Разное

Лада гранта то 4 перечень работ: Лада Гранта — ТО на 30 000/60 000 км пробега — журнал За рулем

Содержание

Лада Гранта — ТО на 30 000/60 000 км пробега — журнал За рулем

Двигатель и его системы
Проверка отсутствия посторонних стуков и шумов на работающем двигателе
Подтяжка креплений деталей, узлов и агрегатов двигателя
Проверка токсичности отработавших газов
Замена масла и масляного фильтра
Проверка герметичности систем охлаждения, питания и выпуска отработавших газов. Оценка состояния шлангов, трубопроводов, соединений
Замена ремня привода генератора
Проверка состояния ремня привода вспомогательных агрегатов и замена при необходимости
Проверка состояния ремня привода ГРМ 16-клапанного двигателя и замена при необходимости
Проверка состояния ремня привода ГРМ 8-клапанного двигателя
Замена сменного элемента воздушного фильтра
Замена свечей зажигания
Замена топливного фильтра
Проверка работоспособности системы управления двигателем
Трансмиссия
Проверка хода педали сцепления и четкости переключения передач
Проверка отсутствия посторонних стуков и шумов при работе сцепления, коробки передач, приводов передних колес
Подтяжка креплений узлов и агрегатов трансмиссии
Проверка уровня масла в коробке передач и герметичности агрегата
Проверка состояния защитных чехлов и шарниров приводов передних колес, тяги управления коробкой передач и реактивной тяги коробки передач
Ходовая часть
Подтяжка креплений элементов передней и задней подвесок
Проверка углов установки передних колес
Проверка состояния элементов передней и задней подвесок
Проверка состояния дисков и шин, перестановка колес по схеме
Рулевое управление
Проверка исправности механизма регулировки рулевой колонки по углу наклона
Проверка суммарного люфта рулевого управления
Проверка состояния шарниров наконечников рулевых тяг, их чехлов и чехла рулевого механизма
Проверка отсутствия посторонних стуков и шумов в рулевом механизме
Проверка исправности электроусилителя рулевого управления
Тормозная система
Проверка исправности сигнального устройства уровня жидкости в бачке, герметичности гидропривода, состояния шлангов и трубок тормозной системы
Проверка исправности устройства фиксации рычага стояночного тормоза
Проверка состояния колодок, чехлов и наличия смазки направляющих пальцев тормозных механизмов передних колес
Проверка состояния колодок и пыльников колесных цилиндров тормозных механизмов задних колес
Проверка состояния тросов и регулировка стояночной тормозной системы
Проверка исправности вакуумного усилителя тормозов, регулятора давления в тормозных механизмах задних колес, положение выключателя сигналов торможения
Электрооборудование
Проверка отсутствия следов замыканий и видимых повреждений изоляции проводов
Проверка работоспособности элементов электрооборудования: генератора, стартера, световой сигнализации, освещения, контрольных приборов, очистителя и омывателя ветрового стекла, отопителя, обогрева заднего стекла, регулятора направления пучков света фар, электроприводов стеклоподъемников, электроблокировки замков дверей
Проверка уровня и плотности электролита аккумуляторной батареи
Проверка надежности крепления клемм проводов аккумуляторной батареи, зачистка клемм проводов и выводов батареи, нанесение на них смазки
Регулировка фар
Кузов
Проверка лакокрасочного покрытия кузова на наличие сколов, трещин и очагов коррозии, арок колес и днища на наличие повреждения мастики
Замена фильтрующего элемента системы отопления и вентиляции, прочистка дренажного отверстия водоотводящего короба
Проверка работоспособности замков дверей, капота, крышки багажника, крышки лючка заливной горловины топливного бака, механизмов сидений и ремней безопасности
Смазка цилиндровых механизмов замков дверей и крышки багажника, поверхностей трения ограничителей и петель дверей, шарниров и пружины крышки лючка заливной горловины топливного бака
Проверка состояния болтовых соединений системы кондиционирования воздуха
Проверка работоспособности системы кондиционирования воздуха

