов и, более того, даже не требует, чтобы акцепторный хромофор был флуоресцентным.Однако в большинстве применений и донор, и акцептор являются флуоресцентными, и возникновение переноса энергии проявляется в виде тушения флуоресценции донора и сокращения времени жизни флуоресценции, что также сопровождается увеличением эмиссии флуоресценции акцептора. Эффективность процесса переноса энергии изменяется обратно пропорционально шестой степени расстояния, разделяющего молекулы донора и акцептора. Следовательно, измерения FRET можно использовать в качестве эффективной молекулярной линейки для определения расстояний между биомолекулами, помеченными соответствующим донорным и акцепторным флуорохромом, когда они находятся в пределах 10 нанометров друг от друга.

Гипотетический пример резонансного переноса энергии флуоресценции между двумя флуорохромами, присоединенными к противоположным концам одного и того же макромолекулярного белка, представлен на рис. 1. В нативной конформации (рис. 1(а)) два флуорофора разделены расстоянием примерно 12 нанометров, что слишком далеко для внутримолекулярного резонансного переноса энергии между флуорохромами. Однако, когда белок подвергается конформационному изменению (рис. 1(b)), два флуорохрома сближаются и теперь могут участвовать в молекулярных взаимодействиях FRET.На рисунке возбуждение донорного флуорохрома обозначено голубым свечением вокруг желтой трехъядерной ароматической молекулы, а соответствующее излучение акцептора (рис. 1(b)) представлено зеленым свечением вокруг второго гетероциклического флуорохрома справа. -ручная сторона белка. Измерения переноса энергии часто используются для оценки расстояний между участками макромолекулы и влияния конформационных изменений на эти расстояния. В экспериментах этого типа степень передачи энергии используется для расчета расстояния между донором и акцептором и получения структурной информации о макромолекуле.

Хотя резонансный перенос энергии флуоресценции часто применялся для исследования межмолекулярных и внутримолекулярных структурных и функциональных модификаций в белках и липидах, основным препятствием для применения методов FRET-микроскопии в живых клетках было отсутствие подходящих методов для мечения специфических внутриклеточных белков соответствующими флуорофоры. Клонирование зеленого флуоресцентного белка медузы ( GFP ) и его экспрессия в самых разных типах клеток стало важным ключом к разработке маркеров как экспрессии генов, так и локализации структурных белков в живых клетках.Было разработано несколько спектрально различных мутационных вариантов белка, в том числе флуоресцентный белок, излучающий синий свет ( синий флуоресцентный белок , BFP ). Как спектры возбуждения, так и спектры испускания для нативных мутантов GFP и BFP достаточно разделены по длине волны, чтобы быть совместимыми с подходом FRET. Рисунок 2 иллюстрирует стратегию обнаружения белок-белковых взаимодействий с использованием резонансного переноса энергии флуоресценции и мутантных флуоресцентных белков.Если два белка, один из которых помечен BFP (донор), а другой — GFP (акцептор), физически взаимодействуют, то при возбуждении комплекса на максимальной длине волны поглощения будет наблюдаться повышенная интенсивность в максимуме эмиссии акцептора (510 нм). (380 нм) донора. Неспособность белков образовывать комплекс приводит к испусканию флуоресценции без акцептора (GFP).

В сочетании с достижениями в области импульсных лазеров, микроскопической оптики и компьютерных технологий визуализации разработка методов маркировки, в которых донорные и акцепторные флуорофоры фактически являются частью самих биомолекул, позволила визуализировать динамические взаимодействия белков в живых клетках.В дополнение к исследованию взаимодействий с белками-партнерами недавние применения переноса энергии флуоресцентного резонанса включают исследования активности протеаз, изменений потенциалов мембранного напряжения, метаболизма кальция и проведение высокопроизводительных скрининговых анализов, таких как количественная оценка экспрессии генов в одиночные живые клетки.

Принципы резонансной передачи энергии флуоресценции

Процесс резонансной передачи энергии ( RET ) может иметь место, когда донорный флуорофор в электронно-возбужденном состоянии передает свою энергию возбуждения соседнему хромофору-акцептору.В принципе, если спектр излучения флуоресценции молекулы-донора перекрывается со спектром поглощения молекулы-акцептора, и оба они находятся в пределах минимального пространственного радиуса, донор может напрямую передавать свою энергию возбуждения акцептору через дальнодействующие диполь-дипольные межмолекулярные связи. связь. Теория, предложенная Теодором Фрстером в конце 1940-х годов, первоначально описывала молекулярные взаимодействия, участвующие в резонансной передаче энергии, и Фрстер также разработал формальное уравнение, определяющее взаимосвязь между скоростью передачи, межхромофорным расстоянием и спектральными свойствами вовлеченных хромофоров.

Резонансный перенос энергии — это безызлучательный квантово-механический процесс, не требующий столкновения и не связанный с выделением тепла. Когда происходит перенос энергии, молекула-акцептор гасит флуоресценцию молекулы-донора, и если акцептор сам является флуорохромом, наблюдается усиленное или сенсибилизированное излучение флуоресценции (см. рис. 3). Это явление можно наблюдать, возбуждая образец, содержащий как донорные, так и акцепторные молекулы, светом с длинами волн, соответствующими максимуму поглощения донорного флуорофора, и обнаруживая свет, излучаемый на длинах волн, близких к максимуму излучения акцептора.Альтернативный метод обнаружения, быстро набирающий популярность, заключается в измерении времени жизни флуоресценции донорного флуорофора в присутствии и в отсутствие акцептора.

На рис. 3 представлена ​​диаграмма Яблонского, иллюстрирующая связанные переходы между излучением донора и поглощением акцептора при резонансной передаче энергии флуоресценции. Переходы поглощения и излучения представлены прямыми вертикальными стрелками (зеленой и красной соответственно), а колебательная релаксация обозначена волнистыми желтыми стрелками.Связанные переходы нарисованы пунктирными линиями, которые указывают на их правильное расположение на диаграмме Яблонского, если бы они возникли в результате электронных переходов, опосредованных фотонами. В присутствии подходящего акцептора донорный флуорофор может передавать энергию возбужденного состояния непосредственно акцептору, не испуская фотон (показано синей стрелкой на рисунке 3). Возникающее в результате сенсибилизированное флуоресцентное излучение имеет характеристики, аналогичные спектру излучения акцептора.

Чтобы произошла резонансная передача энергии, должны быть удовлетворены несколько критериев.В дополнение к перекрывающимся спектрам излучения и поглощения молекул донора и акцептора два вовлеченных флуорофора должны быть расположены в диапазоне от 1 до 10 нанометров друг от друга. Как описано в уравнениях, выведенных Фрстером (и обсуждаемых ниже), эффективность передачи энергии между молекулами донора и акцептора уменьшается пропорционально шестой степени расстояния, разделяющего их. Следовательно, способность донорного флуорофора передавать свою энергию возбуждения акцептору за счет безызлучательного взаимодействия резко снижается с увеличением расстояния между молекулами, ограничивая явление FRET максимальным радиусом разделения донор-акцептор примерно в 10 нанометров.На расстояниях менее 1 нанометра возможны несколько других режимов переноса энергии и/или электронов. Зависимость процесса резонансной передачи энергии от расстояния является основной причиной его полезности при исследовании молекулярных взаимодействий. В исследованиях живых клеток с участием молекул, помеченных донорными и акцепторными флуорофорами, резонансный перенос энергии будет происходить только между молекулами, которые находятся достаточно близко, чтобы биологически взаимодействовать друг с другом.

Дополнительным требованием для резонансной передачи энергии является то, что время жизни флуоресценции молекулы донора должно быть достаточно продолжительным, чтобы событие могло произойти.И скорость ( K(T) ), и эффективность ( E(T) ) переноса энергии напрямую связаны со временем жизни донорного флуорофора в присутствии и в отсутствие акцептора. Согласно теории Фрстера, подтвержденной экспериментально, скорость передачи энергии определяется уравнением:

K _T = (1/t _D ) [R ₀ /r] ⁶

, где R(0) — критическое расстояние Фрстера , t(D) — время жизни донора в отсутствие акцептора, а r — расстояние, разделяющее донорную и акцепторную хромофоры.Критическое расстояние Фрстера ( R(0) ) определяется как радиус разделения акцептор-донор, для которого скорость переноса равна скорости распада донора (девозбуждения) в отсутствие акцептора. Другими словами, когда радиус донора и акцептора ( r ) равен расстоянию Фрстера, то эффективность переноса составляет 50 процентов. При таком радиусе разделения половина энергии возбуждения донора передается акцептору за счет резонансного переноса энергии, а другая половина рассеивается за счет комбинации всех других доступных процессов, включая испускание флуоресценции.

Концептуально критическое расстояние Фрстера — это максимальное расстояние между донорной и акцепторной молекулами, при котором еще будет происходить резонансная передача энергии. Значение критического расстояния обычно находится в диапазоне от 2 до 6 нанометров, что случайно соответствует порядку размеров многих белковых молекул. Кроме того, диапазон критических расстояний также соответствует нескольким другим биологически значимым параметрам, таким как толщина клеточной мембраны и расстояние, разделяющее сайты белков, имеющих несколько субъединиц.Значение R(0) (в нанометрах) можно рассчитать из следующего выражения:

R ₀ = 2,11 x 10 ^-2 [k ² J(l) h ^-4 Q _D ] ^1/6

, в котором к-квадрат — коэффициент, описывающий относительную ориентацию в пространстве между переходными диполями донора и акцептора, Дж(л) — интеграл перекрытия в области спектров излучения донора и поглощения акцептора (с длина волны, выраженная в нанометрах), ч представляет собой показатель преломления среды, а Q(D) представляет собой квантовый выход донора.

Эффективность передачи энергии, E(T) , является мерой доли фотонов, поглощенных донором, которые передаются акцептору, и связана с расстоянием между донором и акцептором, r , соотношением уравнение:

r = R ₀ [(1/E _T ) — 1] ^1/6

и E(T) оценивается как:

E _T = 1 — (t _DA /t _D )

, где t(DA) — время жизни донора в присутствии акцептора, а t(D) — время жизни донора в отсутствие акцептора.Следовательно, измеряя время жизни флуоресценции донора в присутствии и в отсутствие акцептора (что указывает на степень тушения донора из-за акцептора), можно определить расстояние, разделяющее молекулы донора и акцептора. Во многих широко применяемых методах эффективность переноса энергии определяется стационарными измерениями относительной средней интенсивности флуоресценции донора в присутствии и в отсутствие акцептора (а не путем измерения времени жизни).

Таким образом, скорость переноса энергии зависит от степени спектрального перекрытия между спектрами излучения донора и спектра поглощения акцептора (см. рис. 4), квантового выхода донора, относительной ориентации дипольных моментов перехода донора и акцептора и расстояние, разделяющее молекулы донора и акцептора. Любое событие или процесс, влияющий на расстояние между донором и акцептором, повлияет на скорость переноса резонансной энергии, что, следовательно, позволит дать количественную оценку явления при условии, что артефакты можно контролировать или устранять.

На рисунке 4 представлены спектры поглощения и испускания голубого флуоресцентного белка ( CFP , донор) и красного флуоресцентного белка ( RFP или DsRed , акцептор) при сравнении их потенциального применения в качестве резонансной энергии флуоресценции. переходная пара. Спектры поглощения обоих биологических пептидов показаны красными кривыми, а спектры испускания представлены синими кривыми. Область перекрытия спектров излучения донора и спектра поглощения акцептора представлена ​​серой областью у основания кривых.Всякий раз, когда спектральное перекрытие молекул увеличивается слишком сильно, возникает явление, известное как спектральное просачивание или пересечение , при котором сигнал от возбужденного акцептора (возникающего из-за возбуждающего освещения донора) и эмиссия донора обнаруживаются в акцепторный эмиссионный канал. В результате получается высокий фоновый сигнал, который необходимо выделить из слабого флуоресцентного излучения акцептора.

Основная теория безызлучательного переноса энергии непосредственно применима к паре донор-акцептор, разделенной фиксированным расстоянием, и в этом случае скорость переноса энергии является функцией расстояния Фрстера, R(0) , которое в очередь зависит от k -квадрата, J(l) , h и Q(D) .Если эти факторы известны, можно рассчитать расстояние между донором и акцептором. Для описания таких ситуаций, как множественные акцепторные хромофоры и распределения расстояний, требуются более сложные формулировки. В таблице 1 представлены ряды экспериментально измеренных критических расстояний Фрстера, которые были установлены по спектральному перекрытию нескольких популярных пар донорно-акцепторных флуорофоров. Поскольку переменная включает в себя квантовый выход донора и степень спектрального перекрытия, оба из которых зависят от локализованных условий окружающей среды, значения расстояния Фрстера должны определяться в тех же экспериментальных условиях, что и те, которые используются для исследования резонансного переноса энергии.

Показатель преломления среды передачи энергии обычно известен из состава растворителя или может быть оценен для конкретной макромолекулы, и обычно принимается равным 1,4 в водном растворе. Квантовый выход донора определяют путем сравнения со стандартными флуорофорами с известным квантовым выходом. Поскольку Q(D) появляется как корень шестой степени при вычислении R(0) , небольшие ошибки или неопределенности в значении Q(D) не оказывают большого влияния на вычисление расстояния Фрстера.Также из-за зависимости корня шестой R(0) не сильно зависит от вариаций J(l) , но интеграл перекрытия все же должен оцениваться для каждой пары донор-акцептор. В общем, чем выше степень перекрытия между спектром излучения донора и спектром поглощения акцептора, тем больше значения критического расстояния Фрстера.

Критическое расстояние Frster для обычных пар донор-акцептор RET

Донор Акцептор Расстояние Frster (Нм) Триптофан Дансил 2.1 ИЭДАНС (1) ДДПМ (2) 2,5 — 2,9 БФП DsRFP 3,1 — 3,3 Дансил ФИТЦ 3,3 — 4,1 Дансил Октадецилродамин 4.3 УФП GFP 4,7 — 4,9 ЦФ (3) Техасский красный 5.1 Флуоресцеин Тетраметилродамин 4,9 — 5,5 Су3 Сай5 >5.0 ОФП YFP 5,5 — 5,7 КОРПУС ФЛ (4) КОРПУС ФЛ (4) 5,7 Родамин 6G Зеленый малахит 6.1 ФИТЦ Эозин Тиосемикарбазид 6.1 — 6,4 B-фикоэритрин Сай5 7,2 Су5 Cy5.5 >8,0

(1) 5-(2-йодоацетиламиноэтил)аминонафталин-1-сульфокислота (2) N-(4-диметиламино-3,5-динитрофенил)малеимид (3) карбоксифлуоресцеинсукцинимидиловый эфир (4) 4 ,4-дифтор-4-бора-3а,4а-диаза-s-индацен

Стол 1

Неопределенность в оценке коэффициента ориентации ( k -квадрат) широко обсуждалась в литературе, и, несмотря на экспериментальные доказательства того, что теория Фрстера верна и применима к измерению расстояний, эта переменная по-прежнему вызывает некоторые споры.Важно понимать, что расстояния Фрстера обычно даются для предполагаемого значения k -квадрат, обычно это динамически усредненное значение 2/3 (0,67). Это предполагаемое значение является результатом рандомизации ориентации донора и акцептора за счет вращательной диффузии до передачи энергии. Фактор ориентации зависит от относительной ориентации в пространстве диполя излучения донора и диполя поглощения акцептора и может варьироваться от нуля до 4. Значение 1 соответствует параллельным переходным диполям, а значение 4 соответствует диполям, которые оба являются параллельны и коллинеарны.

Из-за отношения корня шестой к расстоянию Фрстера изменение коэффициента ориентации от 1 до 4 дает только 26-процентное изменение вычисленного расстояния, а максимальная ошибка 35 процентов возможна при обычно принимаемом значении 0,67. применяется. Наиболее серьезная потенциальная ошибка возникает, если диполи ориентированы точно перпендикулярно друг другу и соответствующее значение k -квадрат становится равным нулю. Было использовано несколько методов для работы с неопределенностью, включая предположение, что существует ряд статических ориентаций, которые не меняются в течение времени жизни флуорофора в возбужденном состоянии.Измерения анизотропии флуоресценции для донора и акцептора могут позволить определить пределы для вариации k в квадрате. Кроме того, использование флуорофоров с низкой поляризацией флуоресценции (из-за излучения нескольких перекрывающихся переходов) снижает неопределенность фактора ориентации. Ограничение возможных значений k -квадрат таким образом снижает потенциальную ошибку вычисления расстояния примерно до 10 процентов.

Во многих случаях фактор ориентации трудно, если вообще возможно, определить, а точное значение переменной часто рассматривается как непреодолимая проблема.Однако некоторые данные указывают на ограничение важности фактора в расчетах резонансной передачи энергии. Сравнение расстояний донора и акцептора с использованием спектроскопии резонансного переноса энергии и методов рентгеновской дифракции в значительной степени подтверждает правильность предположения о значении фактора 0,67 (как это предлагается теорией Фрстера), по крайней мере, для небольших пептидов и белков. Для более крупных белков существует большая неопределенность. Использование этого значения для фактора ориентации допустимо в предположении, что как донорные, так и акцепторные зонды могут свободно совершать неограниченное изотропное движение.Дальнейшее подтверждение получено из экспериментальных данных о том, что для флуорофоров, присоединенных одинарной или двойной связью к макромолекулам, сегментарные движения донора и акцептора имеют тенденцию приводить к динамически рандомизированным ориентациям.

Для слабосвязанных флуорохромов свободное вращательное движение вокруг одинарных связей должно позволять использовать среднее значение ориентации, но неограниченное движение молекул, связанных через несколько сайтов связывания, вероятно, не происходит.С другой стороны, крайние значения нуля и 4 для k -квадрат требуют полной поляризации флуоресценции донора и акцептора, условие, которое вряд ли будет достигнуто. Некоторые исследователи представили статистические расчеты, которые утверждают, что расстояния распределения доноров-акцепторов и их ориентация определяют наблюдаемое среднее расстояние. При условии, что существует некоторое распределение по наблюдаемому расстоянию (и оно не ограничивается слишком близким расположением донора и акцептора по отношению к R(0) ), можно надежно получить среднее расстояние между флуорофорами и оценить неопределенность из-за фактора ориентации. .

Зависимость ориентационного фактора ( k -квадрат) от взаимной ориентации эмиссионного диполя донора и диполя поглощения акцептора (показана на рис. 5) дается уравнением:

k ² = (cos q _T — 3cos q _D cos q _A ) ² = (sin q _D sin q _A cos f — 2cos q _D cos q _A ) ²

, где q(T) — угол между диполем эмиссионного перехода донора и диполем абсорбционного перехода акцептора, q(D) и q(A) — углы между этими диполями и вектором соединения донора и акцептора, а f — угол между плоскостями, содержащими два переходных диполя.

Эффективность переноса энергии наиболее чувствительна к изменениям расстояния, когда расстояние между донором и акцептором приближается к расстоянию Фрстера ( R(0) ) для двух молекул. Рисунок 6 иллюстрирует экспоненциальную зависимость между эффективностью переноса и расстоянием, разделяющим донора и акцептора. Эффективность быстро увеличивается до 100 процентов, когда расстояние уменьшается ниже R(0) , и, наоборот, уменьшается до нуля, когда r больше R(0) .Из-за сильной (в шестой степени) зависимости эффективности переноса от расстояния измерения расстояния между донором и акцептором надежны только тогда, когда радиус донора и акцептора лежит в пределах расстояния Фрстера в два раза. Когда r составляет приблизительно 50 процентов от R(0) , эффективность резонансной передачи энергии близка к максимальной, и более короткие расстояния не могут быть надежно определены. Когда расстояние между донором и акцептором превышает значение R(0) на 50 процентов, наклон кривой становится настолько пологим, что более длинные разделительные расстояния не разрешаются.