Лада Гранта — ТО на 45 тыс. км пробега — журнал За рулем

Двигатель и его системы
Проверка отсутствия посторонних стуков и шумов на работающем двигателе
Проверка токсичности отработавших газов
Проверка и регулировка тепловых зазоров в приводе ГРМ 8-клапанного двигателя
Замена масла и масляного фильтра
Проверка герметичности систем охлаждения, питания и выпуска отработавших газов. Оценка состояния шлангов, трубопроводов, соединений
Проверка состояния ремня привода генератора
Проверка состояния ремня привода вспомогательных агрегатов и замена при необходимости
Проверка состояния ремня привода ГРМ 16-клапанного двигателя и замена при необходимости
Проверка состояния ремня привода ГРМ 8-клапанного двигателя
Проверка работоспособности системы управления двигателем
Трансмиссия
Проверка хода педали сцепления и четкости переключения передач
Проверка отсутствия посторонних стуков и шумов при работе сцепления, коробки передач, приводов передних колес
Проверка уровня масла в коробке передач и герметичности агрегата
Проверка состояния защитных чехлов и шарниров приводов передних колес, тяги управления коробкой передач и реактивной тяги коробки передач
Ходовая часть
Проверка состояния элементов передней и задней подвесок
Рулевое управление
Проверка исправности механизма регулировки рулевой колонки по углу наклона
Проверка суммарного люфта рулевого управления
Проверка состояния шарниров наконечников рулевых тяг, их чехлов и чехла рулевого механизма
Проверка отсутствия посторонних стуков и шумов в рулевом механизме
Проверка исправности электроусилителя рулевого управления
Тормозная система
Проверка исправности сигнального устройства уровня жидкости в бачке, герметичности гидропривода, состояние шлангов и трубок тормозной системы
Проверка исправности устройства фиксации рычага стояночного тормоза
Проверка состояния колодок, чехлов и наличие смазки направляющих пальцев тормозных механизмов передних колес
Проверка состояния колодок и пыльников колесных цилиндров тормозных механизмов задних колес
Проверка состояния тросов и регулировка стояночной тормозной системы
Проверка исправности вакуумного усилителя тормозов, регулятора давления в тормозных механизмах задних колес, положения выключателя сигналов торможения
Замена тормозной жидкости
Электрооборудование
Проверка отсутствия следов замыканий и видимых повреждений изоляции проводов
Проверка работоспособности элементов электрооборудования: генератора, стартера, световой сигнализации, освещения, контрольных приборов, очистителя и омывателя ветрового стекла, отопителя, обогрева заднего стекла, регулятора направления пучков света фар, электроприводов стеклоподъемников, электроблокировки замков дверей
Проверка уровня и плотности электролита аккумуляторной батареи
Проверка надежности крепления клемм проводов аккумуляторной батареи, зачистка клемм проводов и выводов батареи, нанесения на них смазки
Регулировка фар
Кузов
Проверка лакокрасочного покрытия кузова на наличие сколов, трещин и очагов коррозии, арок колес и днища на наличие повреждения мастики
Замена фильтрующего элемента системы отопления и вентиляции, прочистка дренажного отверстия водоотводящего короба
Проверка работоспособности замков дверей, капота, крышки багажника, крышки лючка заливной горловины топливного бака, механизмов сидений и ремней безопасности
Проверка состояния болтовых соединений системы кондиционирования воздуха
Проверка работоспособности системы кондиционирования воздуха

Регламент технического обслуживания Lada Granta и Kalina 2 » Лада.Онлайн

1.Контрольно-осмотровые работы

ТО

0

1

2

3

4

5

6

7

 

8

 

1.1.

Осмотр а/м на подъемнике

 

 

 

 

 

 

 

 

 

1.1.1

Состояние кузова (осмотр визуальный)

-

+

+

+

+

+

+

+

+

1.1.2

Состояние элементов передней и задней подвесок, их резинометаллических шарниров, втулок и чехлов.

-

+

+

+

+

+

+

+

+

1.1.3

Состояние шаровых пальцев передней подвески и их защитных резиновых чехлов.

-

+

+

+

+

+

+

+

+

1.1.4

Состояние телескопических стоек амортизаторов.

-

+

+

+

+

+

+

+

+

1.1.5

Состояние верхней опоры телескопической стойки передней подвески.

-

+

+

+

+

+

+

+

+

1.1.6

Герметичность уплотнений узлов и агрегатов  (осмотр снизу автомобиля)

-

+

+

+

+

+

+

+

+

1.1.7

Герметичность систем охлаждения, питания, состояние шлангов и трубок.