Практическое значение знания критического расстояния Фрстера состоит в том, что это значение дает представление о диапазоне разделительных расстояний, которые могут быть определены с помощью FRET для данной пары датчиков (см. Таблицу 1). Поскольку измерение переноса энергии очень чувствительно к изменению расстояния, когда расстояние между донором и акцептором близко к расстоянию Фрстера, приблизительные размеры взаимодействия молекул-мишеней являются наиболее важным фактором при выборе пары флуоресцентных красителей.Другие факторы, которые следует учитывать, в зависимости от того, проводятся ли измерения в установившемся режиме или с временным разрешением, включают химическую стабильность, квантовый выход и время жизни распада флуорофора. Поскольку для обычных методов переноса энергии флуоресцентного резонанса не существует внутреннего эталона расстояния, расстояния, рассчитанные путем измерения эффективности переноса, относятся к расстоянию Фрстера, которое получено из спектроскопических данных, измеренных на парах донор-акцептор.

Явление резонансной передачи энергии по механизму Фрстера сложно в некоторых аспектах, но просто и надежно по своему результирующему эффекту.Первичные расстояния можно точно предсказать по спектральным свойствам донора и акцептора, и, поскольку никаких исключений из теории еще не выявлено, можно предположить, что резонансный перенос энергии происходит при любых условиях, когда пара молекул донор-акцептор находится в непосредственной близости. Сложность теории, описывающей дипольный перенос, возникает не из-за самого механизма переноса, а из-за возникновения распределений по расстояниям (в том числе неслучайных) и диффузии молекул донора и акцептора.Когда предпринимаются шаги для усреднения зависимости передачи энергии от расстояния в диапазоне геометрий и временных рамок, FRET является надежным методом изучения пространственного распределения между взаимодействующими молекулами.

Применение методов FRET в оптической микроскопии

Конфигурационные параметры микроскопа для исследований переноса энергии флуоресцентного резонанса варьируются в зависимости от требований к флуорофорам, образцу и режиму(ам) визуализации, но практически любой прямой или инвертированный микроскоп можно модифицировать для FRET-микроскопии (см. рис. 7).Как правило, микроскоп должен быть оснащен системой ПЗС-камер с охлаждением и усилением высокого разрешения (12 бит), соединенной с качественными интерференционными фильтрами с низким уровнем перекрестных помех (минимальный уровень блокировки) и областями полосы пропускания, соответствующими спектру флуорофора. Чувствительность детектора определяет, насколько узкой может быть полоса пропускания фильтра и при этом обеспечивать сбор данных с приемлемой скоростью с минимальным спектральным просачиванием шума. В большинстве случаев для получения изображений следует использовать одно дихроматическое зеркало, соединенное с колесами или ползунками фильтров возбуждения и излучения, чтобы свести к минимуму или устранить смещения изображений.

Широкопольная флуоресцентная микроскопия страдает от испускания флуорофора выше и ниже фокальной плоскости, что дает изображения со значительным сигналом вне фокуса, что снижает контраст и приводит к ухудшению качества изображения. Эта проблема усугубляется в FRET-микроскопии из-за изначально низких уровней сигнала, создаваемого в результате резонансной передачи энергии. Методы цифровой деконволюции можно сочетать с оптическим разделением, чтобы уменьшить или устранить сигналы вдали от фокальной плоскости, но этот процесс требует больших вычислительных ресурсов и может быть недостаточно быстрым для многих экспериментов с динамической FRET-визуализацией.Конфокальные методы лазерного сканирования могут быть применены к FRET-микроскопии для значительного улучшения латерального разрешения, позволяя при этом собирать серийные оптические срезы с интервалами, приближающимися к реальному времени. Основным недостатком конфокальной микроскопии является ограничение длин волн возбуждения стандартными лазерными линиями, доступными для конкретной системы, что ограничивает выбор пар донора и акцептора флуорофора в экспериментах по резонансному переносу энергии. Многофотонное возбуждение также можно использовать в сочетании с методами FRET, и оно менее повреждает клетки из-за задействования более длинных волн возбуждения.Кроме того, артефакты автофлуоресценции и фотообесцвечивание образца менее вероятны в пределах ограниченного объема возбуждения, характерного для многофотонного возбуждения.

Типичная конфигурация микроскопа, позволяющая наблюдать за живыми клетками в культуре с использованием нескольких мотивов визуализации с передачей энергии флуоресцентного резонанса, представлена ​​на рисунке 7. Перевернутый микроскоп для тканевых культур оснащен стандартной вольфрамово-галогенной лампой на стойке для исследования и регистрации клеток с использованием стандартного светлопольного, фазово-контрастного или дифференциально-интерференционного освещения ( DIC ).Обратите внимание, что последние два метода усиления контраста можно использовать в сочетании с флуоресценцией, чтобы выявить пространственное расположение флуорофоров в клеточной архитектуре. Стандартная ПЗС-камера с охлаждением Пельтье крепится к тринокулярной головке микроскопа для широкопольной флуоресценции и захвата изображения в светлом поле.

Эксперименты по резонансной передаче энергии проводятся с помощью мультиспектрального микроскопа, показанного на рис. 7, с использованием либо широкопольного освещения (дуговой разрядной лампы), либо сканирующей конфокальной приставки в реальном времени, оснащенной высокоскоростной дисковой системой Нипкова.Луч аргон-криптонового лазера сначала фильтруется через акустооптическое устройство с перестраиваемой длиной волны, чтобы выбрать определенные длины волн возбуждения, прежде чем попасть в конфокальную сканирующую головку. Изображения собираются с помощью двух охлаждаемых ПЗС-камер с высоким разрешением Gen III, считывающих отдельные каналы, и передаются на хост-компьютер. Сканирование образца в боковой ( x и y ) и аксиальной ( z ) плоскостях позволяет собирать оптические срезы для трехмерной реконструкции изображения.Различные программы обработки изображений совместимы с представленной конфигурацией микроскопа.

Основываясь на фундаментальных принципах явления, следует учитывать ряд важных практических моментов при проведении измерений переноса энергии флуоресцентного резонанса с помощью оптического микроскопа:

• Концентрации донорных и акцепторных флуорофоров необходимо тщательно контролировать. Статистически самая высокая вероятность достижения резонансной передачи энергии флуоресценции возникает, когда несколько молекул акцептора окружают одну молекулу донора.

• Фотообесцвечивание должно быть устранено, поскольку артефакт может изменить соотношение молекул донор-акцептор и, следовательно, измеренное значение процесса резонансной передачи энергии.

• Спектр испускания флуоресценции донора и спектр поглощения акцептора должны иметь значительную область перекрытия.

• Должно быть минимальное прямое возбуждение акцептора в диапазоне длин волн, используемом для возбуждения донора.Распространенным источником ошибок в измерениях FRET-микроскопии в стационарном состоянии является обнаружение эмиссии доноров с помощью наборов акцепторных фильтров.

• Длины волн излучения донора и акцептора должны совпадать с максимальным диапазоном чувствительности детектора.

• Спектры поглощения и излучения доноров должны иметь минимальное перекрытие, чтобы уменьшить возможность самопереноса от донора к донору.

• Молекула донора должна быть флуоресцентной и иметь достаточно большое время жизни, чтобы произошла резонансная передача энергии.

• Донор должен иметь низкую поляризационную анизотропию, чтобы свести к минимуму неопределенность значения фактора ориентации ( k -квадрат). Этому требованию удовлетворяют доноры, излучение которых возникает в результате нескольких перекрывающихся переходов возбуждения.

• При использовании методов мечения антител реагенты, конъюгированные с донорными и акцепторными флуорохромами, не должны изменять свою биологическую активность. Любое снижение активности серьезно повлияет на достоверность результирующих измерений резонансной передачи энергии.

• Поскольку для резонансной передачи энергии флуоресценции требуется, чтобы молекулы донора и акцептора имели соответствующее дипольное выравнивание и располагались в пределах 10 нанометров друг от друга, необходимо учитывать третичную структуру реагентов, к которым присоединены молекулы. Например, когда донорно-акцепторные молекулы могут быть присоединены к разным структурным участкам (например, к карбокси- или амино-концу) белка, возможно, что FRET не будет наблюдаться, даже если белки взаимодействуют, потому что донорные и акцепторные молекулы расположены на противоположных концах взаимодействующих молекул.

• Живые клетки, помеченные мутантами зеленого флуоресцентного белка для исследований FRET, следует анализировать с использованием традиционных иммуногистохимических методов, чтобы убедиться, что меченый белок принимает ту же внутриклеточную среду и свойства, что и нативный аналог.

Для того чтобы феномен переноса энергии флуоресцентного резонанса мог предоставить значимые данные в качестве инструмента в оптической микроскопии, необходимо оптимизировать как подготовку образца, так и параметры визуализации.Выбор подходящих донорных и акцепторных зондов и способов их использования в качестве молекулярных меток представляет собой серьезную проблему. Кроме того, после выяснения стратегии маркировки, которая позволяет передавать энергию, можно использовать широкий спектр методов для выполнения самого измерения. Большинство количественных исследований флуоресцентной микроскопии проводится путем измерения интенсивности флуоресцентного излучения. Обнаружение FRET на основе интенсивности флуоресценции обычно достигается путем отслеживания изменений относительной величины интенсивности излучения на двух длинах волн, соответствующих донорным и акцепторным хромофорам.Когда условия подходят для резонансной передачи энергии флуоресценции, увеличение эмиссии акцептора ( I(A) ) сопровождается сопутствующим уменьшением интенсивности эмиссии донора ( I(D) ).

Хотя изменение относительной интенсивности излучения либо донора, либо акцептора можно рассматривать как показатель резонансной передачи энергии, общепринятый подход заключается в использовании отношения двух величин, I(A)/I(D) , как мера FRET.Значение отношения зависит от среднего расстояния между парами донор-акцептор и нечувствительно к различиям в длине пути и объеме, доступном для возбуждающего светового луча. Любое состояние образца, вызывающее изменение относительного расстояния между молекулярными парами, приводит к изменению соотношения излучения донора и акцептора. Следовательно, FRET можно наблюдать в микроскоп по преимущественному возбуждению донорного флуорофора и обнаружению повышенной эмиссии взаимодействующего акцепторного флуорофора, сопровождающегося снижением донорной флуоресценции, вызванной тушением вследствие переноса энергии.Измерение FRET с использованием метода контроля интенсивности называется стационарным визуализацией резонансной передачи энергии флуоресценции.

Подходящие донорные и акцепторные зонды выбираются на основе их спектральных характеристик поглощения и излучения. Для максимальной резонансной передачи энергии спектр излучения донора должен существенно перекрываться со спектром поглощения акцептора. Кроме того, должно быть минимальное прямое возбуждение акцепторного флуорофора в максимуме возбуждения донора, и не должно быть значительного перекрытия эмиссии между донором и акцептором в диапазоне длин волн, в котором происходит эмиссия акцептора.На практике бывает сложно идентифицировать пары донор-акцептор, удовлетворяющие этим требованиям. Ситуация часто осложняется тем фактом, что имеющиеся в продаже наборы флуоресцентных фильтров не полностью эффективны при пропускании только желаемых длин волн, и может быть пропущен небольшой процент света за пределами расчетной полосы пропускания. Если не используются очень хорошо охарактеризованные и контролируемые системы экспрессии, может быть трудно определить точную концентрацию донорных и акцепторных флуорофоров.Дополнительные поправки также могут потребоваться для автофлуоресценции, фотообесцвечивания и фоновой флуоресценции.

Типичное исследование внутриклеточной белково-белковой ассоциации в живой клеточной культуре проиллюстрировано на рис. 8 событиями, связанными с апоптозом, физиологическим процессом клеточной смерти, возникающим в результате сложного каскада последовательных взаимодействий. Генные продукты, непосредственно участвующие в цепочке событий, могут быть помечены путем слияния с соответствующими членами семейства флуоресцентных белков (в данном случае BFP и GFP) для совместной экспрессии в одной и той же клетке, чтобы исследовать специфические ассоциации с помощью FRET.Белки, участвующие в апоптозе, взаимодействуют внутри митохондрий и обнаруживают постепенное снижение связывания по мере развития запрограммированной гибели клеток. Таким образом, изображение эмиссии донора (рис. 8(а)) содержит только флуоресценцию от белков, меченных BFP, в то время как соответствующий профиль эмиссии акцептора (рис. 9(б)) иллюстрирует сигналы от белков, меченных GFP (и некоторый вклад от белков, меченных GFP). донорная эмиссия). Фильтр FRET (рис. 8(c)), как описано ниже, выявляет флуоресценцию, возникающую в результате резонансного переноса энергии между двумя белками

.

Среди факторов, которые потенциально могут повлиять на точность измерения переноса энергии флуоресцентного резонанса в целом, несколько очень специфичны для оптического микроскопа.Основной целью микроскопических исследований является получение изображений с высоким разрешением, и это требует особого внимания к качеству и характеристикам оптических фильтров, используемых для спектрального разделения длин волн поглощения и излучения донора и акцептора. Чтобы максимизировать отношение сигнал/шум (без вредного воздействия на образец или исследуемый процесс), необходимо тщательно сбалансировать интенсивность и время воздействия возбуждающего света с концентрацией донорных и акцепторных флуорофоров и детектора. эффективность.Если концентрация донорно-акцепторных флуорофоров чрезмерна, может произойти самогашение, влияющее на точность измерений FRET. Фотообесцвечивание является проблемой для всех флуорофоров и может влиять на соотношение донор-акцептор, изменяя измерения флуоресценции. Избыточная интенсивность освещения также может повредить образцы, особенно те, которые содержат живые клетки или ткани.

Техника, известная как фотообесцвечивание донора , резонансная передача энергии флуоресценции ( pbFRET ), которая использует процесс фотообесцвечивания для измерения FRET, часто применяется при исследовании фиксированных образцов.Этот метод, основанный на попиксельном анализе, был применен для измерения отношений близости между белками клеточной поверхности, меченными моноклональными антителами, конъюгированными с флуорофором. Фотообесцвечивание FRET основано на теории, согласно которой флуорофор чувствителен к фотоповреждению только тогда, когда он находится в возбужденном состоянии. Статистически только небольшая часть молекул находится в возбужденном состоянии в любой момент времени, и, следовательно, флуорофоры с более длительным временем жизни флуоресценции имеют более высокую вероятность фотоповреждения и демонстрируют более высокую скорость фотообесцвечивания.

Экспериментальные данные, подтверждающие эту концепцию, показали, что время фотообесцвечивания флуорофора обратно пропорционально времени его жизни в возбужденном состоянии. Возникновение резонансного переноса энергии снижает время жизни флуоресценции молекулы донора, эффективно защищая ее от фотообесцвечивания. Расчеты pbFRET основаны на уменьшении скорости фотообесцвечивания донора по сравнению со скоростью, измеренной для донора в отсутствие резонансного переноса энергии.Измерение фотообесцвечивания в исследованиях FRET требует относительно длительного периода времени и, следовательно, наиболее применимо к образцам фиксированных клеток, в которых временные данные не важны, а влияние фотообесцвечивания на функцию клеток не является проблемой. В некоторых отношениях метод фотообесцвечивания доноров менее сложен, чем измерение сенсибилизированной эмиссии, хотя подгонка постоянных времени к кривым фотообесцвечивания, включающим несколько компонентов, представляет некоторые дополнительные трудности.

Эффективность переноса энергии также может быть определена методами фотообесцвечивания акцептора , в которых изменение тушения эмиссии донора измеряется путем сравнения значения до и после селективного фотообесцвечивания молекулы акцептора.Анализ изменения интенсивности флуоресценции донора в одних и тех же областях образца до и после удаления акцептора имеет то преимущество, что требует подготовки только одного образца и напрямую связывает эффективность переноса энергии с флуоресценцией как донора, так и акцептора.

Точное измерение резонансной передачи энергии флуоресценции в микроскопе требует компенсации всех возможных источников ошибок. Был разработан простой метод коррекции обнаружения флуоресценции донора с помощью акцепторного эмиссионного фильтра и акцепторной флуоресценции с помощью донорного эмиссионного фильтра (из-за кроссовера или спектрального просачивания).Метод также корректирует зависимость FRET от концентраций донорных и акцепторных флуорофоров. Стратегия измерения, которая требует минимум спектральной информации, использует комбинацию трех наборов фильтров и может быть легко реализована. Наборы донорных, FRET и акцепторных фильтров предназначены для выделения и максимизации трех специфических сигналов: донорной флуоресценции, акцепторной флуоресценции, связанной с FRET, и непосредственно возбуждаемой акцепторной флуоресценции соответственно. На практике три разных образца, содержащие только донора, только акцептора, а также донора и акцептора, исследуют с каждым из трех наборов фильтров, а полученные данные обрабатывают арифметически, чтобы скорректировать пересечение и неконтролируемые вариации концентраций донор-акцептор.

На рис. 9 представлены схематические иллюстрации кроссовера (спектрального просачивания) и перекрестных помех фильтра — двух существенных проблем, которые необходимо решить для получения количественных результатов в экспериментах по переносу энергии флуоресцентного резонанса. Пересечение или просачивание проявляется в перекрытии спектра излучения флуоресценции донора с полосой пропускания интерференционного фильтра излучения акцептора на рисунке 9, в результате чего сигнал излучения донора (нежелательные длины волн) проходит через фильтр излучения.Напротив, перекрестные помехи фильтра описывают минимальный уровень затухания (блокировки) в определенном диапазоне двух последовательно соединенных фильтров и представляют интерес при согласовании фильтров возбуждения и излучения для флуоресцентных наборов. Дихроматические зеркала часто включаются в оценку перекрестных помех комбинаций флуоресцентных фильтров. Хотя два эмиссионных фильтра редко размещают на пути света одновременно, спектры сведены вместе на рис. 9, чтобы одновременно проиллюстрировать обе концепции.Обратите внимание, что спектры двух фильтров (синяя и красная кривые) представляют коэффициент пропускания света интерференционными фильтрами, тогда как кривая излучения донора (зеленая) представляет собой график зависимости интенсивности от длины волны.

Дополнительные факторы, которые потенциально могут привести к значительным ошибкам, также требуют коррекции при использовании методов измерения FRET в установившемся режиме. Кроме того, желателен тщательный контроль концентраций донорных и акцепторных флуорофоров. Определения концентрации флуорофора можно частично избежать за счет применения измерений флуоресценции с временным разрешением , которые обеспечивают метод получения среднего времени жизни без точного знания концентрации доноров.Этот метод позволяет количественно определять расстояние между донором и акцептором и основан на измерении времени жизни донора в присутствии и в отсутствие акцептора. Измерение затухания интенсивности флуоресценции в зависимости от времени проясняет динамику излучения молекулы в возбужденном состоянии и, следовательно, может быть получена более подробная информация о характере донорно-акцепторного взаимодействия. Графические графики затухания интенсивности иллюстрируют усредненные по времени детали процесса затухания флуоресценции (см. рис. 10(a)), которые не разрешаются при использовании методов стационарного режима.Измерения, показывающие одно и то же значение среднего времени жизни, когда они регистрируются как интенсивность устойчивого состояния, нормализованная к поглощению, могут соответствовать значительно разным формам кривых затухания на графиках данных с временным разрешением, что указывает на различия в вовлеченных межмолекулярных процессах.

Время жизни флуоресценции ( t ) флуорофора — это характерное время, в течение которого молекула находится в возбужденном состоянии до возвращения в основное состояние. Представляя затухание флуоресценции в упрощенной одинарной экспоненциальной форме после короткого импульса возбуждающего света, интенсивность флуоресценции как функцию времени ( t ) определяется уравнением:

I(t) = I ₀ exp (-t/t)

, где I(0) — начальная интенсивность флуоресцентного излучения сразу после импульса возбуждающего света, а I(t) — интенсивность флуоресценции, измеренная в момент времени t .Время жизни флуоресценции ( t ) определяется как время, необходимое для снижения интенсивности до 1/e от ее начального значения (приблизительно 37 процентов от I(0) ; рис. 10(a)), и составляет величина, обратная константе скорости затухания флуоресценции из возбужденного состояния в основное.