-

+

+

+

+

+

+

+

+

1.1.8

Герметичность системы гидравлического привода тормозов, состояние шлангов и трубок

-

+

+

+

+

+

+

+

+

1.2

 Осмотреть и проверить без вывешивания а/м

 

 

 

 

 

 

 

 

 

1.2.1

Состояние кузова (осмотр визуальный)

-

+

+

+

+

+

+

+

+

1.2.2

Работу замков передних дверей, задних дверей, капота, крышки багажника, двери задка, при необходимости отрегулировать.

-

+

+

+

+

+

+

+

+

1.2.3

Работу крышки люка топливного бака и надежность фиксации пробки горловины топливного бака.

-

+

+

+

+

+

+

+

+

1.2.4

Работу блокировки замков боковых дверей, крышки багажника (двери задка), при необходимости отрегулировать

-

+

+

+

+

+

+

+

+

1.2.5

Работу поворотного фиксатора замка задней двери («детский замок»).

-

+

+

+

+

+

+

+

+

1.2.6

Герметичность уплотнений узлов и агрегатов         (в моторном отсеке)

-

+

+

+

+

+

+

+

+

1.2.7

Герметичность систем охлаждения , питания, состояние шлангов и трубок (в моторном отсеке).

-

+

+

+

+

+

+

+

+

1.2.8

Герметичность системы гидравлического привода тормозов, состояние шлангов и трубок в моторном отсеке).

-

+

+

+

+

+

+

+

+

1.2.9

Уровень тормозной жидкости, при необходимости доведение до нормы.

-

+

+

+

+

+

+

+

+

1.2.10

Работоспособность датчика аварийного уровня тормозной жидкости в бачке.

-

+

+

+

+

+

+

+

+

1.2.11

Уровень охлаждающей жидкости.

-

+

+

+

+

+

-

+

+

1.2.12

Отсутствие следов замыканий и видимых повреждений изоляции проводов.

Работоспособность узлов электрооборудования: генератора, освещения, световой и звуковой сигнализации, контрольных приборов, отопителя, очистителя стекол, омывателя, обогрева заднего стекла и передних сидений, электропривода стеклоподъемников и наружных зеркал.

-

+

+

+

+

+

+

+

+

1.2.13

Работоспособность корректора фар

-

+

+

+

+

+

+

+

+

1.2.14

Отсутствие посторонних стуков и шумов двигателя, сцепления, коробки передач, привода передних колес и рулевого механизма. Чистоту и полноту включения сцепления.

-

+

+

+

+

+

+

+

+

1.2.15

Наличие и правильность расположения предупредительных этикеток в салоне автомобиля.

-

+

+

+

+

+

+

+

+

2

Регламентные работы

 

 

 

 

 

 

 

 

 

2.1

Установить автомобиль на пост технического обслуживания и произвести следующие работы:

 

 

 

 

 

 

 

 

 

2.1.1

Проверить состояние и натяжение ремня привода генератора (или ремня привода вспомогательных агрегатов), при необходимости отрегулировать натяжение (при наличии механизма регулирования)

-

+

+

+

+

+

-

+

+

2.1.2

Заменить ремень генератора (или ремень привода навесных агрегатов ) и отрегулировать натяжение ремня (при наличии механизма регулирования)

-

-

-

-

-

-

+

-

-

2.1.3

На автомобилях с двигателем 11186: отрегулировать зазоры в газораспределительном механизме.

+

+

-

+

-

+

-

+

-

2.1.4

На автомобилях с двигателем 11182: отрегулировать зазоры в газораспределительном механизме.

 

 

 

 

 

 

+

 

 

2.1.5

Проверить органолептически надежность крепления аккумуляторной батареи (АКБ) и клемм.

-

+

+

+

+

+

+

+

+

Нормальное напряжение на клеммах АКБ не ниже 12,6 В.

Нормальная плотность электролита АКБ 1,24-1,27 г/см3.

2.1.6

Снять зажимы аккумуляторной батареи и при наличии белого налета на клеммах и зажимах удалить его шлифовальной шкуркой и нанести тонкий слой смазки.

-

-

+

-

+

-

+

-

+

2.1.7

Заменить фильтрующий элемент системы вентиляции и отопления салона.

-

+

+

+

+

+

+

+

+

2.1.8

Прочистить дренажное отверстие в щитке передка.

 

-

+

+

+

+

+

+

+

+

2.1.9

Заменить фильтрующий элемент воздушного фильтра двигателя.

-

+

+

+

+

+

+

+

+

2.1.10

Заменить свечи зажигания.