Основное общее преимущество измерений FRET с временным разрешением по сравнению со стационарными измерениями заключается в том, что расстояние между донором и акцептором может быть нанесено на карту с большей количественной точностью.Отчасти это происходит потому, что время жизни флуоресценции не зависит от локальной интенсивности или концентрации и в значительной степени не зависит от фотообесцвечивания флуорофоров. Однако время жизни флуоресценции очень чувствительно к среде флуорофора, и даже молекулы со схожими спектрами могут иметь разное время жизни в разных условиях окружающей среды. Поскольку рассеяние не влияет на время жизни флуорофора, измерения изменения времени жизни могут предоставить информацию, которая конкретно связана с локальными молекулярными процессами.

Время жизни флуорофора зависит от множества переменных в локальном микроокружении, включая такие факторы, как гидрофобность, концентрация кислорода, ионная сила других компонентов среды, связывание с макромолекулами и близость к акцепторным молекулам, которые могут истощать возбужденное состояние. за счет резонансной передачи энергии. Существенным практическим преимуществом является то, что измерения продолжительности жизни могут служить абсолютными индикаторами молекулярных взаимодействий и не зависят от концентрации флуорофора.

Два общих метода, обычно используемых для измерения времени жизни флуоресценции, классифицируются как во временной области ( импульсный , см. рисунок 10(a)) и в частотной области (также называемый с фазовым разрешением ; рисунок 10(b). )) методы. Измерения времени жизни во временной области используют импульсные источники возбуждающего света, а время жизни флуоресценции определяется прямым измерением сигнала излучения или детектированием подсчета фотонов. Подход в частотной области использует синусоидальную модуляцию источника возбуждающего света (получаемую из импульсных или модулированных лазерных систем), а время жизни определяется по фазовому сдвигу и глубине демодуляции сигнала флуоресцентного излучения.Каждый из этих подходов к визуализации времени жизни флуоресценции имеет определенные преимущества и недостатки, и оба они широко применяются в обычной широкопольной, конфокальной и многофотонной микроскопии.

На рис. 10 представлены схематические диаграммы, представляющие методы временной и частотной областей для определения времени жизни флуоресценции. При подходе во временной области (рис. 10(а)) образец возбуждается коротким импульсом лазерного излучения, длительность которого намного меньше, чем время жизни возбужденных частиц, и экспоненциальный профиль затухания измеряется как функция времени.Затухание флуоресценции обычно является моноэкспоненциальной функцией для одного флуорофора, но может иметь гораздо более сложный характер, если возбужденное состояние имеет многочисленные пути релаксации, доступные в окружающей среде. Синусоидально-модулированный свет от непрерывного лазера, соединенного с акустооптическим модулятором, используется для возбуждения флуорофора в экспериментах в частотной области (рис. 10(b)). Возникающее флуоресцентное излучение модулируется синусоидально на той же частоте, что и возбуждение, но сопровождается фазовым сдвигом и уменьшением глубины модуляции.В случае одного экспоненциального затухания время жизни флуоресценции можно рассчитать, определив либо степень фазового сдвига ( f ), либо коэффициент модуляции ( M ), используя уравнения, представленные на рисунке 10(b). Если два значения идентичны, затухание флуоресценции действительно состоит из одной экспоненциальной функции. Когда присутствует более одного флуоресцентного вида (или один флуорофор находится в сложной среде), сдвиг фазы и время жизни модуляции следует оценивать в широком диапазоне частот.

Метод временной области для измерения времени жизни флуоресценции в основном основан на подсчете одиночных фотонов и требует системы обнаружения с достаточным временным разрешением, чтобы собрать почти 100 процентов фотонов, генерируемых каждым импульсом возбуждения. Хотя методы с фазовым разрешением относительно менее требовательны к работе, они, как правило, не так чувствительны, как метод подсчета фотонов. Когда фазовая модуляция используется для разрешения сложного времени жизни мультифлуорофоров, длительное время воздействия повреждающего возбуждающего освещения может оказаться чрезмерным для некоторых образцов, а также может не обеспечить достаточного временного разрешения для процессов живых клеток.Предпочтительный метод зависит как от информации, необходимой для исследования, так и от типа исследуемого образца.

Измерения времени жизни флуоресценции оказались чувствительным индикатором FRET и имеют особые преимущества в исследованиях живых клеток из-за независимости измерений времени жизни от таких факторов, как концентрация и длина пути света, которые трудно контролировать в живых образцах. Основное преимущество проведения исследований FRET путем измерения времени жизни флуоресценции заключается в том, что можно различить перенос энергии даже между парами донор-акцептор с похожими спектрами излучения.При непосредственном измерении времени жизни флуоресценции (в отличие от использования стационарных значений) определение FRET возможно без фотодеструкции донорных или акцепторных флуорофоров. Поскольку FRET уменьшает время жизни флуоресценции донорной молекулы за счет передачи энергии акцептору, прямое сравнение времени жизни донора в присутствии акцептора ( t(DA) ) со временем жизни в отсутствие акцептора ( t( D) ), позволяет вычислить значение эффективности FRET ( E(T) ) для каждого пикселя изображения.

В зависимости от метода измерения продолжительности жизни флуоресценции требуют, чтобы образец подвергался воздействию либо высокочастотных повторяющихся импульсов возбуждающего света, либо непрерывного синусоидально-модулированного света. В исследованиях с живыми клетками всегда необходимо оценивать эффект высокоинтенсивного освещения. Независимо от метода эталонное время жизни донора без акцептора должно быть определено в экспериментальных условиях, идентичных условиям измерения донор-акцептор.Одним из способов достижения этого с одним образцом является измерение времени жизни только донора после фотообесцвечивания акцептора после эксперимента по передаче энергии.

Выводы

В биологических исследованиях наиболее распространенными применениями переноса энергии флуоресцентного резонанса являются измерение расстояний между двумя участками макромолекулы (обычно белка или нуклеиновой кислоты) или изучение in vivo взаимодействия между биомолекулярными объектами.Белки можно метить синтетическими флуорохромами или иммунофлуоресцентными флуорофорами, чтобы они служили в качестве донора и акцептора, но достижения в области генетики флуоресцентных белков теперь позволяют исследователям метить определенные белки-мишени различными биологическими флуорофорами, имеющими различные спектральные характеристики. Во многих случаях аминокислота триптофан используется в качестве внутреннего донорного флуорофора, который может быть связан с любым количеством внешних зондов, служащих акцептором.

Если макромолекулы помечены одним донором и акцептором, и расстояние между двумя флуорохромами не изменяется в течение времени жизни донора в возбужденном состоянии, то расстояние между зондами можно определить по эффективности переноса энергии посредством измерений в стационарном состоянии, как обсуждалось выше.В случаях, когда расстояние между донором и акцептором колеблется вокруг кривой распределения, например, белковые сборки, мембраны, одноцепочечные нуклеиновые кислоты или развернутые белки (см. сценарии, представленные на рис. 11), FRET можно использовать для изучения явлений, но предпочтительны измерения продолжительности жизни с временным разрешением. Несколько биологических приложений, подпадающих под оба случая, проиллюстрированы на рисунке 11, включая конформационные изменения, диссоциацию или гидролиз, слияние мембраноподобных липидных везикул и взаимодействия лиганд-рецептор.

Хотя существуют различные методы измерения переноса энергии флуоресцентного резонанса в оптическом микроскопе, ни один из них не лишен недостатков. Некоторые методы требуют более сложного и дорогого оборудования, в то время как другие основаны на предположениях, которые необходимо тщательно проверить. Некоторые подходы подходят для фиксированных образцов, но не могут быть применены к системам живых клеток, в то время как другие методы должны включать значительные корректирующие расчеты или алгоритмы анализа данных.Однако несомненно, что FRET-анализ показывает большие перспективы для дальнейшего развития полезности и масштабов биологических приложений. В последние годы произошли значительные улучшения в инструментарии, особенно в отношении методов с временным разрешением.

Измерения времени жизни флуоресценции, которые в прошлом выполнялись с огромными трудностями, теперь поддерживаются развитыми пикосекундными и наносекундными технологиями. Успехи в разработке флуоресцентных зондов привели к созданию более мелких и более стабильных молекул с новыми механизмами прикрепления к биологическим мишеням.Также были разработаны флуорофоры с широким диапазоном времени жизни в возбужденном состоянии, и значительные усилия прилагаются для разработки большего разнообразия генетических вариаций флуоресцентных белков. Совершенно новые классы флуоресцентных материалов, многие из которых меньше, чем предыдущие флуорофоры и позволяют оценивать молекулярные взаимодействия на более низких расстояниях разделения, обещают улучшить универсальность мечения и привести к новым применениям метода FRET.

Соавторы

Брайан Герман и Виктория Э.Centonze Frohlich — Отделение клеточной и структурной биологии, Центр медицинских наук Техасского университета, 7703 Floyd Curl Drive, Сан-Антонио, Техас 78229.

Джозеф Р. Лакович — Центр флуоресцентной спектроскопии, кафедра биохимии и молекулярной биологии, Мэрилендский университет и Институт биотехнологии Мэрилендского университета (UMBI), 725 West Lombard Street, Baltimore, Maryland 21201.

Томас Дж. Феллерс и Майкл В.Дэвидсон — Национальная лаборатория сильного магнитного поля, 1800 г., восток, доктор Пол Дирак, Университет штата Флорида, Таллахасси, Флорида, 32310.

---

НАЗАД К ФЛУОРЕСЦЕНТНОЙ МИКРОСКОПИИ

Вопросы или комментарии? Отправить нам письмо.

© 1998-2021 автор Майкл В. Дэвидсон и Государственный университет Флориды. Все права защищены. Никакие изображения, графика, сценарии или апплеты не могут быть воспроизведены или использованы каким-либо образом без разрешения владельцев авторских прав.Использование этого веб-сайта означает, что вы соглашаетесь со всеми правовыми положениями и условиями, изложенными владельцами.

Этот веб-сайт поддерживается нашей командой

Graphics & Web Programming Team
. в сотрудничестве с Optical Microscopy в
Национальной лаборатории сильного магнитного поля.

Последнее изменение: пятница, 13 ноября 2015 г., 13:19

Количество обращений с 26 ноября 2004 г.: 84000

Для получения дополнительной информации о производителях микроскопов

используйте кнопки ниже для перехода на их веб-сайты:

Оценка степени молекулярного контакта между поверхностями целлюлозных волокон с помощью FRET-микроскопии

Резонансный перенос энергии Фёрстера (FRET)

Следующее краткое введение в теорию Фёрстера взято из книги Б.W. Van der Meer (Meer 2013) и частично основан на оригинальных статьях Фёрстера. Эффективность передачи энергии между донорным и акцепторным красителем зависит от расстояния между двумя молекулами и в принципе определяется радиусом Фёрстера (\(\text {R}_0\)). Радиус Фёрстера можно рассчитать для каждой комбинации донорных и акцепторных молекул, как видно из дополнительной информации (таблица S1). \(\text {R}_0\) специфичен для каждой пары донор-акцептор в конкретной системе.6} \end{выровнено}$$

(1)

, где r обозначает расстояние между донором и акцептором, а \(\text {R}_0\) обозначает радиус Фёрстера пары донор-акцептор. Практически эффективность FRET можно измерить различными методами, которые могут быть реализованы либо в установках микроскопии, либо измерены спектрофотометрически, оба из которых использовались в этой статье.

Независимо от метода измерения процесс FRET можно обнаружить по различным аспектам эффекта.FRET изменяет интенсивность излучения донора (гашение донора), интенсивность излучения акцептора (сенсибилизация акцептора), время жизни флуоресценции донора (измерения времени жизни) и поляризацию света (измерения анизотропии). Здесь мы использовали два наиболее распространенных метода измерения FRET, а именно тушение донора (DQ) и сенсибилизацию акцептора (AS). Тушение донора измеряет уменьшение флуоресценции донора из-за FRET. Сенсибилизация акцептора измеряет увеличение флуоресценции акцептора из-за FRET.Хотя DQ является показанием для FRET, в этом нельзя быть уверенным, поскольку существуют другие механизмы, такие как гашение концентрации, которые могут деактивировать возбужденный донор. AS, с другой стороны, предоставляет убедительные доказательства FRET, поскольку флуоресценция акцептора может быть увеличена только за счет некоторого переноса энергии (Meer 2013). Отличный обзор о реализации и подводных камнях метода предоставлен Broussard et al. (2013). Одна важная часть использования FRET, которую следует упомянуть здесь, заключается в тщательной проверке того, действительно ли сигнал действителен, особенно когда спектроскопические данные недоступны.Это можно сделать с помощью отрицательных контролей, динамического FRET или применения более одного метода FRET.

Материалы

Красители 7-(диэтиламино)кумарин-3-карбогидразид (DCCH, Purity \(95{\%}\), CAS: 100343-98-4) и флуоресцеин-5-тиосемикарбазид (FTSC, Purity \ (99{\%}\), CAS: 76863-28-0) были куплены у Santacruz Biotechnology. Растворители N,N-диметилформамид (ДМФ), тетрагидрофуран (ТГФ) и ацетонитрил были приобретены у VWR. Все химические вещества использовали без дополнительной очистки.Поли(2-гидроксиэтилметакрилат) (pHEMA) для производства тонких пленок был приобретен у Sigma Aldrich. Модельные пленки наносились на ПЭТ-фольги. Используемая целлюлоза представляла собой небеленую крафт-целлюлозу из хвойной древесины промышленного производства.

Подготовка образцов

Для исследования волокон целлюлозы [беленая крафт-древесина, соотношение ель/сосна (90/10)] образцы готовили, как описано Thomson et al. (2007). Волокна окрашивали в 15 мл раствора того или иного красителя в ДМФА (1 ммоль/л и 0.2 ммоль/л) в течение ночи при pH 5, доведенном добавлением HCl. Красители образуют метастабильную связь с восстанавливающим концом молекулы целлюлозы, и при добавлении HCl это равновесие смещается в сторону метастабильных видов связи. После окрашивания к раствору немедленно добавляли боргидрат натрия \(\hbox {NaBH}_4\) (0,02 ммоль \(\text {NaBH}_4\) на 0,5 г волокон) и оставляли для реакции на 1 час. Боргидрат натрия приводит к восстановительному аминированию красителей с целлюлозой, что приводит к ковалентной связи между реагентами.После этого восстановительного аминирования образцы сначала промывали в ДМФА и снова промывали экстракцией по Сокслету ацетонитрилом в течение по крайней мере 4 ч для удаления любого нековалентно связанного красителя. Затем окрашенные волокна хранили в водном буферном растворе с рН 9, используя 0,4 г/л буры. Волокнистые связки были приготовлены путем скрещивания одного волокна, окрашенного DCCH, и одного волокна, окрашенного FTSC, в капле воды (рН 9) и последующей их сушки в листовом формирователе Rapid Köthen. Затем для микроскопии соединения волокон переносили на предметные стекла для микроскопии.Пересечения волокон (отрицательный контроль для FRET) готовили путем простого пересечения двух волокон и покрытия их покровным стеклом для микроскопии.

Модельные пленки готовили методом докторблейдинга \(500\, {\upmu}\hbox {L}\) \(10{\%}\) pHema в растворе 95/5 EtOH/h3O, смешанном с растворенными красителями. в ТГФ на ПЭТ-пленку. Это привело к ок. \(1,5\,{\upmu}\hbox {м}\) толстая пленка. Для обеспечения щелочных условий к раствору добавляли объем \(12\,{\upmu}\hbox {L}\) триэтиламина. Фольгу ПЭТ перед ракельной обработкой очищали ацетоном.\circ \hbox {C}\) для \(3\,\hbox {h}\) для формирования контакта. Концентрации и применяемые методы измерения для образцов можно увидеть в таблице 1.

Таблица 1 Концентрации и параметры для измерений FRET

FRET из спектрофотометрии

Спектры флуоресценции регистрировали на спектрофлуорофотометре RF-5301PC от Shimadzu. Эксперименты FRET проводились с концентрациями молекул, показанными в таблице 1. Также были приняты меры, чтобы свести к минимуму экспозицию любого из образцов окружающему свету, чтобы избежать фотообесцвечивания.Модельные пленки были, с одной стороны, исследованы с использованием этой флуорометрической установки, а с другой стороны, они были исследованы с помощью широкопольного микроскопа с наборами фильтров, показанными в таблице 2. Спектры пленок pHema были записаны с использованием установки, показанной на рис. 3. Образцы исследовались под углом, который позволяет избежать обнаружения прямого отраженного света и измеряет только флуоресценцию, исходящую от образца.

Рис. 3

Установка для измерения пленок pHema во флуорометрии.В и настройка объясняется более подробно. Он был выбран таким образом, чтобы отраженный (REFL) пучок, следующий за возбуждением (EX) образца, не попадал на детектор и детектировался только сигнал флуоресценции, испускаемый (EM) непосредственно от образца. a – c Образцы донора, акцептора и донора-акцептора по мере их исследования

Эффективность переноса энергии FRET рассчитывается на основе измеренных спектров и поясняется на рис.4. За счет переноса энергии излучение донора гасится (\(\text {I}_{DA}\)) по отношению к нормальному излучению донора (\(\text {I}_{D}\) ). Энергия, не излучаемая донором, затем передается акцептору и увеличивает (или делает чувствительным) излучение (\(\text {I}_{AD}\)) по сравнению с нормальной чувствительностью акцептора (\(\text {I} _{А}\)). Спектральное перекрытие, показанное на рис. 4, является необходимым требованием для FRET и в значительной степени определяет диапазон расстояний эффекта, как видно из уравнения.{1/6}$$

(2)

\(\text {R}_0\) — радиус Ферстера, k — фактор ориентации, n — показатель преломления, (\(\text {Q}_{D}\)) квантовый выход донора и J интеграл перекрытия. Радиус Фёрстера определяет расстояние передачи энергии, поскольку известно, что количественная оценка FRET возможна только в пределах расстояний в диапазоне от \((\frac{1}{2} — 2) \text {R}_0\), как также показано на рис. 2. Подробное описание того, как определить радиус Фёрстера, можно найти в книге FRET — Резонансная передача энергии Фёрстера Мединца и Хильдебрандта (Меер, 2013).

Рис. 4

Спектры возбуждения и испускания типичной пары донор-акцептор. FRET влияет на интенсивность эмиссии донора (тушение донора) и интенсивность эмиссии акцептора (сенсибилизация акцептора). Также показано спектральное перекрытие спектра излучения донора и спектра возбуждения акцептора.

Спектры флуоресцентного излучения DCCH и FTSC в определенной степени перекрываются, как показано на рис. 7. Поэтому для точного измерения эффективности FRET спектры должны быть спектрально несмешанными.Для этого в спектрометре мы аппроксимировали пики излучения и использовали площадь под пиками в качестве интенсивности аппроксимированного сигнала. Практически это было сделано путем подгонки гауссовых пиков к зарегистрированным спектрам излучения чистого образца донора (получил \(\text {I}_{D}\)), чистого образца акцептора (получил \(\text {I} _{A}\)) и представляющий интерес образец (полученный в результате \(\text {I}_{DA}\) и \(\text {I}_{AD}\)) как на рис. 11. Полные параметры установки можно найти в дополнительной информации (рисунок S3 и таблица S2).Полученная информация об интенсивности использовалась с уравнениями. 3 и 4, чтобы получить эффективность FRET. Для тушения донора (уравнение 3) и акцепторной сенсибилизации (уравнение 4) использовались следующие уравнения.

$$\begin{aligned} \eta _{FRET}= 1 — \frac{I_{DA}}{I_D} \end{aligned}$$

(3)

$$\begin{aligned} \eta _{FRET}= \left( \frac{I_{AD}}{I_A} — 1\right) \frac{\epsilon _A}{\epsilon _D} \end{ выровнено}$$

(4)

\(\epsilon _{A}\) и \(\epsilon _{D}\) — коэффициенты экстинкции акцептора и донора на длине волны возбуждения (Meer 2013; Clegg 1992, 1995).Соотношение \(\frac{\epsilon _{A}}{\epsilon _{D}}\) было определено равным 0,02, и его можно найти в дополнительной информации (таблица S1). Сенсибилизация акцептора и эмиссия донора показаны на рис. 4.

FRET по данным оптической микроскопии

Бумажные волокна исследовали с помощью установки широкопольной микроскопии (WM), оснащенной наборами фильтров, показанными в таблице 2. WM работал с Галогенная лампа мощностью 50 Вт и КМОП-детектор компании QI Imaging (Optimos).

Таблица 2 Наборы фильтров, используемые для флуоресцентной микроскопии

Интенсивность лампы и чувствительность детектора зависят от длины волны и были скорректированы путем расчета поправочных коэффициентов из спектра излучения лампы, сложенного с фильтрами возбуждения, и коэффициента экстинкции и чувствительность детектора, сложенная с эмиссионными фильтрами и эмиссионными спектрами.Эти поправочные коэффициенты применялись к записанным изображениям, чтобы получить истинное представление об измеренной интенсивности.

Схематическое изображение окрашенных волокон и пленок pHema можно увидеть на рис. 5. Изображения окрашены в искусственные цвета, чтобы подчеркнуть различия между волокнами и пленками. Образцы исследовались при увеличении в \(400\крат) для волокон и при увеличении в \(50\крат) для пленок. Для минимизации фонового шума микроскоп помещали в коробку, обтянутую черной тканью.

Рис. 5

Изображения волокнистой связи a a и пересечения pHema b a в искусственных цветах, измеренные в широкопольном флуоресцентном микроскопе. В b также показаны типичные области интереса для алгоритмов Xia. Области выбираются так, чтобы свести к минимуму рассеянный свет от другого волокна/пленки

При использовании микроскопа спектр заменяется пространственной информацией, и теряется преимущество применения этого простого метода подгонки, описанного выше.Здесь сложный алгоритм, который приводит к полностью скорректированному показателю эффективности FRET, был разработан Gordon et al. (1998). В методе используются изображения, записанные с тремя разными наборами фильтров из Таблицы 2 для трех разных образцов. Обычно это приводит к девяти изображениям, но с расположением, показанным на рис. 5, можно получить ту же информацию только из трех изображений, поскольку в каждом изображении автоматически есть чистый донор, чистый акцептор и область FRET. включены.Подробное описание алгоритма см. в оригинальной статье (Гордон и др., 1998). Вкратце, этот метод вычисляет интенсивность FRET, скорректированную для всех возможных сценариев спектрального просачивания, в соответствии со следующими уравнениями.

$$\begin{align} {\overline{Afa}}= \frac{Af — \left(\frac{Ad}{Fd}\right) Ff}{1 — \left( \frac{Fa}{ Aa}\right) \left( \frac{Ad}{Fd}\right) } \end{aligned}$$

(5)

$$\begin{aligned} FRET1= \frac{\left( Ff — \left( \frac{Fd}{Dd}\right) Df — {\overline{Afa}}\left[ \left( \frac {Fa}{Aa}\right) — \left( \frac{Fd}{Dd}\right) \left( \frac{Da}{Aa}\right) \right] \right) }{G \left[ 1 — \left( \frac{Da}{Fa}\right) \left( \frac{Fd}{Dd}\right) \right] } \end{aligned}$$

(6)

$$\begin{align} {\overline{Dfd}}= Df + FRET1 \left[ 1 — G\left(\frac{Da}{Aa}\right) \right] — {\overline{Afa} }\left( \frac{Da}{Aa}\right) \end{aligned}$$

(7)

$$\begin{align} FRETN= \frac{FRET1}{{\overline{Afa}} * {\overline{Dfd}}} \end{align}$$

(8)

Уравнения состоят из переменных с двумя буквами.Первая буква обозначает использованный набор фильтров, как показано в Таблице 2, вторая буква обозначает исследуемый образец (d = только донор, a = только акцептор, f = FRET-площадь). Например. Таким образом, Af обозначает область FRET (связанную область), исследованную с помощью набора акцепторных фильтров. Переменные представляют собой измеренные интенсивности света из вышеупомянутых изображений микроскопа, записанных как 16-битные значения серого. \({\overline{Afa}}\) относится к акцепторному сигналу, который был бы, если бы не было донора и, следовательно, не произошло FRET.Точно так же \ ({\ overline {Dfd}} \) относится к сигналу донора, который был бы, если бы не присутствовал акцептор и, следовательно, не произошло FRET. Интересующие области были выбраны на изображениях, как показано на рис. 5b. Оценка производилась попиксельно. G — это коэффициент, связывающий потерю сигнала донора с увеличением сигнала акцептора (см. Таблицу дополнительной информации S3). В этой работе мы использовали несколько иной алгоритм Xia et al. который отличается только нормализацией значения \(\text {N}_{\text {FRET}}\), но в остальном эквивалентен алгоритму Гордона (Xia and Liu 2001).

$$\begin{align} N_{FRET} = \frac{FRET1}{\sqrt{{\overline{Afa}}*{\overline{Dfd}}}} [-] \end{align}$$

(9)

Рис. 6

Демонстрация FRET-анализа соединения волокон и и пересечения волокон b . В и можно увидеть две типичные проблемы с анализом. Сначала часто обнаруживался высокий сигнал FRET на краях как склеиваемой области, так и волокон. Во-вторых, сильный ложноположительный сигнал FRET можно увидеть в области, в которой явно невозможно проявить FRET.На микроскопическом изображении можно увидеть метод эрозии, использованный для анализа.

Для возможности воспроизвести область молекулярного контакта был разработан метод, позволяющий всегда выбирать подходящую область. Метод заключался в ручном рисовании ROI (области интереса), захватывая «оптически связанную» область на рис. 6. Затем мы применили эрозию изображения, чтобы избежать краев, и, таким образом, получили размытую ROI (рис. 6, нижние изображения), которая затем использовали для оценки интенсивности FRET. Было необходимо избегать краев, потому что области чрезвычайной интенсивности, по-видимому, дают ложноположительный сигнал FRET.Кроме того, ложные срабатывания также были обнаружены в областях, в которых невозможно показать FRET, например в области, показанной на рис. 6a, которая не находится в связанной области.

Другие эксперименты FRET

Здесь следует упомянуть, что использовались и другие эксперименты FRET. Конфокальный лазерный сканирующий микроскоп (CLSM, Leica TCS SPE) с фотоумножителем от Hamamatsu был использован для исследования фотообесцвечивания акцептора и сенсибилизированного излучения акцептора в связях волокно-волокно. Идея заключалась в том, что благодаря превосходной настройке будет достигнуто лучшее соотношение сигнал/шум.

Дополнительные приложения для микроскопии – обзор FRET-Oxford Instruments

FRET (иногда называемый Förster Resonance Energy Transfer ) позволяет определить близость двух флуорофоров. FRET является одним из ряда методов одиночных молекул, таких как TIRF, SIM и локализация сверхвысокого разрешения, которые приобрели популярность в последние годы. Резонансная передача энергии происходит только на очень короткие расстояния, обычно в пределах 10 нм, и включает прямую передачу энергии возбужденного состояния от донорного флуорофора к акцепторному флуорофору в качестве альтернативы затуханию флуоресценции от донора.При переносе энергии молекула акцептора переходит в возбужденное состояние, из которого происходит эмиссионный распад (всегда с большей длиной волны, чем у акцепторного излучения). Возбуждая донора, а затем контролируя относительное излучение донора и акцептора последовательно или одновременно, можно определить, когда произошел FRET и с какой эффективностью.

Флуорофоры

можно использовать для специфической маркировки представляющих интерес биомолекул, а условие расстояния для FRET имеет порядок диаметра большинства биомолекул (1–10 нм).Это означает, что FRET можно использовать для определения того, когда и где две или более из этих меченых биомолекул (обычно белков) взаимодействуют в своем физиологическом окружении. Сигнал FRET, соответствующий определенному месту на изображении микроскопа, обеспечивает дополнительную точность определения расстояния, превышающую оптическое разрешение (~ 0,25 мм) светового микроскопа. Помимо пространственной близости, для эффективного FRET пара красителей FRET также должна демонстрировать значительное перекрытие спектра возбуждения донора со спектром поглощения акцептора.Именно эта характеристика составляет один из экспериментальных парадоксов FRET:

.

• Спектральные профили пары FRET не могут быть разделены настолько, чтобы иметь плохое перекрытие,
• , однако желательно избежать «перекрестных помех» между двумя каналами изображения, т. е. в идеале комплект эмиссионных фильтров донора должен собирать только свет от донора и ничего от акцептора, и наоборот.

На практике этого можно достичь с помощью фильтров с короткой полосой пропускания, которые собирают свет только с более коротковолновой стороны донорного излучения и более длинноволновой стороны акцепторного излучения.Это может несколько ограничить поток фотонов как от донора, так и от акцептора во время типичного облучения, особенно если учесть, что эти измерения лучше всего проводить в условиях пониженной мощности возбуждения, чтобы мы не ускоряли скорость обесцвечивания. Это означает, что для экспериментов FRET требуются сверхчувствительные детекторы .
Примеры пар красителей FRET включают:

• БФП-ГФП
• CFP-dsRED
• БФП-ГФП
• Cy3-Cy5
• CFP-YFP
• Alexa488-Alexa555
• Alexa488-Cy3
• Alexa594-Alexa647
• ФИТЦ-ТРИТЦ
• Тербий (III)-флуоресцеин
• DiSBAC4(3)-CC2-DMPE (пара FRET, чувствительная к напряжению)

Профиль для пары красителей CFP-YFP FRET показан ниже:

Спектральные профили поглощения и излучения пары CFP-YFP FRET.

Камеры iXon EMCCD компании Andor, являющиеся ключевым компонентом платформы конфокальной визуализации живых клеток Dragonfly или в составе другой конфокальной системы, являются хорошо зарекомендовавшими себя детекторными решениями для визуализации FRET. EMCCD обеспечивает определение с высоким разрешением и высоким отношением сигнал-шум (S/N) 90 917 FRET-взаимодействий 90 918 по всей отображаемой области или объему клетки и помогает справиться с низкими уровнями фотонов, присутствующими при использовании узкополосных фильтров. В сочетании с тщательным выбором наборов фильтров это обеспечивает высокую целостность данных FRET.Поскольку EMCCD преодолевают предел обнаружения минимального уровня шума при любой скорости считывания, молекулярные взаимодействия можно динамически отслеживать с высокой точностью. Кроме того, мощность возбуждения часто может быть снижена, а это означает, что фототоксические эффекты и эффекты фотообесцвечивания сведены к минимуму, так что молекулярные взаимодействия можно отслеживать в течение гораздо более длительных периодов времени. Для получения дополнительной информации о выборе детектора для исследований одиночных молекул, пожалуйста, ознакомьтесь со статьей Какой детектор лучше всего подходит для исследований одиночных молекул?

1.О Х-К и др. (2019) Быстрое и простое обнаружение охратоксина А с использованием переноса энергии флуоресцентного резонанса в иммуноанализе с латеральным потоком (FRET-LFI)Toxins 11(5), 292; https://doi.org/10.3390/toxins11050292
2. Hu J. et al (2018) Объединение антенн из золотых наночастиц с одномолекулярной флуоресцентной резонансной передачей энергии (smFRET) для изучения динамики шпилек ДНК Nanoscale,10, 6611-6619 10,1039 /C7NR08397A
3. Чаурасия КР, Даме РТ (2018) Одномолекулярный FRET-анализ ДНК-связывающих белков.В: Peterman E. (eds) Single Molecule Analysis. Methods in Molecular Biology, vol 1665. Humana Press, New York, NY
4. Юнг С. и др. (2018), Мониторинг состояния связывания/диссоциации и окислительно-восстановительного состояния отдельных ионов переходных металлов в режиме реального времени. Бык. Корейский хим. Соц., 39: 638-642. doi:10.1002/bkcs.11443

Структура раствора комплекса ESCRT-I по данным малоуглового рассеяния рентгеновских лучей, ЭПР и FRET-спектроскопии цитокинез в клетках животных и отпочкование ВИЧ-1 из макрофагов и Т-лимфоцитов человека.ESCRT-I представляет собой гетеротетрамер Vps23, Vps28, Vps37 и Mvb12. Были определены кристаллические структуры основного комплекса и варианта убиквитина E2 и С-концевых доменов Vps28, но внутренняя гибкость предотвратила кристаллизацию интактного ESCRT-I. Здесь мы охарактеризовали структуру ESCRT-I в растворе путем одновременного уточнения структуры против малоуглового рассеяния рентгеновских лучей и двойной электронно-электронной резонансной спектроскопии спин-меченых комплексов. Ансамбль из по крайней мере шести структур, включающий равномерную смесь закрытых и открытых конформаций, был необходим для соответствия всем данным.Этот структурный ансамбль прошел перекрестную проверку по спектроскопии FRET одиночных молекул, которая предположила наличие континуума открытых состояний. Таким образом, ESCRT-I в растворе, по-видимому, состоит примерно на 50% из одной или нескольких связанных закрытых конформаций, а остальные 50% заполняют континуум открытых конформаций. Эти конформации обеспечивают контрольные точки для структурного пути, с помощью которого ESCRT-I индуцирует мембранные зачатки.

Комплекс эндосомальной сортировки, необходимый для транспорта (ESCRT) Комплексы необходимы для подавления убиквитин-зависимых рецепторов, биогенеза мультивезикулярных телец (MVB), почкования ВИЧ-1 и большинства других оболочечных вирусов, а также цитокинеза (1, 2) .От дрожжей до человека, ESCRT высвобождают мембранные почки от цитозоля и отщепляют узкие шейки от их внутренней поверхности (3). ESCRT-I напрямую связывается с убиквитином через его домен варианта убиквитина E2 (UEV) (4) и функционирует с ESCRT-II, отпочковывая мембраны от цитозоля (5) по неизвестному механизму. Основной путь выхода ВИЧ-1 из инфицированных клеток — через ESCRT-I (6–9). Цитокинез требует рекрутирования ESCRT-I в среднюю часть тела (10, 11), которая является последней связью между дочерними клетками.Эти роли сделали ESCRT-I мишенью для структурного анализа и разработки противовирусных препаратов (12, 13).

ESCRT-I состоит из одной копии каждого из Vps23, Vps28, Vps37 и Mvb12 в дрожжах (рис. 1 A ). Его структура охарактеризована по частям. Были решены структуры дрожжевого (рис. 1 B ) и домена UEV человека, связанного с убиквитином (14, 15), и домена UEV человека, связанного с пептидами из ВИЧ-1 и ESCRT-0 (13, 16). ESCRT-I дрожжей связывается с ESCRT-II через С-концевой домен (CTD) Vps28 (17), структура которого установлена ​​(18, 19) (рис.1 С ). Vps23, Vps28 и Vps37 собираются посредством тримерного субкомплекса, известного как «головка» (17, 20) (рис. 1 D ). Vps23, Vps37 и Mvb12 образуют удлиненный стебель (21) (рис. 1 D ). Стебель и головка в совокупности составляют ядро. Четыре другие области отсутствуют в решенных структурах. Линкер Pro-rich из 60 остатков соединяет UEV и стеблевые части Vps23 и включает последовательность локализации среднего тела (22). Гибкий линкер из 30 остатков соединяет головную часть и CTD Vps28.Предсказанная N-концевая спираль (NTH; рис. 1 E ) Vps37 является основной, предположительно в основном спиральной и способствует связыванию с мембраной (21). Гибкие гидрофобные остатки на С-конце Mvb12 могут представлять собой убиквитин-связывающий домен (23). Фундаментальным для понимания механизма опосредованного ESCRT-I почкования мембран является лучшее понимание расположения функциональных доменов в трех измерениях.

Рис. 1.

Структурные домены и сайты мечения. ( A ) Схема домена четырех субъединиц ESCRT-I, окрашенных синим (Vps23), красным (Vps28), серым (Vps37) и оранжевым (Mvb12), демонстрирующая умозрительную модель их ориентации относительно шейки мембранная почка, адаптированная из исх.3. ( B ) UEV домен Vps23. ( C ) CTD Vps28. ( D ) Сердечник в сборе. ( E ) NTH из Vps37. Сконструированные остатки Cys показаны в модели заполненных сфер.

ESCRT-I является представителем класса сигнальных, транспортных и регуляторных белков в этом диапазоне размеров, которые содержат по своей природе неупорядоченные области. Этот класс представляет собой фундаментальную нерешенную проблему для структурных биологов. Наличие гибких участков препятствует кристаллизации интактного ESCRT-I, тогда как низкая молекулярная масса комплекса (108 кДа) препятствует проведению ЭМ-анализа отдельных частиц.

Мы сообщаем здесь о попытке построить окончательную структуру раствора интактного ESCRT-I и разработать подход к структурному анализу белковых комплексов среднего размера с областями внутреннего беспорядка. Малоугловое рассеяние рентгеновских лучей (SAXS) и решение ЯМР представляют собой мощную комбинацию (24), потому что глобальная информация о форме от SAXS дополняет ограничения ЯМР ближнего действия. Естественным аналогом этого подхода для более крупных комплексов является объединение SAXS со спектроскопическими методами, которые дают ограничения более дальнего действия за счет использования сайт-специфического или селективного мечения.Эти методы включают двойной электрон-электронный резонанс (DEER) (25) и FRET-спектроскопию (26). Данные SAXS, DEER и FRET были собраны для ESCRT-I в растворе. Была разработана структура молекулярного моделирования для совместного уточнения структур белковых комплексов по сравнению с SAXS и спектроскопическими данными, что привело к улучшенной модели полной структуры ESCRT-I. Мы показываем, что ESCRT-I в растворе находится в равновесии между примерно равными популяциями открытых и закрытых конформаций. Мы описываем эти популяции в терминах набора из шести структур, которые служат снимками более крупного континуума состояний.

Результаты

SAXS ESCRT-I.

Структуру раствора полноразмерных дрожжей, не содержащих Cys, ESCRT-I анализировали методом SAXS. Кривая I ( q ) и q показала характеристики q = 0,5 Å ^-1 (рис. 2 A ). Было определено, что максимальный размер белка D _max составляет 225 Å (рис. 2 C ). Данные SAXS первоначально были проанализированы путем генерации конвертов ab initio (27). Получившаяся таким образом оболочка (рис.2 D ) был удлиненным и имел большую долю на одном конце и меньшую долю на другом. Оболочка позволила нам сделать визуально удовлетворительную подгонку ядра ESCRT-I, поместив ножку в удлиненный центр оболочки и головку в одну долю (рис. 2 E ). Однако на оболочке не хватало деталей для позиционирования областей UEV, CTD и NTH. Действительно, график Кратки (рис. 2 B ) характерен для частично развернутого или иным образом некомпактного белка (28).Учитывая доказательства внутренней гибкости соединительных областей ESCRT-I, уместность моделирования этих областей в оболочке ab initio в уникальной конформации априори неясна.

Рис. 2.

МУРР ЭСКРТ-I. ( A ) Подгонка смоделированных кривых рассеяния [ I ( q )] к наблюдаемому рассеянию ESCRT-I. ( B ) График Кратки тех же экспериментальных данных и смоделированного рассеяния , показанного в A . Экспериментальные точки данных I ( q ) в A и B представляют собой среднее значение 10 последовательных измерений одного и того же образца, а планки ошибок представляют собой стандартную ошибку среднего значения.( C ) Функция распределения пар [ P ( r )] для ESCRT-I. ( D ) Молекулярная оболочка ab initio для ESCRT-I. ( E ) Наложение двух улучшенных EROS структур ESCRT-I. ( F ) Соответствие экспериментальных данных SAXS A значениям, вычисленным на основе структур, подходящих как для данных SAXS, так и для данных DEER.

Доработка ансамбля SAXS ESCRT-I.