-

-

+

-

+

-

+

-

+

2.1.11

Заменить высоковольтные провода системы зажигания (для 8- клапанного двигателя).

-

-

-

-

-

-

+

-

-

2.1.12

Смазать:

-трущиеся участки ограничителей и осей дверей , шарниров и пружины крышки люка топливного бака

-замочные скважины боковых дверей, двери задка, крышки багажника

-

+

+

+

+

+

+

+

+

2.2

Установить автомобиль на двухстоечный подъемник и произвести следующие работы

 

 

 

 

 

 

 

 

 

2.2.1

Прочистить дренажные отверстия порогов и дверей.

-

+

+

+

+

+

+

+

+

2.2.2

Проверить состояние колодок и тормозных дисков передних тормозов.

-

+

+

+

+

+

+

+

+

min допустимая толщина тормозной накладки 1,5 мм.

2.2.3

Проверить состояние колодок задних тормозов, тросов привода стояночного тормоза, защитных колпачков, герметичность рабочих тормозных цилиндров.

-

-

+

-

+

-

+

-

+

 

 

 

 

 

 

 

 

 

2.2.4

Заменить тормозную жидкость и проверить герметичность системы тормозов в соответствии с требованиями ТИ 3100.21100.08020.

-

-

-

+

-

-

+

-

-

или через 5 лет, в зависимости от того что наступит ранее

2.2.5

Заменить фильтр тонкой очистки топлива.

-

-

+

-

+

-

+

-

+

2.2.6

Заменить охлаждающую жидкость и проверить герметичность системы охлаждения.

-

-

-

-

-

+

-

-

-

или через 5 лет, в зависимости от того что наступит ранее

2.2.7

Заменить масляный фильтр и масло в картере двигателя с проверкой уровня и герметичности системы смазки.

-

+

+

+

+

+

+

+

+

2.2.8

Проверить состояние дисков и шин колес.

-

+

+

+

+

+

+

+

+

min допустимая остаточная высота протектора 1,6 мм.

2.2.9

Проверить давление воздуха в шинах, при необходимости довести до нормы.

-

+

+

+

+

+

+

+

+

2.2.10

Проверить эффективность торможения рабочей и стояночной тормозных.

-

+

+

+

+

+

+

+

+

2.2.11

Проверить суммарный люфт рулевого управления

-

+

+

+

+

+

+

+

+

2.2.12

Установить а/м на ровной площадке, проверить соответствие установленным нормативам границ световых пучков фар и при необходимости отрегулировать направление световых пучков.

-

+

-

+

-

+

-

+

-

2.2.13

Проверить исправность работы  электромеханического усилителя рулевого  управления (ЭМУР).

-

+

+

+

+

+

+

+

+

2.2.14

Проверить работоспособность электронной системы управления двигателем (ЭСУД) и отсутствие в памяти контроллера кодов неисправностей ЭСУД.

-

+

+

+

+

+

+

+

+

2.2.15

Проверить работоспособность электронных систем а/м по индикаторам комбинации приборов и других указателей на панели приборов и отсутствие в памяти контроллера  кодов неисправностей.

-

+

+

+

+

+

+

+

+

2.2.16

Заменить зубчатый ремень ГРМ, натяжитель и опорный ролик (при наличии)

 

 

 

 

 

 

+

 

 

2.2.17

Заменить зубчатые шкивы коленчатого вала и распределительного вала

Через 180 тыс. км пробега

2.2.18

Заменить масло в коробке передач

Через 180 тыс. км или через 5 лет

3

Контрольно- осмотровые работы по выявлению дефектов ЛКП и антикоррозионного покрытия кузова

 

год эксплуатации

-

1

2

3

4

5

6

7

8

3.1

 Проверить наличие сколов, трещин и точек коррозии, а т.ж иных повреждений  ЛКП кузова, повреждений мастики днища.

-

+

+

+

+

+

+

+

+

3.2

Проверить наличие сколов, трещин и точек коррозии, а также иных повреждений ЛКП кузова, повреждений мастики арок колес и днища.

-

+

+

+

+

+

+

+

+

4

Предъявить автомобиль ОТК.

+

+

+

+

+

+

+

+

+

Регламент технического обслуживания Lada Granta

Примечания:

В данном списке приведены операции по техническому обслуживанию, указанные в талонах сервисной книжки автомобиля. Возле пробега знаком "+" указывается выполнение соответствующей операции. В противном случае ставится "-".

Двигатель и его системы

1. Проверка отсутствия посторонних стуков и шумов при работающем двигателе – пробег 2,5 тыс.км: +; 15 тыс.км: +; 30 тыс.км: +; 45 тыс.км: +; 60 тыс.км: +; 75 тыс.км: +; 90 тыс.км: +; 105 тыс.км: +.

2. Подтяжка креплений деталей, узлов и агрегатов двигателя – пробег 2,5 тыс.км: +; 15 тыс.км: -; 30 тыс.км: +; 45 тыс.км: -; 60 тыс.км: +; 75 тыс.км: -; 90 тыс.км: +; 105 тыс.км: -.

3. Проверка и регулировка тепловых зазоров в приводе газораспределительного механизма (ГРМ) – пробег 2,5 тыс.км: +; 15 тыс.км: +; 30 тыс.км: -; 45 тыс.км: +; 60 тыс.км: -; 75 тыс.км: +; 90 тыс.км: -; 105 тыс.км: +. 

4. Проверка токсичности отработавших газов – пробег 2,5 тыс.км: +; 15 тыс.км: +; 30 тыс.км: +; 45 тыс.км: +; 60 тыс.км: +; 75 тыс.км: +; 90 тыс.км: +; 105 тыс.км: +.

5. Замена масла и масляного фильтра – пробег 2,5 тыс.км: +; 15 тыс.км: +; 30 тыс.км: +; 45 тыс.км: +; 60 тыс.км: +; 75 тыс.км: +; 90 тыс.км: +; 105 тыс.км: +.

6. Проверка герметичности систем охлаждения, питания и выпуска отработавших газов. Оценка состояния шлангов, трубопроводов, соединений – пробег 2,5 тыс.км: -; 15 тыс.км: +; 30 тыс.км: +; 45 тыс.км: +; 60 тыс.км: +; 75 тыс.км: +; 90 тыс.км: +; 105 тыс.км: +.

7. Проверка состояния и регулировка натяжения ремня привода ГРМ – пробег 2,5 тыс.км: -; 15 тыс.км: +; 30 тыс.км: +; 45 тыс.км: +; 60 тыс.км: +; 75 тыс.км: -; 90 тыс.км: +; 105 тыс.км: +.

8. Замена ремня привода ГРМ – пробег 2,5 тыс.км: -; 15 тыс.км: -; 30 тыс.км: -; 45 тыс.км: -; 60 тыс.км: -; 75 тыс.км: +; 90 тыс.км: -; 105 тыс.км: -.

9. Замена сменного элемента воздушного фильтра – пробег 2,5 тыс.км: -; 15 тыс.км: -; 30 тыс.км: +; 45 тыс.км: -; 60 тыс.км: +; 75 тыс.км: -; 90 тыс.км: +; 105 тыс.км: -.

10. Замена свечей зажигания – пробег 2,5 тыс.км: -; 15 тыс.км: -; 30 тыс.км: +; 45 тыс.км: -; 60 тыс.км: +; 75 тыс.км: -; 90 тыс.км: +; 105 тыс.км: -.

11. Замена топливного фильтра – пробег 2,5 тыс.км: -; 15 тыс.км: -; 30 тыс.км: +; 45 тыс.км: -; 60 тыс.км: +; 75 тыс.км: -; 90 тыс.км: +; 105 тыс.км: -.

12*. Замена охлаждающей жидкости – пробег 2,5 тыс.км: -; 15 тыс.км: -; 30 тыс.км: -; 45 тыс.км: -; 60 тыс.км: -; 75 тыс.км: +; 90 тыс.км: -; 105 тыс.км: -.

13. Замена датчиков концентрации кислорода – пробег 2,5 тыс.км: -; 15 тыс.км: -; 30 тыс.км: -; 45 тыс.км: -; 60 тыс.км: -; 75 тыс.км: +; 90 тыс.км: -; 105 тыс.км: -. 

14. Проверка работоспособности системы управления двигателем – пробег 2,5 тыс.км: +; 15 тыс.км: +; 30 тыс.км: +; 45 тыс.км: +; 60 тыс.км: +; 75 тыс.км: +; 90 тыс.км: +; 105 тыс.км: +.

Трансмиссия

1. Проверка хода педали сцепления и четкости переключения передач – пробег 2,5 тыс.км: +; 15 тыс.км: +; 30 тыс.км: +; 45 тыс.км: +; 60 тыс.км: +; 75 тыс.км: +; 90 тыс.км: +; 105 тыс.км: +.