Для выборки физических конфигураций ESCRT-I мы использовали крупнозернистую модель связывания белков (29).Ядро, Vps23-UEV, Vps28-CTD и Vps37-NTH рассматривали как жесткие домены. Взаимодействия между доменами обрабатывали на уровне остатков с помощью парных потенциалов, зависящих от аминокислот, и электростатических взаимодействий типа Дебая-Хюккеля. Гибкие линкерные пептиды, соединяющие четыре жестких домена, представлены в виде гранул аминокислот на полимере с соответствующими потенциалами растяжения, изгиба и торсионного угла. Моделирование методом Монте-Карло ESCRT-I проводили с использованием исходной модели, основанной на кристаллических структурах дрожжей Vps23 UEV [идентификационный код банка данных белков (PDB) 1UZX], дрожжей Vps28 CTD (идентификационный код PDB 2J9U), дрожжей ESCRT-I. ядро (идентификационный код PDB 2P22), модель NTH в спиральной конформации и линкеры, созданные в стерически разрешенных, но в остальном произвольных конформациях.Полученные 10 000 конформаций были сгруппированы и подогнаны под экспериментальную кривую I ( q ) с использованием программы SAXS (EROS) (30) для уточнения ансамбля. Приемлемая подгонка может быть получена как минимум с двумя конформациями с одинаковым весом (рис. 2 A ). Однако ни одна конформация не соответствовала данным I ( q ). Одна из двух конформаций более закрытая (черная, рис. 2 E ), а другая более открытая (желтая, рис.2 E ). В более закрытой структуре домены UEV и CTD приближаются близко к стеблю в «цис», так что они оба находятся на одной стороне стебля. UEV и CTD не соприкасаются друг с другом даже в более закрытой конформации.

В более открытой конформации CTD находится дальше от стебля, но все еще находится на -цис-грани , тогда как UEV отклонился от стебля, выступая за кончик стебля. В более открытой конформации нет прямых контактов ни UEV, ни CTD с ядром.Без взаимодействий, удерживающих эти домены на месте, открытая конформация, вероятно, представляет ансамбль структур, которые заполняют аналогичный рассеивающий объем в растворе. Этот анализ привел нас к выводу, что по крайней мере половина популяции комплексов ESCRT-I в растворе принимает динамическую структуру, в которой UEV и CTD подвижны по отношению к ядру.

DEER EPR Анализ ESCRT-I.

Четыре набора уникальных пар Cys были сконструированы в конструкции дрожжей ESCRT-I, не содержащей Cys, и помечены спиновым зондом (1-оксил-2,2,5,5-тетраметил-∆3-пирролин-3-метил). метантиосульфонат (MTSL).Пары Cys были выбраны с использованием уточненных EROS структур для ограничения наиболее неоднозначных междоменных расстояний. Остатки, подвергшиеся воздействию растворителя, в кристаллизованных областях были выбраны, чтобы не мешать сборке комплекса. Пара Vps28 Cys27—Vps37 Cys173 была выбрана в области кристаллизованной головки в качестве контроля. Остальные три пары были разработаны для измерения положения одного из основных функциональных доменов относительно ядра. Vps23 Cys108—Vps23 Cys256 позволил измерить разделение ядра UEV.Vps28 Cys65—Vps28 Cys 151 и Vps23 Cys223—Vps37 Cys12 использовали для измерения разделения CTD-ядра и NTH-ядра, соответственно.

Каждый меченый образец ESCRT-I дал интерпретируемые спектры DEER (рис. 3). В гауссовой подгонке контрольная пара Vps28 Cys27-Vps37 Cys173 дала резко пиковое распределение P ( r ) с центром в 52 Å (таблица S1). Положения меток MTSL были смоделированы на структурах с использованием соответствующего распределения конформеров MTSL (31).Для контрольной пары распределение P ( r ), рассчитанное по смоделированным координатам MTSL, отлично согласуется с экспериментом (рис. 3, Top ). Таким образом, эта метка MTSL достоверно сообщала об известном внутрикомплексном расстоянии в ESCRT-I. Образцы Vps23 Cys108—Vps23 Cys256 и Vps23 Cys223—Vps37 Cys12 дали P ( r ) распределений в гауссовых аппроксимациях, которые были примерно в два раза шире, чем внутриядерные P ( r ), описанные выше (таблица  ) (таблица  )Из широких распределений P ( r ) для пар UEV-, CTD- и NTH-ядро мы заключаем, что все эти домены мобильны по отношению к ядру.

Рис. 3.

ОЛЕНЬ ЭСКРТ-I. ( Левый ) Экспериментально наблюдаемая (твердая) модуляция V ( t ) вместе с точками, рассчитанными по шести структурным кластерам. ( Right ) Гистограммы расстояний MTSL, рассчитанные по моделям. Зеленые кривые на верхних панелях показывают результаты гауссовой регуляризации.

Комбинированный SAXS и DEER Уточнение.

Во избежание внесения артефактов, зависящих от регуляризации, в уточнение структуры, структуры уточнялись непосредственно по измеренным данным V ( t ) DEER. Процедура EROS (30) была изменена, чтобы обеспечить одновременную подгонку данных SAXS и DEER с минимальным набором структур. При уточнении по ансамблю веса структур w _k варьировались для улучшения согласия между вычисленными усредненными по ансамблю величинами ) ( t ) и измеренные I ^набл ( q ), сигналы.Чтобы найти минимальный набор структур, которые совместно учитывают данные SAXS и DEER, функция была минимизирована численно с использованием алгоритма поиска Монте-Карло, в котором веса структур варьировались между w _k  = 0 и w _k  = 1 при ограничении . В приведенной выше формуле параметр μ управляет количеством n структур с ненулевыми весами w _k  > 0, что позволяет нам идентифицировать минимальный набор репрезентативных структур.Для малых параметров µ ≪ 1 мы получили очень хорошее соответствие экспериментальным данным ( χ ²  < 1) со многими структурами в уточненном ансамбле ( n ≫1). При больших параметрах µ  > 1 ансамбль содержал очень мало структур с ненулевыми весами, но согласие с экспериментальными данными было неудовлетворительным ( χ ² было значительно больше 1). Баланс был достигнут при μ = 0,2, когда мы получили хорошие совпадения для всех наборов экспериментальных данных ( х ² ≈ 1) только с n = 6 структур (рис.2 F и 3).

Качественно ансамбль из шести структур (рис. 4) напоминает открытую и закрытую конформации, используемые для подбора данных SAXS, и заполняет одну и ту же общую область пространства. Наиболее закрытая из шести конформаций SAXS-EPR напоминает закрытую конформацию SAXS (рис. 2 E ). Другая структура имеет UEV, CTD и NTH, смещенные от ядра в сильно растянутом состоянии. Остальные четыре имеют один или два домена в более закрытых состояниях. UEV откидывается назад к цис-стороне стебля.В каждой из трех структур с закрытой конформацией UEV, UEV заполняет одинаковую область пространства, но разные поверхности UEV взаимодействуют с немного разными частями ядра. В одной из структур сайт связывания убиквитина (14) закрыт. NTH загибается вдоль стебля таким образом, что аналогичные области пространства заполняются. Опять же, в каждом случае точный угол между NTH и ножкой различается, как и детали молекулярных контактов. Два из трех закрытых состояний CTD включают упаковку против дистального конца головки, которая образована N-концевой половиной субъединицы Vps28.Эти закрытые конформеры заполняют одну и ту же область пространства и контактируют с одной и той же частью головки, но четырехспиральный пучок CTD повернут на 120° друг от друга в двух состояниях. В третьем состоянии CTD также контактирует с N-концевой половиной Vps28, но в этом случае заполнена немного другая область пространства, и CTD направлен назад к цис-стороне ядра. Точные конформации закрытого состояния каждого из трех доменов различаются настолько, что нельзя сделать надежные выводы о подробной природе закрытого состояния или даже о том, существует ли единственная закрытая конформация.Примечательно, что даже в самых открытых конформациях избегается пространство на «транс» стороне стебля. Таким образом, даже в контексте очень гибкой и динамичной структуры домены явно предпочитают занимать одни области пространства другим.

Рис. 4.

Структура решения ESCRT-I. Структуры показаны с их относительным весом, полученным в результате подгонки, в процентах. Субъединицы окрашены, как на рис. 1.

Массовые измерения FRET.

Мы стремились провести перекрестную проверку уточненной структуры ESCRT-I с исключением независимых данных из уточнения.Массовые данные о времени жизни FRET были получены на образце, меченном Atto488 и Atto594 на Cys137 и Cys223 Vps23, которые находятся на домене UEV и стебле, соответственно. Эта пара обеспечивает независимую проверку разделения ядра UEV, в отличие от пары Cys108-Cys256, меченной MTSL, используемой при уточнении. Время жизни донора оказалось равным τ _D = 3,7 нс, которое уменьшалось в присутствии акцептора до τ _DA = 3,4 нс (рис.С1). Эффективность FRET, рассчитанная по структурам (см. SI Methods ), составила E = 0,11, что хорошо согласуется со средней эффективностью E = 0,09, измеренной в эксперименте с объемным FRET.

Одномолекулярный FRET.

Чтобы обеспечить независимую проверку пары Vps28 Cys65–Cys151, пара была помечена Alexa488 и Alexa594. На рис. 5 A и B сравниваются измеренные гистограммы эффективности FRET (светло-коричневые широкие столбцы) с гистограммой, рассчитанной на основе модельных структур (черные узкие столбцы).Чтобы проверить сборку ESCRT-I при концентрации 40 пМ, используемой для этих экспериментов, FRET также измеряли между межсубъединичной парой Vps28 Cys27 — Vps37 Cys173 (рис. S2). Экспериментальная эффективность FRET, < E _APP > = N _A / ( N / ( N / ( N _A + N _D ), рассчитанный из 2-мсных банок, содержащих более 50 фотонов (рис. 5 A ) или более 110 фотонов (рис.5 B ), были преобразованы в истинные FRET-эффективности, 〈 E 〉, после поправки на фон и донорную утечку в акцепторный канал с использованием коэффициента γ для корректировки различий в эффективности обнаружения Донорские и акцепторы каналы и различия в квантовых урожаях доноров и акцепторных красителей как < E > = N _A / ( N _A + γn _D ), где γ  = 2 определено из измерений времени жизни донора (32).

Рис. 5.

Одномолекулярный FRET. Сравнение экспериментальных (светло-коричневые широкие столбцы) и рассчитанных (черные узкие столбцы) гистограмм эффективности FRET с использованием расстояний между красителями для модельных структур для порогового числа фотонов ( n _T ) из ( A ) 50 и ( B ) 110 со временем бина ( T _бин ) 2 мс. На экспериментальной гистограмме эффективность FRET каждого бина составляла γ с поправкой после вычитания среднего фонового фотона (донор: 0.6 мс ^-1 ; акцептор: 1,1 мс ^-1 ) и поправку на утечку флуоресценции донора в акцепторный канал (6%). Всплески флуоресценции от молекул, меченных только донором ( E  < 0,18), были исключены, и данные были предварительно отфильтрованы для удаления всплесков фотонов, в которых происходило мерцание или обесцвечивание. ( C ) Предполагаемая модель открытого состояния ESCRT-I ( Верх ), состоящего из континуума конформаций, находящихся в равновесии с закрытым состоянием ( Низ ), состоящего из одной или нескольких связанных конформаций.

Проверка модели по измерениям FRET. Эффективность

FRET была рассчитана для двойного мутанта Vps28 Cys65/Cys151 и в целом хорошо согласуется с экспериментом (рис. 5 A и B ). Низкоэффективный хвост измеренного распределения не наблюдается на предсказанной гистограмме. Что еще более важно, предсказанная гистограмма содержит два отчетливых пика при E ∼ 0,60 и E ∼ 0,85, которые окружены одним широким пиком экспериментальной гистограммы.Эта разница более заметна в распределении, полученном из бинов с более высоким фотонным порогом ( n _T ) из 110 фотонов, где ширина дробового шума уже (рис. 5 B ). Возможные источники этой разницы в измеренных и предсказанных гистограммах: ( i ) взаимное преобразование между кластерами конформаций в течение 2-мс интервала времени, что приводит к образованию интервалов с эффективностью FRET, промежуточной между закрытыми и открытыми конформациями, ( ii ) ориентационное движение красителей сравнимо или медленнее времени бина из-за прилипания красителей к белку, что дает диапазон значений фактора ориентации κ ² , и ( iii ) предсказанные структуры не включают конформации с промежуточной эффективностью FRET.

Первая возможность была оценена с использованием простой кинетической модели обратимых конформационных изменений между двумя состояниями, при этом каждый из трех кластеров в открытом или закрытом наборе конформаций рассматривался как одно состояние. Эту модель сравнивали с гистограммами эффективности FRET, построенными с различными временными интервалами, как описано в SI Analysis , из чего мы пришли к выводу, что динамика, скорее всего, не является причиной расширения экспериментальной гистограммы. Вторая возможность была рассмотрена путем измерения значений поляризационной анизотропии для донорных и акцепторных красителей.Анизотропия ценность донора ( R _{A A ) выше, чем ожидалось от срока службы доноров ( τ D ) и время переориентационного корреляции ( τ C ) приблизительно 0,74 нс для свободно переориентирующих красителей, определенное из измерений анизотропии с временным разрешением (33) (см. Таблицу S2). Время переориентационной корреляции красителей ( τ c ), рассчитанное из и θ  = 0 (угол между диполями поглощения и излучения), составляет 1–2 нс, что указывает на то, что динамика красителя не добавляет ширины к гистограмме эффективности FRET превышает вклад дробового шума ( Анализ SI ), но может, поскольку κ ² ≠ 2/3, привести к небольшому сдвигу пиков эффективности FRET по сравнению с пиками, соответствующими свободно переориентирующемуся красители.Вывод из приведенного выше анализа заключается в том, что единственный широкий пик измеренной гистограммы, вероятно, отражает наличие дополнительных конформаций, еще не учтенных при моделировании.}

Обсуждение

Здесь мы применили комбинацию методов — SAXS, DEER и FRET — которые исследуют общую форму вместе с расстояниями между конкретными парами остатков в ESCRT-I.

Наблюдения здесь подтверждают предположение, что каждый дополнительный метод добавляет к общему информационному содержанию и более четко определяет структуру решения.Набор из трех значений R _H для конструкций ESCRT-I ранее можно было интерпретировать с точки зрения одной открытой структуры (21). Данные SAXS могут соответствовать как минимум двум структурам, одной открытой и одной закрытой. Данные SAXS и DEER вместе могут быть согласованы как минимум с шестью, охватывая спектр более открытых и закрытых конформаций UEV, CTD и NTH по сравнению с ядром. В более ранней гидродинамической модели ЭСКРТ-I находился полностью в открытом состоянии. Действительно, информативность предыдущего гидродинамического исследования, включавшего только три точки данных, была недостаточной для определения более чем одного состояния для трех доменов.Основное открытие, которое следует из настоящего анализа, — это непредвиденное существование примерно 50% популяции закрытых конформаций.

Одним из самых неожиданных аспектов анализа было ограничение, налагаемое информацией о распределении в спектрах DEER. Для трех пар домен-ядро каждый из этих спектров приводил к широкому распределению P ( r ) в аппроксимации Гаусса. Хотя эти распределения не использовались при уточнении, широкий набор из шести структур, возникших в результате уточнения, отражает ту же лежащую в основе конформационную гетерогенность.Гистограммы FRET для одной молекулы обеспечивают прямое измерение отобранного конформационного пространства. Пара ядро-метка CTD показала один очень широкий пик на гистограмме, который отлично перекрывался с расчетной гистограммой, что дает нам уверенность в модели, полученной из SAXS и DEER. Широкий и относительно бесхарактерный характер эффективности FRET подчеркивает вероятное присутствие промежуточных конформаций между шестью структурами, используемыми для соответствия данным SAXS и DEER. Важно отметить, что нет никаких доказательств того, что существует ровно шесть (или какое-то другое конкретное число) дискретных конформаций.Мы рассматриваем эти шесть структур как снимки, которые охватывают и представляют большее конформационное пространство, выбранное ESCRT-I (рис. 5 C ), концепция, поддерживаемая гистограммами FRET и широкими распределениями P ( r ) из ОЛЕНЬ.

В текущей модели почкования мембран, управляемого ESCRT, несколько копий ESCRT-I и -II собираются, образуя кольцо на шейке почки (3). Локализация ESCRT-I на шейках почек in vitro непосредственно наблюдалась (5), но природа и структура предполагаемой связанной с мембраной сборки ESCRT-I-II неизвестны.У дрожжей внутрипросветные везикулы (ILV) в MVB имеют диаметр 22–26 нм (34). Предполагая, что шейка почки имеет такие же размеры, что и сама почка, подразумевается, что окружность шейки почки составляет приблизительно 75 нм. При максимальном размере 22 нм, показанном здесь, по крайней мере четыре комплекса ESCRT-I, выровненные встык, потребуются, чтобы охватить шейку почки. Внутренняя гибкость, наблюдаемая примерно для 50% комплексов ESCRT-I в растворе (рис. 5 C , Top ), позволит комплексу регулировать свою структуру по пути биогенеза почки.После включения ESCRT-II в связанную с мембраной сборку предсказывается единственная конформация, возможно, соответствующая закрытому состоянию, наблюдаемому в другой примерно 50% популяции раствора (рис. 5 C , Bottom ). Структура раствора будет полезна в качестве ориентира для структурного пути сборки ESCRT-I-II, ответственного за индукцию шейки почки. Хотя SAXS невозможен в условиях мембраны из-за рассеяния от липосом, методы DEER и FRET могут быть перенесены.Т.о., сравнение спектров в растворе и в условиях, связанных с мембраной, может обеспечить первый шаг к пониманию конформационных изменений, вовлеченных в формирование сборки шейки почки. Роль конформационных изменений в ESCRT-I-опосредованном почковании ВИЧ-1 является еще более актуальным вопросом. Эти спектроскопические методы также должны быть переносимы в условиях ВИЧ-1, как только можно будет воссоздать реакцию почкования ВИЧ in vitro.

Успехи и ограничения этого анализа предлагают уроки для интеграции глобальных и специфичных для сайта структурных данных о частично гибких комплексах.Анализ EROS данных SAXS выявил ансамбль структур, способных соответствовать данным, но не имел информации об отчетливом поведении отдельных доменов. Маркировка для конкретного места предоставила мощную дополнительную информацию. Специфическое для сайта спиновое мечение и спектроскопия DEER предоставили прямые доказательства того, что каждый отдельный домен был конформационно гетерогенным по отношению к ядру, вывод, который мы не могли бы сделать только на основе анализа SAXS. Мы использовали другой специфичный для сайта структурный зонд, FRET-спектроскопию, для проверки выводов, сделанных двумя другими методами, и для выявления присутствия конформационных промежуточных продуктов, которые не были обнаружены другими методами.Мультисубъединичные комплексы представляют собой серьезную проблему в структурной биологии, и интеграция ограничений из нескольких методов, вероятно, будет иметь решающее значение для развития молекулярного понимания функции.

Материалы и методы

При уточнении ансамбля количество N и вес w _k структур k в ансамбле были получены путем одновременной подгонки к данным SAXS и DEER. Интенсивность рассеяния I _k ( q ) структуры k рассчитывали, как в [2].30 и усредненные по ансамблю. Отклонения от измеренной интенсивности МУРР I ^obs ( q ) были количественно определены путем суммирования по N _q q точек с константа, определяемая условием . Чтобы уточнить данные DEER, возможные конформации шести меток MTSL на доменах ESCRT-I были созданы с помощью многомасштабного моделирования модуля макромолекулярной системы Matlab (31). Путем соответствующего переноса и поворота координат MTSL ротамеры располагались на жестких доменах всех структур ESCRT-I в ансамбле.Для каждой пары меток MTSL ( i , j ) и конфигурации k комплекса ESCRT-I в ансамбле была рассчитана функция эволюции диполя с Среднее значение получено по всем конформациям метки MTSL, где r _αβ расстояние между спиновыми метками α и β, прикрепленными к остаткам i и j соответственно. Для проверки модели DEER метки MTSL были присоединены к остаткам 27 и 173 на том же жестком домене.Таким образом, рассчитанная функция эволюции диполя V _(27,173) ( t ) одинакова для каждой структуры k и хорошо согласуется с измеренным сигналом DEER (см. рис. 3, Top ). ). Для остальных трех пар меток ( i , j ) = (108,256), (12, 223) и (65, 151) функция дипольной эволюции усреднялась по ансамблю. Отклонения от измеренных сигналов DEER были определены количественно, по которым суммируется по N _t точек на кривой, при этом глубина модуляции λ получена из .Статистическая погрешность оценивалась по уровню шума в экспериментальных данных.