2. Проверка отсутствия посторонних стуков и шумов при работе сцепления, коробки передач, приводов передних колес – пробег 2,5 тыс.км: +; 15 тыс.км: +; 30 тыс.км: +; 45 тыс.км: +; 60 тыс.км: +; 75 тыс.км: +; 90 тыс.км: +; 105 тыс.км: +.

3. Подтяжка креплений узлов и агрегатов трансмиссии – пробег 2,5 тыс.км: +; 15 тыс.км: -; 30 тыс.км: +; 45 тыс.км: -; 60 тыс.км: +; 75 тыс.км: -; 90 тыс.км: +; 105 тыс.км: -.

4. Проверка уровня масла в коробке передач и и герметичности агрегата – пробег 2,5 тыс.км: -; 15 тыс.км: +; 30 тыс.км: +; 45 тыс.км: +; 60 тыс.км: +; 75 тыс.км: -; 90 тыс.км: +; 105 тыс.км: +.

5. Замена масла в коробке передач – пробег 2,5 тыс.км: -; 15 тыс.км: -; 30 тыс.км: -; 45 тыс.км: -; 60 тыс.км: -; 75 тыс.км: +; 90 тыс.км: -; 105 тыс.км: -.

6. Проверка состояния защитных чехлов и шарниров приводов передних колес, тяги управления коробкой передач и реактивной тяги коробки передач – пробег 2,5 тыс.км: -; 15 тыс.км: +; 30 тыс.км: +; 45 тыс.км: +; 60 тыс.км: +; 75 тыс.км: +; 90 тыс.км: +; 105 тыс.км: +.

Ходовая часть

1. Подтяжка креплений элементов передней и задней подвесок – пробег 2,5 тыс.км: +; 15 тыс.км: -; 30 тыс.км: +; 45 тыс.км: -; 60 тыс.км: +; 75 тыс.км: -; 90 тыс.км: +; 105 тыс.км: -.

2. Проверка углов установки передних колес – пробег 2,5 тыс.км: +; 15 тыс.км: -; 30 тыс.км: +; 45 тыс.км: -; 60 тыс.км: +; 75 тыс.км: -; 90 тыс.км: +; 105 тыс.км: -.

3. Проверка состояния элементов передней и задней подвесок – пробег 2,5 тыс.км: -; 15 тыс.км: +; 30 тыс.км: +; 45 тыс.км: +; 60 тыс.км: +; 75 тыс.км: +; 90 тыс.км: +; 105 тыс.км: +.

4. Проверка состояния дисков и шин, перестановка колес по схеме – пробег 2,5 тыс.км: -; 15 тыс.км: -; 30 тыс.км: +; 45 тыс.км: -; 60 тыс.км: +; 75 тыс.км: -; 90 тыс.км: +; 105 тыс.км: -.

Рулевое управление

1. Проверка исправности механизма регулировки рулевой колонки по углу наклона – пробег 2,5 тыс.км: +; 15 тыс.км: +; 30 тыс.км: +; 45 тыс.км: +; 60 тыс.км: +; 75 тыс.км: +; 90 тыс.км: +; 105 тыс.км: +.

2. Проверка суммарного люфта рулевого управления – пробег 2,5 тыс.км: -; 15 тыс.км: +; 30 тыс.км: +; 45 тыс.км: +; 60 тыс.км: +; 75 тыс.км: +; 90 тыс.км: +; 105 тыс.км: +.

3. Проверка состояния шарниров наконечников рулевых тяг, их чехлов и чехла рулевого механизма – пробег 2,5 тыс.км: -; 15 тыс.км: +; 30 тыс.км: +; 45 тыс.км: +; 60 тыс.км: +; 75 тыс.км: +; 90 тыс.км: +; 105 тыс.км: +.

4. Проверка отсутствия посторонних стуков и шумов в рулевом механизме – пробег 2,5 тыс.км: +; 15 тыс.км: +; 30 тыс.км: +; 45 тыс.км: +; 60 тыс.км: +; 75 тыс.км: +; 90 тыс.км: +; 105 тыс.км: +.

5. Проверка исправности электроусилителя рулевого управления – пробег 2,5 тыс.км: +; 15 тыс.км: +; 30 тыс.км: +; 45 тыс.км: +; 60 тыс.км: +; 75 тыс.км: +; 90 тыс.км: +; 105 тыс.км: +.

6. Регулировка зазора в зацеплении "шестерня-рейка" – пробег 2,5 тыс.км: -; 15 тыс.км: +; 30 тыс.км: -; 45 тыс.км: -; 60 тыс.км: -; 75 тыс.км: -; 90 тыс.км: -; 105 тыс.км: -.

Тормозная система

1. Проверка исправности сигнального устройства уровня жидкости в бачке, герметичности гидропривода, состояния шлангов и трубок тормозной системы – пробег 2,5 тыс.км: +; 15 тыс.км: +; 30 тыс.км: +; 45 тыс.км: +; 60 тыс.км: +; 75 тыс.км: +; 90 тыс.км: +; 105 тыс.км: +.

2. Проверка исправности устройства фиксации рычага стояночного тормоза – пробег 2,5 тыс.км: +; 15 тыс.км: +; 30 тыс.км: +; 45 тыс.км: +; 60 тыс.км: +; 75 тыс.км: +; 90 тыс.км: +; 105 тыс.км: +.

3. Проверка состояния колодок, чехлов и наличие смазки направляющих пальцев тормозных механизмов передних колес – пробег 2,5 тыс.км: -; 15 тыс.км: +; 30 тыс.км: +; 45 тыс.км: +; 60 тыс.км: +; 75 тыс.км: +; 90 тыс.км: +; 105 тыс.км: +.

4. Проверка состояния колодок и пыльников колесных цилиндров тормозных механизмов задних колес – пробег 2,5 тыс.км: -; 15 тыс.км: +; 30 тыс.км: +; 45 тыс.км: +; 60 тыс.км: +; 75 тыс.км: +; 90 тыс.км: +; 105 тыс.км: +.

5. Проверка состояния тросов и регулировка стояночной тормозной системы – пробег 2,5 тыс.км: -; 15 тыс.км: +; 30 тыс.км: +; 45 тыс.км: +; 60 тыс.км: +; 75 тыс.км: +; 90 тыс.км: +; 105 тыс.км: +.

6. Проверка исправности вакуумного усилителя тормозов, регулятора давления в тормозных механизмах задних колес, положения выключателя сигналов торможения – пробег 2,5 тыс.км: +; 15 тыс.км: +; 30 тыс.км: +; 45 тыс.км: +; 60 тыс.км: +; 75 тыс.км: +; 90 тыс.км: +; 105 тыс.км: +.

7**. Замена тормозной жидкости – пробег 2,5 тыс.км: -; 15 тыс.км: -; 30 тыс.км: -; 45 тыс.км: +; 60 тыс.км: -; 75 тыс.км: -; 90 тыс.км: +; 105 тыс.км: -.

Электрооборудование

1. Проверка отсутствия следов замыканий и видимых повреждений изоляции проводов – пробег 2,5 тыс.км: -; 15 тыс.км: +; 30 тыс.км: +; 45 тыс.км: +; 60 тыс.км: +; 75 тыс.км: +; 90 тыс.км: +; 105 тыс.км: +.

2. Проверка работоспособности элементов электрооборудования: генератора, стартера, освещения, световой и звуковой сигнализации, контрольных приборов, очистителя и омывателя ветрового стекла, отопителя, обогрева заднего стекла, регулятора направления пучков света фар, электроприводов стеклоподъемников, электроблокировки замков дверей – пробег 2,5 тыс.км: -; 15 тыс.км: +; 30 тыс.км: +; 45 тыс.км: +; 60 тыс.км: +; 75 тыс.км: +; 90 тыс.км: +; 105 тыс.км: +.

3. Проверка состояния ремня привода генератора – пробег 2,5 тыс.км: +; 15 тыс.км: +; 30 тыс.км: -; 45 тыс.км: +; 60 тыс.км: -; 75 тыс.км: +; 90 тыс.км: -; 105 тыс.км: +.

4. Замена ремня привода генератора – пробег 2,5 тыс.км: -; 15 тыс.км: -; 30 тыс.км: +; 45 тыс.км: -; 60 тыс.км: +; 75 тыс.км: -; 90 тыс.км: +; 105 тыс.км: -.

5. Проверка уровня и плотности электролита аккумуляторной батареи – пробег 2,5 тыс.км: -; 15 тыс.км: +; 30 тыс.км: +; 45 тыс.км: +; 60 тыс.км: +; 75 тыс.км: +; 90 тыс.км: +; 105 тыс.км: +.