Благодарности

Мы благодарим B. Beach и M. Kostelansky за подготовку конструкции ESCRT-I, не содержащей Cys, и A. Bax за обсуждения. Данные SAXS были собраны в Стэнфордской лаборатории синхротронного излучения (SSRL), национальном пользовательском объекте, управляемом Стэнфордским университетом от имени Министерства энергетики США, Управления фундаментальных энергетических наук. Программа структурной молекулярной биологии SSRL поддерживается Министерством энергетики, Управлением биологических и экологических исследований, а также Национальным институтом здравоохранения, Национальным центром исследовательских ресурсов, Программой биомедицинских технологий.Б.Р. была поддержана Международной исходящей стипендией Марии Кюри в рамках 7-й Рамочной программы Европейского сообщества. Эта работа была поддержана Внутренней программой Национальных институтов здравоохранения (NIH), Национального института диабета, болезней органов пищеварения и почек (для WAE, GH и JHH), Целевой противовирусной программой по СПИДу Управления Директор NIH (в JHH), грант NIH GM072694 (в DSC) и грант Министерства образования, молодежи и спорта Чешской Республики MSM0021620835 (в J.В.).

Сноски

• Вклад авторов: E.B., W.A.E., D.S.C., G.H., and J.H.H. проектное исследование; Э.Б., Б.Р., Д.З.Х., Х.С.С., Дж.В. и Г.Х. проведенное исследование; Э.Б., Б.Р. и Г.Х. предоставил новые реагенты/аналитические инструменты; E.B., B.R., D.Z.H., HSC, J.V., W.A.E., D.S.C., G.H. и J.H.H. проанализированные данные; и W.A.E., G.H. и J.H.H. написал бумагу.

• Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

• Эта статья является прямой отправкой PNAS.

• Эта статья содержит вспомогательную информацию в Интернете по адресу www.pnas.org/lookup/suppl/doi:10.1073/pnas.1101763108/-/DCSupplemental.

Границы | FRET в биофизике мембран: обзор

Введение

Резонансный перенос энергии Ферстера (FRET) представляет собой фотофизический процесс, при котором первоначально электронно-возбужденный флуорофор, называемый донором (D), передает свою энергию возбуждения (и, таким образом, гасится) другому хромофору, называемому акцептором (A), электронный спектр поглощения которого перекрывает эмиссию D.Последний, первоначально находящийся в основном электронном состоянии, при переносе возбуждается и может (или не может) флуоресцировать. FRET не включает ни испускание фотонов, ни молекулярный контакт между двумя видами, но сильно зависит от расстояния между ними. Для изолированной пары донор-акцептор коэффициент скорости (первого порядка) FRET-взаимодействия пропорционален обратной шестой степени этого расстояния (Förster, 1949). Характерной длиной FRET является радиус Фёрстера, R ₀ , определяемый как расстояние донор/акцептор, для которого FRET в данной паре D/A эффективен на 50% (то есть столь же вероятен, как и другие процессы D затухание возбуждения).На практике диапазон расстояний, для которого чувствителен FRET, находится между 0,5 R ₀ и 2 R ₀ , поскольку эффективность FRET в этом интервале варьируется от 98,5 до 1,5%. Величина R ₀ характерна для каждой пары D/A в данной среде, но обычно лежит в диапазоне 1,5–6 нм. Это означает, что FRET в основном чувствителен к расстояниям в масштабе от 1 до 10 нм, что находится за пределами досягаемости обычных методов оптической микроскопии, но полностью подходит для изучения важных вопросов биофизики мембран, таких как обнаружение и характеристика. нанодоменов/рафтов и липид-белкового или белок-белкового взаимодействия (рис. 1).

Рисунок 1. Схематическое изображение приложений FRET в биофизике мембран . Изображен только один двухслойный листок. (А) неоднородность мембраны; (B) определение поперечного расположения флуоресцентного остатка/метки; (C) белково-липидная селективность; (D) олигомеризация белка.

Можно предусмотреть различные подходы, начиная от качественных исследований изменения стационарной эффективности FRET без учета лежащей в основе кинетики и заканчивая анализом данных флуоресценции с временным разрешением с использованием соответствующих формализмов, позволяющих количественно восстановить топологическую информацию о системе при изучать.До недавнего времени эти последние сложные приложения были в основном ограничены простыми системами (обычно одно- или двухкомпонентными модельными мембранами), тогда как исследования FRET в сложных системах, таких как мембраны живых клеток (для которых получение качественных данных флуоресценции с временным разрешением было технически неосуществимо) полагались на более качественные методы лечения. В настоящее время, с огромным развитием методов, основанных на флуоресцентной микроскопии, пространственное и временное разрешение могут эффективно сочетаться с изучением реальных биологических мембран.В этом обзоре описываются основные формализмы FRET в мембранах и указываются важные иллюстративные применения FRET для решения различных проблем в мембранных системах (таблица 1).

Таблица 1 . Избранные примеры исследований мембран FRET .

Феноменологические применения FRET в мембранах

Даже если FRET используется в качестве качественного индикатора близости хромофоров, без учета его фактической кинетики, в биофизике мембран по-прежнему существует широкий спектр приложений.Кроме того, сложность некоторых систем является серьезным сдерживающим фактором для применения сложных формализмов, и единственным доступным вариантом может быть более феноменологический подход.

Классическим применением FRET является мониторинг липидного обмена или смешивания и слияния мембран, как описано Struck et al. (1981). Эти авторы следили за слиянием фосфатидилсериновых (PS) пузырьков, индуцированных ионом кальция. Были смешаны две популяции везикул, одна из которых содержала зонды D и A, а другая содержала только немеченый фосфолипид.Выбранная пара FRET состояла из меченых фосфолипидов N -(7-нитро-2,2,3-бензосадиазол-4-ил)-фосфатидилэтаноламина (NBD-PE, D) и N -(лиссамин родамин B сульфонил )-диолеоилфосфатидилтаноламин (Rh-PE, A) и с тех пор стал, вероятно, наиболее часто используемой парой в исследованиях мембранного FRET. При добавлении иона кальция слияние вызывает смешивание меченых и немеченых везикул. После перераспределения липидов путем латеральной диффузии поверхностная концентрация акцепторных зондов, окружающих каждого донора, снижается.Это приводит к уменьшению степени тушения доноров при FRET, снижается эффективность переноса энергии и, следовательно, увеличивается интенсивность эмиссии доноров. Другая возможность заключается в наблюдении за повышением эффективности FRET (снижение флуоресценции D) при смешивании популяции везикул, помеченных только D, с другой, помеченной только A, как показано в недавнем исследовании SNARE-опосредованного слияния (van den Bogaart et al. ., 2010).

При изучении латерального распределения липидов FRET между зондами с одинаковыми свойствами распределения станет более эффективным вследствие разделения фаз (и, наоборот, для зондов, демонстрирующих предпочтительность комплементарных фаз).Однако разделение зонда — не единственное явление, которое может повлиять на эффективность FRET. При изменении состава мембраны могут происходить изменения площади/липида и фотофизических параметров зонда (и, следовательно, R ₀ ), что потенциально может привести либо к ошибочной идентификации, либо к маскировке образования домена. С этой целью могут быть разработаны оригинальные схемы для более точного обнаружения начала образования домена, такие как схема, предложенная Сильвиусом (2003), в которой эффективность FRET достигается с помощью акцептора со сродством к одной из липидных фаз и двух разных доноров. которые распределяются по разным мембранным доменам, сравнивают.Пока мембрана гомогенна, изменения в составе липидов будут одинаково влиять на эффективность FRET обеих пар D/A. Однако, если домены образуются, два донора распадаются на разные фазы, и эффективность тушения для каждого из них будет сказываться противоположным образом.

Как упоминалось ниже, распределение D или A можно количественно оценить по параметрам разрешенной во времени флуоресценции D в присутствии A (анализируется в целом вместе с флуоресценцией в отсутствие A).FRET можно также использовать более простым способом в качестве индикатора предпочтения домена, примером чего является недавно предложенный «FRET assay of raft Association» (Nelson et al., 2010). Эффективность FRET между исследуемым белком (D) и одним из двух акцепторов, пирен-DOPE (предпочитает ld-фазу) и LcTMADPH (предпочитает lo-фазу), измеряют и сравнивают с эффективностью при использовании других доноров, LW-пептида (трансмембранный спиральный тип пептид с высоким сродством к ld-доменам) и холерный токсин-B (белок, который связывается с липидом, ассоциированным с рафтом, ганглиозидом GM1 и имеет очень высокое сродство к lo-доменам) в липидной смеси сосуществования ld/lo-фазы.Таким образом, в примерах этих авторов показано, что перфринголизин O имеет промежуточное сродство между рафтами пептида LW и холерного токсина-B в везикулах, содержащих упорядоченные домены, богатые сфингомиелином мозга или 1,2-дистеароил- sn -3-глицерофосфохолином ( ДСПК).

При изучении липидно-белкового взаимодействия FRET между, например, мембранным пептидом или белком D и акцепторами липидов различных классов/ацильных цепей может указывать на предпочтительную ассоциацию или селективность в отношении определенного типа липидов, а FRET между D-несущими и А-несущие мембранные белки можно использовать для обнаружения образования гетеро- или гомоолигомеров белков.В этом случае количественные модели необходимы для дальнейшей характеристики этих взаимодействий (см. Формализмы для липид-белкового или белок-белкового взаимодействия ниже).

Внутримолекулярный FRET: «спектроскопическая линейка»

Резонансный перенос энергии Фёрстера между D/A-парами, для которых расстояние D-A одинаково, например, подтвержденный в растворе двуххромофорных соединений, часто называют «внутримолекулярным» FRET. Количественное определение степени FRET определяется эффективностью FRET, E , которая рассчитывается как

.

в этом уравнении, i _D ( t ) и i _DA ( t ) — распады D в отсутствие и присутствии A (соответственно).Влияние FRET на флуоресценцию D заключается в уменьшении его времени жизни и квантового выхода. В этом простом случае закон распада D остается экспоненциальным, хотя и более быстрым, чем в отсутствие акцептора. Связь между временем жизни D в отсутствие и в присутствии A (τ ₀ и τ соответственно) определяется выражением

, где R — разделение D–A. Выражение, идентичное уравнению 2 можно записать для квантового выхода флуоресценции или стационарной интенсивности флуоресценции. R ₀ рассчитывается независимо от спектроскопических данных,

, где κ ² — фактор ориентации (подробное обсуждение см. в Van Der Meer et al., 1994), Φ _D — квантовый выход D в отсутствие A, n — показатель преломления, λ — длина волны (в единицах нм), I (λ) — нормализованный спектр излучения D, а ε(λ) — спектр молярного поглощения A. Таким образом, R легко вычисляется как из установившегося состояния, так и из времени — разрешенные данные.На этом основано использование внутримолекулярного FRET в качестве «спектроскопической линейки» (Stryer, 1978).

В контексте биофизики мембран внутримолекулярный FRET до сих пор используется для получения структурной и динамической информации о мембранных белках. Это особенно важно, учитывая, что до сих пор отсутствуют структуры высокого разрешения многих мембранных белков (традиционно получаемые с помощью рентгеновской кристаллографии, криоэлектронной микроскопии или ЯМР-спектроскопии). Сайт-направленное мечение позволяет включать подходящие донорные и акцепторные группы FRET, и на основании измерения эффективности FRET можно изучать картирование белков и/или кинетику конформационных изменений.Последние приложения перечислены и кратко описаны в таблице 1.

Равномерное распределение флуорофоров в мембранах

В мембранах каждая молекула D обычно окружена распределением молекул A. Следовательно, измерение одиночных цифро-аналоговых расстояний нецелесообразно и нецелесообразно. Затухание эмиссии D становится сложным и зависит от топологии изучаемой системы, а также от концентрации A. Аналитические решения все еще могут быть получены для равномерного распределения хромофоров.Для плоских распределений D и A распад D в присутствии A определяется Фунгом и Страйером (1978), Вольбером и Хадсоном (1979):

.

В этом уравнении γ — неполная гамма-функция, R _e — минимальное расстояние D/A (расстояние исключения), а n — численная концентрация А (молекул на единицу площади). Хотя первоначально он был получен для плоскости акцепторов, содержащей донор (перенос цис ), он также действителен, если молекула D отделена от плоскости А на расстояние R _e , что является обычной ситуацией на мембранах. поскольку D и A часто располагаются на разной глубине бислоя.

При приготовлении липидных везикул молекулы D и A часто встраиваются в любой из двухслойных листков с равной вероятностью. В этом случае для данного D необходимо рассматривать две плоскости А, одну из которых соответствуют акцепторам, лежащим в том же бислойном листке, что и донор, а другую — расположенным в противоположном листочке. Закон затухания в этом случае получается простым умножением собственного затухания D на члены FRET, соответствующие каждой плоскости A.

Другим обычным явлением в мембранных системах является сложный распад D даже в отсутствие A, при этом для правильного описания требуется сумма двух или трех экспонент.В этом случае можно по-прежнему использовать приведенные выше уравнения при условии, что экспоненциальный член собственного распада D заменяется этой функцией, а τ ₀ заменяется средним по интенсивности (Lakowicz, 2006) временем жизни распада. Это связано с тем, что каждый компонент времени жизни характеризуется различным значением R ₀ , пропорциональным обратной шестой степени соответствующего квантового выхода флуоресценции Φ _D (уравнение 3). Если все эти компоненты имеют одинаковые радиационные постоянные распада (обычно хорошее приближение), их значения Φ _D , в свою очередь, пропорциональны значениям τ ₀ .Это означает, что скорости FRET для данного A, расположенного на расстоянии R [определяемом как (1/τ ₀ )( R ₀ / R ) ⁶ ], одинаковы независимо от D рассматривается компонент времени жизни, поскольку он является инвариантным (Loura et al., 1996, 2000b). Из-за этого постоянства уравнение 4 можно использовать со средними значениями R ₀ и τ ₀ . Вариант здесь состоит в том, чтобы использовать спектроскопический R ₀ (рассчитанный с экспериментальным, усредненным значением Φ _D ) и истинное статистическое среднее τ ₀ , которое является средней интенсивностью.

Для стационарных приложений уравнение. 4 можно проинтегрировать численно (в программе или электронной таблице) для получения кривых эффективности FRET E (рассчитанной с использованием уравнения 1) как функции концентрации акцептора n с R _e в качестве параметра. Альтернативно, R _e фиксируется, и экспериментальные затухания/эффективности FRET сравниваются с теоретическими ожиданиями. Возможная неудача при анализе кинетики FRET с помощью формализма равномерного распределения зонда может иметь значение (например,(например, добавление нового компонента к данной однофазной липидной двухслойной системе может вызвать компартментализацию и/или разделение фаз и, следовательно, отклонения от ожидаемого теоретического равномерного распределения).

Неравномерное распределение флуорофоров содержит топологическую информацию

Неравномерное распределение компонентов и разделение фаз являются обычными явлениями в смесях липидов. Молекулы, которые несут флуорофоры D и A в эксперименте FRET в такой системе, естественно, будут иметь неоднородное распределение после их распределения между сосуществующими фазовыми доменами.Будем считать, что присутствуют только две фазы или типа доменов (наиболее распространенная экспериментальная ситуация). Если они достаточно велики, чтобы быть бесконечными в масштабе FRET (т. е. осложнения, возникающие в результате FRET с участием молекул в разных доменах, или граничные эффекты, пренебрежимо малы; это тот случай, когда домены больше, чем ~ 5–10 R ₀ ), то закон распада донора представляет собой просто линейную комбинацию гипотетических законов распада в каждой фазе i _DA , _{фаза i} (задается формулой4), взвешенных по относительному количеству D в каждой фазе A _i (Loura et al., 2000a, 2001):

Обратите внимание, что время жизни D обычно различается в двух фазах, как и поверхностные концентрации A (и, возможно, также расстояния исключения D-A). Это вводит большое количество подгоночных параметров в уравнение. 5. Чтобы обеспечить значимое восстановление этих параметров, распад D в присутствии A анализируется в целом вместе с распадом в отсутствие A,

.

, где τ ₁ и τ ₂ — время жизни D в каждой фазе.Восстанавливаемые параметры обычно составляют τ ₁ , τ ₂ , A ₂ / A ₁ (из чего получается коэффициент распределения D K 0 A pD 90 ). две фазы, C ₁ и C ₂ (из которых получен коэффициент распределения A K _pA ; Loura et al., 2000a). Частным случаем этого формализма является так называемая ситуация «изолированных доноров», которая соответствует C ₂ = 0.

Будучи строго применимой для бесконечного фазового разделения, эта модель может быть применена к формированию наноразмерных доменов; в этом случае восстановленный коэффициент распределения A («FRET» K _pA ) не будет равен истинному коэффициенту, полученному из независимых (интенсивность флуоресценции, анизотропия или время жизни A) измерений («non-FRET» ). K _pA ), и на него влияет (будучи ближе к единице, чем значение «не-FRET») тот факт, что доноры в одной фазе чувствительны к акцепторам в другой.Степень этого отклонения отражает размер нанодоменов. В пределе очень малого размера домена (< R ₀ ) «FRET» K _пА по существу равно единице. Следовательно, этот вид анализа может дать представление о размере доменов и в случае бесконечного разделения фаз (что может быть подтверждено, если значения «FRET» и «non-FRET» K _пА неразличимы) было показано, что фазовая диаграмма бинарной смеси может быть получена из параметров распада (Loura et al., 2001). Buboltz (2007) предложил экспериментальный метод характеристики фазового разделения в липидных мембранах (и определение бинарных и тройных фазовых диаграмм в пределе бесконечной фазы), основанный на этом формализме, но опирающийся исключительно на стационарное сенсибилизированное излучение акцептора. который назвал это «Установившееся состояние пробного разделения FRET» или SP-FRET. Применения этих методологий перечислены в таблице 1.

Численное и упрощенное аналитическое рассмотрение FRET в неоднородных системах

Не получено точного решения скорости или эффективности FRET для случая неполного фазового разделения, когда в сплошной фазе диспергированы нанометровые домены данного типа.Это связано с очевидной потерей симметрии, вызванной наличием доменов. Один из способов справиться с этой сложностью — рассчитать распад D с помощью численного моделирования. По сути, процесс начинается с построения топологии липидной матрицы (т. е. определения размера моделируемой системы, формы домена, среднего размера и распределения по размерам, а затем размещения доменов на матрице, гарантируя, что общая доля каждой фазы равна как и предполагалось) и размещая молекулы D и A с учетом их доменных предпочтений.Затем выбирается данное D и вычисляется его взаимодействие со всеми акцепторами (или с теми, которые находятся в пределах нескольких R ₀ длин). Затем этот шаг повторяется для всех доноров, чтобы получить среднее значение по ансамблю для всей системы. Можно получить среднее затухание D, и, используя уравнение. 1, значение эффективности FRET.

Этот вид численного моделирования уже был описан Вольбером и Хадсоном (1979) для равномерного распределения в плоской геометрии для проверки их аналитической теории.Первое численное решение FRET для неравномерного распределения мембранных зондов было дано Снайдером и Фрейре (1982). В этой работе неоднородность распределения зондов была введена путем включения эвристической потенциальной функции в случайное размещение зондов. Следовательно, никакие домены на самом деле не моделируются, и хотя уравнения авторов подходят для анализа агрегации зондов в однофазной системе, они бесполезны для разделения фаз. Моделирование, в котором неоднородность распределения зондов вводится путем построения двухфазной системы и с учетом разделения зондов, было представлено авторами для проверки их аналитических формализмов (Loura and Prieto, 2000; Loura et al., 2001; Таулз и Дэн, 2007 г .; Тоулз и др., 2007).

Другой подход к моделированию состоит в воссоздании процессов возбуждения и девозбуждения каждой молекулы D или A путем стохастического моделирования. В этих расчетах учитываются вероятности возбуждения донора, распада донора не-FRET-процессами, FRET на заданный акцептор и девозбуждения акцептора. Эффективность FRET просто рассчитывается по соотношению между общим количеством передач и общим количеством D-возбуждений.Этот тип моделирования был применен к случаю FRET в плоской геометрии с дискообразными доменами (Kiskowski and Kenworthy, 2007).

Все предыдущие работы характеризуются предварительной фиксацией основной липидной матрицы, включая размер и форму домена, а моделирование касается исключительно расчета скоростей и вероятностей FRET. Другой подход был недавно использован Frazier et al. (2007), которые объединили статистическое моделирование механической решетки методом Монте-Карло (для описания липидной матрицы и определения в ней позиций хромофоров) с упрощенной ступенчатой ​​зависимостью расстояния FRET (считалось, что FRET имеет место тогда и только тогда, когда расстояние D-A в данной паре были менее R ₀ ) для анализа экспериментальных данных FRET в тройной смеси плот-модель.Эта работа демонстрирует, что FRET и вычислительные методы могут быть объединены для создания мощной комбинации, подходящей для изучения разделения липидной фазы.

Преимущество численного моделирования в глобальном масштабе состоит в том, что оно позволяет рассчитывать FRET в системах, для которых из-за их сложности точное решение невозможно. Однако до сих пор они не позволяют напрямую анализировать экспериментальные данные, поскольку в реальном эксперименте ожидается много степеней свободы. Для каждого моделирования необходимо зафиксировать значения для R ₀ , времени жизни D, расстояния исключения D/A (все они могут различаться в каждой сосуществующей фазе), формы и размера домена, а также коэффициентов разделения D и A.Эта множественность переменных исключает возможность подгонки простыми эмпирическими функциями, которые могли бы описать, например, изменение эффективности FRET в зависимости от концентрации А в общем виде, удобном для большинства исследователей. Изучение конкретной системы требует индивидуальной настройки и процедур моделирования.

Альтернативой численному моделированию FRET в наногетерогенных бислоях является использование упрощенных аналитических методов, которые, в отличие от первых, потенциально могут быть пригодны для прямого анализа экспериментальных данных, позволяющего восстановить интересующие параметры.Однако этот тип формализмов характеризовался либо жесткими упрощающими приближениями (Gutierrez-Merino, 1981; Brown et al., 2007a,b), либо в некоторой степени полагался на численные результаты (Towles et al., 2007; см. Loura et al. ., 2010а для подробного обсуждения), что исключает их широкое использование.

Формализмы для липид-белкового или белок-белкового взаимодействия

Относительно простым применением FRET в мембранных системах, содержащих пептиды/белки, несущие флуоресцентные остатки (триптофан и тирозин), является определение поперечного расположения последних.Триптофан и тирозин действуют как доноры переноса энергии, поскольку они поглощают на коротких волнах, поэтому следует использовать подходящие акцепторы с известным положением в мембране (см. табл. 1). Поскольку эффективность переноса зависит от расстояния исключения D-A, значение R _e (и, следовательно, поперечное расположение) может быть получено путем подгонки уравнений 1 и 4 к экспериментальным данным. Ряд стеариновых кислот, дериватизированных антроильным хромофором, доступен и очень подробно описан в литературе (см.г., Блатт и др., 1984). Поскольку спектры поглощения различных акцепторов практически неизменны, радиус Фёрстера для всех постоянен, а для триптофана в виде D он близок к R ₀ = 25 Å. Можно показать, что при R _e > примерно 1,7 R ₀ получается зависимость типа Штерна–Фольмера (Shaklai et al., 1977; Dewey, Hammes, 1980), выражающаяся очень простое уравнение

, где I _DA и I _D обозначают стационарную интенсивность излучения D в присутствии и в отсутствие A соответственно.В то время как уравнения 4 и 7 предполагают аксиальное распределение хромофоров A вокруг остатка D, Yguerabide (1994) обобщил теорию, включив случай, когда D не находится на оси симметрии меченого белка, и распространил ее действие на случаи, когда R _e < R ₀ , неизбежно с некоторой дополнительной сложностью.

Белки, включенные в модельные мембраны, содержащие липиды с различными электростатическими свойствами или гидрофобными длинами, могут проявлять селективность к одному липидному компоненту на границе белок-липид, что традиционно рассматривалось с помощью спектроскопии электронного спинового резонанса (Marsh and Horváth, 1998).Однако практически идентичную информацию можно получить с помощью FRET. Качественная информация легко получается путем сравнения степени FRET от белка до флуоресцентно меченных липидов различных классов/ацильных цепей, как упоминалось выше. Было предложено несколько количественных моделей, которые недавно подверглись критическому анализу (Loura et al., 2010b). В таблице 1 перечислены приложения этих формализмов к экспериментальным данным FRET.

Описание белок-белковых взаимодействий с использованием FRET с участием двух различных меченых производных белков или пептидов было описано более 30 лет назад.В уже ставшей исторической статье, используя простой формализм, который пренебрегал межмолекулярным FRET, но принимал во внимание различные схемы олигомеризации (димеры/тримеры/тетрамеры), Витч и Страйер (1977) подтвердили, что гипотеза образования димеров грамицидина (D: дансил-грамицидин C; A: производное 4-(диэтиламино)-фенилазобензол-4-сульфонилхлорида грамицидина C) лучше соответствует модели, чем сценарии образования как тримера, так и тетрамера. Агрегация белков мембраны хромаффинных гранул, меченных йодоаминонафтилсульфонатом малеимида (D) и флуоресцеин-ацетатом ртути или флуоресцеин-5-малеимидом (А), была качественно подтверждена Morris et al.(1982) при добавлении иона кальция. После этих ранних исследований FRET стал важным инструментом для характеристики агрегации белков/пептидов. Необходимо тщательно выбирать формализм, который будет использоваться для анализа данных, поскольку ранние модели сосредоточены на внутриагрегатном переносе энергии, пренебрегая межмолекулярным FRET «свидетеля» (например, Adair and Engelman, 1994; Li et al., 1999). Это приближение, как правило, справедливо только в пределах очень разбавленных меченых белков и обычно используется в недавних работах по применению FRET или резонансного переноса энергии биолюминесценции (BRET, см.g., James et al., 2006) к изучению олигомеризации мембранных белков, приведенному в таблице 1. Другие подходы направлены на вычисление чистого внутриагрегатного члена (см. недавний пример Raicu, 2007). Следует отметить, что сочетание внутриагрегатных и межмолекулярных терминов следует проводить осторожно. В частности, неправильно вычитать чистую межмолекулярную эффективность из комбинированной межагрегатной и межмолекулярной FRET (You et al., 2005). Если популяция доноров подвергается тушению двумя разными типами акцепторов (т.g., связанные и несвязанные с данным донором), правильный способ расчета эффективности FRET состоит в том, чтобы умножить члены FRET, соответствующие всем вкладам тушения, чтобы получить i _DA ( t ), и конец (уравнение 1). Примером этого является недавнее исследование, в котором сделан вывод о том, что N-концевой домен N-BAR образует антипараллельные димеры в 1-пальмитоил-2-олеоил- sn -глицеро-3-[фосфо-рац-(1-глицерин)] (POPG) везикулы (Fernandes et al., 2008).

FRET с диффузионным усилением

В предыдущих разделах предполагалось, что поступательная диффузия как D, так и A пренебрежимо мала в течение времени жизни возбужденного состояния D, т. е. условие ≪ 1 (где D _DA — сумма коэффициентов боковой диффузии D и A, а с — среднее расстояние D—A).В противном случае быстрая диффузия хромофора приводит к увеличению скорости FRET, что можно интуитивно понять, если учесть, что пара D/A, первоначально разделенная большим расстоянием, которое предотвратило бы FRET, может стать достаточно близкой для возникновения FRET с высокой скоростью. вероятность в течение времени жизни возбужденного состояния D вследствие диффузии.

Общая теория FRET с усилением диффузии была создана Steinberg and Katchalski (1968) и подтверждена экспериментально Thomas et al.(1978). Особый интерес представляет так называемый предел быстрой диффузии, характеризуемый D _DA τ ₀ / s ² ≪ 1, что приводит к предельно упрощенным уравнениям для скорости FRET. Это условие требует времени жизни D в диапазоне от микросекунд до миллисекунд, что обычно достижимо с использованием подходящих хелатов лантанидов в качестве частиц D. Для однородного двумерного распределения незаряженных сферических хромофоров можно показать, что получается экспоненциальный распад D со временем жизни

где

Последнее уравнение (которое, как ни странно, формально идентично уравнению7, который является приблизительным решением совсем другой задачи) показывает, что скорость FRET в этом режиме сильно зависит от R _e . По этой причине FRET с пределом быстрой диффузии нашел применение для измерения расстояния до ближайшего подхода DA (где обычно вид A представляет собой белок) в 1980-х годах (примеры см. в Таблице 1). Кроме того, усиленная FRET диффузия заряженных частиц D/A чувствительна к электростатическому потенциалу и поэтому может использоваться для определения мембранных потенциалов (Meltzer et al., 2006). Удивительно, но недавних применений в мембранах было очень мало, что привело к воодушевленному комментарию: «С середины 1980-х технология [FRET с диффузионным усилением], кажется, оставалась бездействующей, ожидая подходящей возможности вернуться к жизни» (Fairclough, 2006).

Гомо-FRET против гетеро-FRET

В предыдущих разделах предполагалось, что хромофоры D и A различаются (гетеро-FRET). Это подразумевало необратимость процесса переноса, который можно было контролировать, измеряя либо степень тушения D, либо сенсибилизированную флуоресценцию A.Напротив, FRET между идентичными флуорофорами (гомо-FRET) не приводит к снижению интенсивности флуоресценции или времени жизни донора, потому что популяция возбужденного состояния донора не уменьшается во время акта переноса. На практике единственным наблюдаемым явлением, отражающим это явление, является анизотропия флуоресценции (Lakowicz, 2006), которая уменьшается вследствие гомопереноса. Для измерения анизотропии флуоресценции требуются поляризаторы, и, поскольку они приводят к значительному снижению регистрируемого излучения, часто для заданной точности требуется большее количество флуорофора (по сравнению с тем, которое используется при измерении интенсивности).В случае, если прибор не представляет проблемы, уменьшение анизотропии совершенно очевидно: если две молекулы разделены расстоянием R = R ₀ , измеренная анизотропия будет только ~ 2/3 от анизотропии молекулы. мономера, что является значительным снижением.

Несмотря на очевидное преимущество, состоящее в том, что требуется только один флуорофор, использование гомо-FRET более ограничено, чем использование гетеро-FRET. Обоснование степени деполяризации из-за гомо-FRET более сложно, чем тушение из-за гетеро-FRET, потому что: (i) существует возможность обратного переноса на непосредственно возбужденного донора или переноса на любой донор, в конечном итоге включает большое количество стадий переноса, и (ii) будучи анизотропией флуоресценции, соответствующей наблюдаемой, в дополнение к RET, другим источником деполяризации является вращение флуорофора.Если вращение и RET происходят в одном и том же временном масштабе, эти два явления связаны, что является основным препятствием для количественного анализа данных гомопереноса. Теоретические описания, которые не учитывают эти особенности должным образом (например, Yeow and Clayton, 2007), следует рассматривать с осторожностью. Несмотря на эту сложность, гомо-FRET по-прежнему регулярно используется в исследованиях мембран, в последнее время в сочетании с флуоресцентной микроскопией (см. раздел ниже и таблицу 1; Bader et al., 2011) для обнаружения и характеристики хромофора (например,г., меченый белок) конфайнмент или агрегация. В связи с этим следует отметить, что использование объективов с высокой числовой апертурой приводит к уменьшению наблюдаемой анизотропии (Axelrod, 1979). Этот артефакт можно минимизировать, используя меньшую числовую апертуру (≤0,8) с потерей разрешения и чувствительности, или скорректировать, например, с помощью стандартной молекулы (Tramier and Coppey-Moisan, 2008).

ЛАД под микроскопом

Недавние разработки в области мультиволновой визуализации и визуализации с поляризационным разрешением привели к широкому использованию FRET-визуализации в исследованиях функциональных агрегатов клеточных мембран.Экспериментальные методы визуализации мембранных микродоменов и количественной оценки эффективности FRET в FRET-микроскопии с упором на новые стратегии были рассмотрены в другом месте (Rao and Mayor, 2005; Jares-Erijman and Jovin, 2006; Owen et al., 2007; Padilla-Parra et al. ., 2008). Было разработано несколько подходов для изучения в наномасштабе специфических белок-белковых, липид-липидных или липид-белковых взаимодействий в живых клетках с использованием как гомо-, так и гетеро-FRET.

Клеточные мембраны характеризуются большим количеством липидных и белковых компонентов, находящихся в неравновесном состоянии.Одним из распространенных упрощений является предположение о двух типах доменов, например, плот/неплот или упорядоченный/неупорядоченный. Затем результаты можно сравнить, например, с сосуществованием ld/lo на фазовой диаграмме липидов в тройной модельной системе. Из-за внутренних ограничений, таких как стабильность клеток, а также из-за того, что обычно в клетках проводятся микроскопические исследования (чтобы контролировать состояние клеток, знать локализацию флуорофора и использовать сигнал, исходящий только от интересующей мембраны), интенсивность флуоресценции затухает с большое количество фотонов и низкий фоновый сигнал (необходимые для применения большинства формализмов, описанных выше) обычно невозможны.Обычно получают установившиеся данные и сравнивают их с интегрированным формализмом FRET. Даже когда с помощью микроскопии для визуализации времени жизни флуоресценции (FLIM; см. традиционно используется для расчета эффективности FRET с использованием уравнения. 1, а не непосредственно анализировать с помощью лежащей в основе кинетической модели FRET. Однако с инструментальными улучшениями, а также разработкой новых подходов к анализу (Grecco et al., 2009) эта тенденция меняется на противоположную. Избранные работы, сочетающие FRET и микроскопию, перечислены в таблице 1, в которой кратко описаны иллюстративные литературные отчеты, в которых FRET использовался (по крайней мере) в одном из приложений, описанных выше.

Заключение

В этом обзоре описаны применения FRET в биофизике мембран, в том числе исследования картирования мембранных белков, латеральной гетерогенности (мембранных доменов), определения поперечного расположения (глубины) флуоресцентных остатков/меток внутри мембраны, белково-липидной селективности ( предпочтение определенного липида рядом с белком) и олигомеризация мембранного белка.

Была рассмотрена сложность FRET в мембранах, представлена ​​оценка гетеро- и гомо-FRET, и с помощью этой методологии можно получить подробную топологическую информацию, если принять во внимание адекватное моделирование. Критически рассмотрены примеры соответствующих работ в этой области и упомянуты недавние применения FRET под микроскопом, а именно из данных с временным разрешением (FRET-FLIM). В целом подчеркивается мощь FRET как инструмента биофизики мембран.

Заявление о конфликте интересов

Авторы заявляют, что исследование проводилось при отсутствии каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могли бы быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

Благодарности

Авторы признают финансирование FEDER через программу COMPETE и FCT, ссылки на проекты FCOMP-01-0124-FEDER-010787 (FCT PTDC/QUI-QUI/098198/2008), PTDC/QUI-BIQ/099947/2008 и PTDC/QUI-BIQ/112067/2009.

Каталожные номера

Акасандреи, М. А., Дейл, Р. Э., ВандеВен, М., и Амелут, М. (2006). Двумерный резонансный перенос энергии Фёрстера (2-D FRET) и гипотеза мембранного рафта. Хим. физ. лат. 419, 469–473.

Полнотекстовая перекрестная ссылка

Аниковский М., Дейл Л., Фергюсон С. и Петерсен Н. (2008). Резонансный перенос энергии в клетках: новый взгляд на эффект фиксации и агрегацию рецепторов на клеточной мембране. Биофиз. Дж. 95, 1349–1359.

Опубликовано Резюме | Опубликован полный текст | Полный текст перекрестной ссылки

Антоллини, С.С., и Баррантес, Ф.Дж. (1998). Обнаружение дискретных участков для фосфолипидов и стеролов на поверхности раздела белок-липид в нативной мембране, богатой ацетилхолиновыми рецепторами. Биохимия 37, 16653–16662.

Опубликовано Резюме | Опубликован полный текст | Полный текст перекрестной ссылки

Бадер, А. Н., Хетцль, С., Хофман, Э.G., Voortman, J., van Bergen en Henegouwen, P.M.P., van Meer, G., и Gerritsen, H.C. (2011). Визуализация Homo-FRET как инструмент для количественной оценки кластеризации белков и липидов. Химфизхим 12, 475–483.

Опубликовано Резюме | Опубликован полный текст | Полный текст перекрестной ссылки

Блатт, Э., Шателье, Р. К., и Сойер, У. Х. (1984). Поперечное расположение флуорофоров в липидных бислоях и мицеллах, определяемое методами флуоресценции. Фотохим. Фотобиол. 39, 477–483.

Полнотекстовая перекрестная ссылка

Браун, А.С., Таулз, К.Б., и Ренн, С.П. (2007a). Измерение размера плота в зависимости от состава мембраны в системах на базе ПК: часть I – бинарные системы. Ленгмюр 23, 11180–11187.

Полнотекстовая перекрестная ссылка

Браун, А.С., Таулз, К.Б., и Ренн, С.П. (2007b). Измерение размера рафта в зависимости от состава мембраны в системах на основе ПК: часть II – тройные системы. Ленгмюр 23, 11188–11196.

Полнотекстовая перекрестная ссылка

Buboltz, J.T., Bwalya, C., Williams, K., and Schutzer, M. (2007). Картирование фазового поведения с высоким разрешением в тройной липидной смеси: зависят ли фазовые границы липид-плот от процедуры приготовления образца? Ленгмюр 23, 11968–11971.

Опубликовано Резюме | Опубликован полный текст | Полный текст перекрестной ссылки

Capeta, R.C., Poveda, J.A., and Loura, L.М. С. (2006). Неравномерное распределение мембранных зондов при резонансной передаче энергии: приложение к белково-липидной селективности. J. Флуоресц. 16, 161–172.

Опубликовано Резюме | Опубликован полный текст | Полный текст перекрестной ссылки

Ча, А., Снайдер, Г.Е., Селвин, П.Р., и Безанилла, Ф. (1999). Движение чувствительной к напряжению области в калиевом канале в атомном масштабе, измеренное с помощью спектроскопии. Природа 402, 809–813.

Опубликовано Резюме | Опубликован полный текст | Полный текст перекрестной ссылки

Роговица, р.Л., Ниту Ф., Грубер С., Колер К., Сатцер М., Томас Д. Д. и Фруен Б. Р. (2009). Картирование кальмодулина, связанного с каналом высвобождения RyR1 Ca2 ⁺ , на основе FRET. Проц. Натл. акад. науч. США 106, 6128–6133.

Опубликовано Резюме | Опубликован полный текст | Полный текст перекрестной ссылки

Корнеа Р.Л., Ниту Ф., Самсо М., Томас Д.Д. и Фруен Б.Р. (2010). Картирование белковой субъединицы FK506, связывающей рианодиновый рецептор, с использованием резонансного переноса энергии флуоресценции. Дж. Биол. хим. 285, 19219–19226.

Опубликовано Резюме | Опубликован полный текст | Полный текст перекрестной ссылки

Коутиньо, А., Лоура, Л.М.С., Федоров, А., и Прието, М. (2008). Пережатая мультиламеллярная структура агрегатов лизоцим- и фосфатидилсеринсодержащих мембран, выявленная методом FRET. Биофиз. Дж. 95, 4726–4736.

Опубликовано Резюме | Опубликован полный текст | Полный текст перекрестной ссылки

де Алмейда, Р.Ф.М., Лоура, Л.М.С., Федоров А. и Прието М. (2005). Липидные плоты имеют разные размеры в зависимости от состава мембраны: исследование переноса энергии флуоресцентного резонанса с временным разрешением. Дж. Мол. биол. 346, 1109–1120.

Опубликовано Резюме | Опубликован полный текст | Полный текст перекрестной ссылки

Доманов Ю.А., Молотковский Ю.Г. и Горбенко Г.П. (2005). Зависимые от покрытия изменения поперечного расположения цитохрома с в фосфолипидных мембранах, выявленные методом FRET. Биохим.Биофиз. Acta 1716, 49–58.

Опубликовано Резюме | Опубликован полный текст | Полный текст перекрестной ссылки

Фернандес Ф., Лоура Л. М. С., Чичон Ф. Дж., Карраскоса Дж. Л., Федоров А. и Прието М. (2008). Роль спирали 0 домена N-BAR в формировании кривизны мембраны. Биофиз. Дж. 94, 3065–3073.

Опубликовано Резюме | Опубликован полный текст | Полный текст перекрестной ссылки

Фернандес Ф., Лоура Л. М. С., Федоров А. и Прието М.(2006). Отсутствие кластеризации фосфатидилинозитол-(4,5)-бисфосфата в жидком фосфатидилхолине. J. Lipid Res. 47, 1521–1525.

Опубликовано Резюме | Опубликован полный текст | Полный текст перекрестной ссылки

Фернандес Ф., Лоура Л. М. С., Кохорст Р., Спруйт Р. Б., Хемминга М. А., Федоров А. и Прието М. (2004). Количественная оценка белково-липидной селективности с использованием FRET: применение к основному белку оболочки M13. Биофиз. Дж. 87, 344–352.

Опубликовано Резюме | Опубликован полный текст | Полный текст перекрестной ссылки

Фернандес, Ф., Loura, L.M.S., Prieto, M., Koehorst, R., Spruijt, R.B., and Hemminga, M.A. (2003). Зависимость олигомеризации белка основной оболочки M13 и латеральной сегрегации от состава бислоя. Биофиз. J. 85, 2430–2441.

Опубликовано Резюме | Опубликован полный текст | Полный текст перекрестной ссылки

Фёрстер, Т. (1949). Experimentelle und theoretische Untersuchung des Zwischenmolekularen übergangs von Elektrinenanregungsenergie. З. Натурфорш. 4а, 321–327.

Фрейзер, М.Л., Райт, Дж.Р., Покорный, А., и Алмейда, П.Ф.Ф. (2007). Исследование образования доменов в смесях сфингомиелин/холестерин/ПОФХ с помощью резонансного переноса энергии флуоресценции и моделирования методом Монте-Карло. Биофиз. J. 92, 2422–2433.

Опубликовано Резюме | Опубликован полный текст | Полный текст перекрестной ссылки

Фунг, Дж. Дж., Деупи, X., Пардо, Л., Яо, X. Дж., Велес-Руис, Г. А., Деври, Б. Т., Сунахара, Р. К., и Кобилка, Б.К. (2009). Лиганд-регулируемая олигомеризация бета(2)-адренорецепторов в модельном липидном бислое. EMBO J. 28, 3315–3328.

Опубликовано Резюме | Опубликован полный текст | Полный текст перекрестной ссылки

Гамбхир А., Хангьяс-Михалине Г., Зайцева И., Кафизо Д.С., Ван Дж., Мюррей Д., Пентяла С.Н., Смит С.О. и Маклафлин С. (2004). Электростатическая секвестрация PIP2 на фосфолипидных мембранах основными/ароматическими областями белков. Биофиз. Дж. 86, 2188–2207.

Опубликовано Резюме | Опубликован полный текст | Полный текст перекрестной ссылки

Госвами Д., Гоуришанкар К., Билграми С., Гош С., Рагхупати Р., Чадда Р., Вишвакарма Р., Рао М. и Майор С. (2008). Нанокластеры GPI-заякоренных белков формируются в результате активности кортикального актина. Сотовый 135, 1085–1097.

Опубликовано Резюме | Опубликован полный текст | Полный текст перекрестной ссылки

Гутьеррес-Мерино, К. (1981). Количественная оценка переноса энергии Фёрстера для двумерных систем.I. Латеральное разделение фаз в однослойных везикулах, образованных бинарными смесями фосфолипидов. Биофиз. хим. 14, 247–257.

Опубликовано Резюме | Опубликован полный текст | Полный текст перекрестной ссылки

Gutierrez-Merino, C., Munkonge, F., Mata, A.M., East, J.M., Levinson, B.L., Napier, R.M., and Lee, A.G. (1987). Положение сайта связывания АТФ на (Ca ²⁺ + Mg ²⁺ )-АТФазе. Биохим. Биофиз. Acta 897, 207–216.

Опубликовано Резюме | Опубликован полный текст | Полный текст перекрестной ссылки

Хардинг, П.J., Attrill, H., Boehringer, J., Ross, S., Wadhams, G.H., Smith, E., Armitage, J.P., and Watts, A. (2009). Конститутивная димеризация рецептора, связанного с G-белком, нейротензинового рецептора 1, преобразованного в бислои фосфолипидов. Биофиз. Дж. 96, 964–973.

Опубликовано Резюме | Опубликован полный текст | Полный текст перекрестной ссылки

Харикумар, К.Г., Хаппс, Р.М., и Миллер, Л.Дж. (2008). Димеризация в отсутствие олигомеризации более высокого порядка секретинового рецептора, связанного с G-белком. Биохим. Биофиз. Acta 1778, 2555–2563.

Опубликовано Резюме | Опубликован полный текст | Полный текст перекрестной ссылки

Heberle, F.A., Wu, J., Goh, S.L., Petruzielo, R.S., and Feigenson, G.W. (2010). Сравнение трех смесей тройных липидных бислоев: FRET и ESR выявляет нанодомены. Биофиз. J. 99, 3309–3318.

Опубликовано Резюме | Опубликован полный текст | Полный текст перекрестной ссылки

Эррерос, Дж., Нг, Т., и Скьяво, Г.(2001). Липидные рафты действуют как специализированные домены для связывания и интернализации столбнячного токсина в нейроны. Мол. биол. Ячейка 12, 2947–2960.

Опубликовано Резюме | Опубликован полный текст

Хофман, Э. Г., Руонала, М. О., Бадер, А. Н., ван ден Хевел, Д., Воортман, Дж., Руверс, Р. К., Верклей, А. Дж., Герритсен, Х. К., и ван Берген и Хенегоувен, П. М. П. (2008). EGF индуцирует слияние различных липидных рафтов. Дж. Сотовый. науч. 121, 2519–2528.

Опубликовано Резюме | Опубликован полный текст | Полный текст перекрестной ссылки

Джеймс, Дж. Р., Оливейра, М. И., Кармо, А. М., Ябони, А., и Дэвис, С. Дж. (2006). Строгая экспериментальная основа для обнаружения олигомеризации белков с использованием резонансного переноса энергии биолюминесценции. Нац. Методы 3, 1001–1006.

Опубликовано Резюме | Опубликован полный текст | Полный текст перекрестной ссылки

Джонсон, Д. А., и Насс, Дж. М. (1994). Сайт связывания этидия, чувствительный к гистрионикотоксину, расположен за пределами трансмембранного домена никотинового ацетилхолинового рецептора: флуоресцентное исследование. Биохимия 33, 9070–9077.

Опубликовано Резюме | Опубликован полный текст | Полный текст перекрестной ссылки

Кенворти, А.К., и Эдидин, М. (1998). Распределение гликозилфосфатидилинозитол-заякоренного белка на апикальной поверхности клеток MDCK исследовали с разрешением <100 Å с использованием переноса энергии резонанса флуоресценции визуализации. J. Cell Biol. 142, 69–84.

Опубликовано Резюме | Опубликован полный текст | Полный текст перекрестной ссылки

Кусба, Дж., Ли, Л., Грычински, И., Пищек, Г., Джонсон, М., и Лакович, Дж. Р. (2002). Коэффициенты боковой диффузии в мембранах, измеренные с помощью резонансной передачи энергии, и новый алгоритм диффузии в двух измерениях. Биофиз. Дж. 82, 1358–1372.

Опубликовано Резюме | Опубликован полный текст | Полный текст перекрестной ссылки

Лакович, младший (2006). Принципы флуоресцентной спектроскопии , 3-е изд. Нью-Йорк: Спрингер.

Ледер, Р.О., Хелгерсон С.Л. и Томас Д.Д. (1989). Поперечное расположение хромофора сетчатки в пурпурной мембране за счет диффузионно-усиленного переноса энергии. Дж. Мол. биол. 209, 683–701.

Опубликовано Резюме | Опубликован полный текст | Полный текст перекрестной ссылки

Леви, В., Росси, Дж. П. Ф. К., Кастелло, П. Р., и Флеча, Ф. Л. Г. (2003). Количественный анализ взаимодействия мембранных белков с амфифилами с использованием резонансного переноса энергии. Анал. Биохим. 317, 171–179.

Опубликовано Резюме | Опубликован полный текст | Полный текст перекрестной ссылки

Леви В., Росси Дж. П. Ф. К., Эчарте М. М., Кастелло П. Р. и Флеча Ф. Л. Г. (2000). Термическая стабильность кальциевой помпы плазматической мембраны. Количественный анализ его зависимости от липидно-белковых взаимодействий. Дж. Мембр. биол. 173, 215–225.

Опубликовано Резюме | Опубликован полный текст | Полный текст перекрестной ссылки

Ли, М., Редди, Л. Г., Беннетт, Р., Сильва, Н.Д. младший, Джонс, Л. Р., и Томас, Д. Д. (1999). Метод переноса энергии флуоресценции для анализа олигомерной структуры белка: приложение к фосфоламбану. Биофиз. Дж. 76, 2587–2599.

Опубликовано Резюме | Опубликован полный текст | Полный текст перекрестной ссылки

Лоура, Л.М.С., Коутиньо, А., Силва, А., Федоров, А., и Прието, М. (2006). Структурные эффекты основного пептида на организацию мембран дипальмитоилфосфатидилхолина/дипальмитоилфосфатидилсерина: исследование переноса энергии флуоресцентного резонанса. J. Phys. хим. В 110, 8130–8141.

Опубликовано Резюме | Опубликован полный текст | Полный текст перекрестной ссылки

Лоура Л.М.С., Федоров А. и Прието М. (1996). Резонансный перенос энергии в модельной системе мембран: приложение к гелевой и жидкокристаллической фазам. Биофиз. Дж. 71, 1823–1836 гг.

Опубликовано Резюме | Опубликован полный текст | Полный текст перекрестной ссылки

Лоура Л.М.С., Федоров А. и Прието М. (2000a).Разделение мембранных зондов в двухкомпонентной липидной системе гель/жидкость: исследование переноса энергии резонанса флуоресценции. Биохим. Биофиз. Acta 1467, 101–112.

Полнотекстовая перекрестная ссылка

Лоура Л.М.С., Федоров А. и Прието М. (2000b). Неоднородность распределения мембранных зондов: исследование резонансного переноса энергии. J. Phys. хим. В 104, 6920–6931.

Полнотекстовая перекрестная ссылка

Лоура, Л. М. С., Фернандес, Ф.и Прието, М. (2010a). Мембранная микрогетерогенность: характеристика передачи энергии резонанса Фёрстера боковых доменов мембраны. евро. Биофиз. J. 39, 589–607.

Полнотекстовая перекрестная ссылка

Лоура, Л.М.С., Прието, М., и Фернандес, Ф. (2010b). Количественная оценка белково-липидной селективности с использованием FRET. евро. Биофиз. J. 39, 565–578.

Полнотекстовая перекрестная ссылка

Лоура, Л. М. С., и Прието, М. (2000). Резонансный перенос энергии в гетерогенных планарных и двухслойных системах: теория и моделирование. J. Phys. хим. В 104, 6911–6919.

Полнотекстовая перекрестная ссылка

Марш, Д., и Хорват, Л.И. (1998). Структура, динамика и состав липидно-белкового интерфейса. Перспективы спин-маркировки. Биохим. Биофиз. Acta 1376, 267–296.

Опубликовано Резюме | Опубликован полный текст

Мельцер, Р. Х., Луртц, М. М., Вензель, Т. Г., и Педерсен, С. Е. (2006). Электростатика канала никотинового ацетилхолинового рецептора определяется диффузионно-усиленным переносом энергии люминесценции. Биофиз. Дж. 91, 1315–1324.

Опубликовано Резюме | Опубликован полный текст | Полный текст перекрестной ссылки

Мерсье, Дж. Ф., Салапур, А., Анже, С., Брейт, А., и Бувье, М. (2002). Количественная оценка гомо- и гетеродимеризации бета-1- и бета-2-адренорецепторов с помощью резонансного переноса энергии биолюминесценции. Дж. Биол. хим. 277, 44925–44931.

Опубликовано Резюме | Опубликован полный текст | Полный текст перекрестной ссылки

Мейер, Б.Х., Сегура Дж.-М., Мартинес К.Л., Ховиус Р., Джордж Н., Джонссон К. и Фогель Х. (2006). Визуализация FRET показывает, что функциональные рецепторы нейрокинина-1 являются мономерными и находятся в мембранных микродоменах живых клеток. Проц. Натл. акад. науч. США 103, 2138–2143.

Опубликовано Резюме | Опубликован полный текст | Полный текст перекрестной ссылки

Моррис, С.Дж., Судхоф, Т.С., и Хейнс, Д.Х. (1982). Обусловленный кальцием резонансный перенос энергии между флуоресцентно мечеными белками при агрегации мембран хромаффинных гранул. Биохим. Биофиз. Acta 693, 425–436.

Опубликовано Резюме | Опубликован полный текст | Полный текст перекрестной ссылки

Нараянасвами, В., и Макнами, М. Г. (1993). Белково-липидные взаимодействия и функция никотиновых ацетилхолиновых рецепторов Torpedo californica . 2. Текучесть мембраны и опосредованное лигандом изменение доступности остатков цистеина гамма-субъединицы для холестерина. Биохимия 32, 12420–12427.

Опубликовано Резюме | Опубликован полный текст | Полный текст перекрестной ссылки

Нельсон, Л.Д., Чейнтиа С. и Лондон Э. (2010). Ассоциация перфринголизина O с упорядоченными липидными доменами: значение для сродства трансмембранных белковых рафтов. Биофиз. J. 99, 3255–3263.

Опубликовано Резюме | Опубликован полный текст | Полный текст перекрестной ссылки

Номикос М., Малгрю-Несбитт А., Паллави П., Михалин Г., Зайцева И., Суонн К., Лай Ф.А., Мюррей Д. и Маклафлин С. (2007) . Связывание фосфоинозитид-специфической фосфолипазы C-ξ (PLC-ξ) с фосфолипидными мембранами. Дж. Биол. хим. 282, 16644–16653.

Опубликовано Резюме | Опубликован полный текст | Полный текст перекрестной ссылки

Падилья-Парра, С., Одуге, Н., Коппи-Мойсан, М., и Трамье, М. (2008). Количественный анализ FRET с помощью FLIM с быстрым получением данных во временной области с высоким пространственным разрешением в живых клетках. Биофиз. Дж. 95, 2976–2988.

Опубликовано Резюме | Опубликован полный текст | Полный текст перекрестной ссылки

Пап, Э.Х.В., Бастианс, П.I.H., Borst, J.W., van den Berg, P.A.W., van Hoek, A., Snoek, G.T., Wirtz, K.W.A., and Visser, A.J.W.G. (1993). Количественное определение взаимодействия протеинкиназы С с диацилглицерином и фосфоинозитидами путем обнаружения резонансного переноса энергии с временным разрешением. Биохимия 32, 13310–13317.

Опубликовано Резюме | Опубликован полный текст | Полный текст перекрестной ссылки

Пикас, Л., Суарес-Херма, К., Монтеро, М.Т., Васкес-Ибар, Дж.Л., Эрнандес-Боррель, Дж., Прието, М., и Лоура, Л. М. С. (2010). Селективность пермеазы липидов лактозы с использованием резонансного переноса энергии Фёрстера. Биохим. Биофиз. Acta 1798, 1707–1713.

Опубликовано Резюме | Опубликован полный текст | Полный текст перекрестной ссылки

Поведа, Дж. А., Энсинар, Дж. А., Фернандес, А. М., Матео, К. Р., Феррагут, Дж. А., и Гонсалес-Рос, Дж. М. (2002). Сегрегация доменов, богатых фосфатидной кислотой, в реконструированных мембранах рецепторов ацетилхолина. Биохимия 41, 12253–12262.

Опубликовано Резюме | Опубликован полный текст | Полный текст перекрестной ссылки

Шарма П., Варма Р., Сарасий Р. К., Ира, Гуссе К., Кришнамурти Г., Рао М. и Майор С. (2004). Наноразмерная организация нескольких GPI-заякоренных белков в мембранах живых клеток. Сотовый 116, 577–589.

Опубликовано Резюме | Опубликован полный текст | Полный текст перекрестной ссылки

Сильвиус, младший (2003). Перенос энергии флуоресценции выявляет образование микродоменов при физиологических температурах в смесях липидов, моделирующих внешний листок плазматической мембраны. Биофиз. Дж. 85, 1034–1045.

Опубликовано Резюме | Опубликован полный текст | Полный текст перекрестной ссылки

Стейнберг И. З. и Качальский Э. (1968). Теоретический анализ роли диффузии в химических реакциях, тушении флуоресценции и безызлучательном переносе энергии. J. Chem. физ. 48, 2404–2410.

Полнотекстовая перекрестная ссылка

Страйер, Л. (1978). Перенос энергии флуоресценции как спектроскопическая линейка. год. Преподобный Биохим. 47, 829–846.

Полнотекстовая перекрестная ссылка

Valenzuela, C.F., Weign, P., Yguerabide, J., and Johnson, D.A. (1994). Поперечное расстояние между мембраной и сайтами связывания агонистов на рецепторе ацетилхолина Torpedo: исследование флуоресценции. Биофиз. Дж. 66, 674–682.

Опубликовано Резюме | Опубликован полный текст | Полный текст перекрестной ссылки

ван ден Богаарт, Г., Холт, М.Г., Бунт Г., Ридель Д., Воутерс Ф. С. и Ян Р. (2010). Одного комплекса SNARE достаточно для слияния мембран. Нац. Структура Мол. биол. 17, 358–364.

Опубликовано Резюме | Опубликован полный текст | Полный текст перекрестной ссылки

Ван Дер Меер, Б. В., Кокер, Г. III, и Чен, С.-Ю. С. (1994). Резонансная передача энергии: теория и данные . Нью-Йорк: ВЧ.

Витч, В., и Страйер, Л. (1977). Димерная природа трансмембранного канала грамицидина А: исследования проводимости и переноса энергии флуоресценции гибридных каналов. Дж. Мол. биол. 113, 89–102.

Опубликовано Резюме | Опубликован полный текст | Полный текст перекрестной ссылки

Фон Арним, CAF, Киношита, А., Пелтан, И. Д., Тангреди, М. М., Херл, Л., Ли, Б. М., Сполген, Р., Хши, Т. Т., Ранганатан, С., Батти, Ф. Д., Лю, CX, Баскай, Б.Дж., Север, С., Иризарри, М.К., Стрикленд, Д.К., и Хайман, Б.Т. (2005). Белок, родственный рецептору липопротеинов низкой плотности (LRP), является новым субстратом бета-секретазы (BACE1). Дж.биол. хим. 280, 17777–17785.

Опубликовано Резюме | Опубликован полный текст | Полный текст перекрестной ссылки

Йегнесваран С., Вуд Г. М., Эсмон С. Т. и Джонсон А. Э. (1997). Белок S изменяет расположение активного центра активированного протеина С над поверхностью мембраны. Изучение переноса энергии флуоресцентного резонанса топографии. Дж. Биол. хим. 272, 25013–25021.

Опубликовано Резюме | Опубликован полный текст | Полный текст перекрестной ссылки

Йеоу, Э.К.Л. и Клейтон, А.Х.А. (2007). Подсчет состояний олигомеризации мембранных белков в живых клетках с помощью гомо-FRET-спектроскопии и микроскопии: теория и применение. Биофиз. Дж. 92, 3098–3104.

Опубликовано Резюме | Опубликован полный текст | Полный текст перекрестной ссылки

Ю, М., Ли, Э., Уимли, В. К., и Христова, К. (2005). Резонансный перенос энергии Фёрстера в липосомах: измерения димеризации трансмембранной спирали в природной бислойной среде. Анал. Биохим. 340, 154–164.

Опубликовано Резюме | Опубликован полный текст | Полный текст перекрестной ссылки

.