6. Проверка надежности крепления клемм проводов аккумуляторной батареи, зачистка клемм проводов и выводов батареи, нанесение на них смазки – пробег 2,5 тыс.км: -; 15 тыс.км: -; 30 тыс.км: +; 45 тыс.км: -; 60 тыс.км: +; 75 тыс.км: -; 90 тыс.км: +; 105 тыс.км: -.

7. Регулировка фар – пробег 2,5 тыс.км: +; 15 тыс.км: +; 30 тыс.км: +; 45 тыс.км: +; 60 тыс.км: +; 75 тыс.км: +; 90 тыс.км: +; 105 тыс.км: +.

Кузов

1. Проверка лакокрасочного покрытия кузова на наличие сколов, трещин и очагов коррозии, арок колес и днища на наличие повреждения мастики – пробег 2,5 тыс.км: +; 15 тыс.км: +; 30 тыс.км: +; 45 тыс.км: +; 60 тыс.км: +; 75 тыс.км: +; 90 тыс.км: +; 105 тыс.км: +.

2. Прочистка дренажного отверстия водоотводящего короба – пробег 2,5 тыс.км: -; 15 тыс.км: +; 30 тыс.км: +; 45 тыс.км: +; 60 тыс.км: +; 75 тыс.км: +; 90 тыс.км: +; 105 тыс.км: +.

3. Замена фильтрующего элемента системы отопления и вентиляции – пробег 2,5 тыс.км: -; 15 тыс.км: +; 30 тыс.км: +; 45 тыс.км: +; 60 тыс.км: +; 75 тыс.км: +; 90 тыс.км: +; 105 тыс.км: +.

4. Проверка работоспособности замков дверей, капота, крышки багажника, крышки лючка заливной горловины топливного бака, механизмов сидений и ремней безопасности – пробег 2,5 тыс.км: -; 15 тыс.км: +; 30 тыс.км: +; 45 тыс.км: +; 60 тыс.км: +; 75 тыс.км: +; 90 тыс.км: +; 105 тыс.км: +.

5. Смазка цилиндровых механизмов замков дверей и крышки багажника, поверхностей трения ограничителей и петель дверей, шарниров и пружины крышки лючка заливной горловины топливного бака – пробег 2,5 тыс.км: -; 15 тыс.км: -; 30 тыс.км: +; 45 тыс.км: -; 60 тыс.км: +; 75 тыс.км: -; 90 тыс.км: +; 105 тыс.км: -.

6. Проверка состояния болтовых соединений системы кондиционирования воздуха – пробег 2,5 тыс.км: +; 15 тыс.км: +; 30 тыс.км: +; 45 тыс.км: +; 60 тыс.км: +; 75 тыс.км: +; 90 тыс.км: +; 105 тыс.км: +.

7. Проверка работоспособности системы кондиционирования воздуха – пробег 2,5 тыс.км: -; 15 тыс.км: +; 30 тыс.км: +; 45 тыс.км: +; 60 тыс.км: -; 75 тыс.км: +; 90 тыс.км: +; 105 тыс.км: +.

8. Замена ресивера системы кондиционирования воздуха – пробег 2,5 тыс.км: -; 15 тыс.км: -; 30 тыс.км: -; 45 тыс.км: -; 60 тыс.км: +; 75 тыс.км: -; 90 тыс.км: -; 105 тыс.км: -.

Примечание:

* – или через пять лет, в зависимости от того, что наступит раньше.

** – или через три года, в зависимости от того, что наступит раньше.

Если автомобиль эксплуатируется в условиях большой запыленности, низкой температуры окружающей среды, используется для транспортировки прицепа, частых поездок с небольшой скоростью или на короткие расстояния, то замену моторного масла и масляного фильтра следует проводить через 7,5 тыс.км пробега.

При эксплуатации автомобиля в условиях большой запыленности замену сменного элемента воздушного фильтра следует проводить чаще.

При пробеге автомобиля больше 105 тыс.км операцтт регламента технического обслуживания следует проводить с периодичностью, указанной выше.

Источник: http://wiki.zr.ru/20-2_Granta

Шины, диски на Лада Гранта (Lada Granta)

Подбор автошин на Ладу Гранту, как и на остальные автомобили, не может принят однозначно. При склонении к тем или иным покрышкам, необходимо учитывать как год выпуска автомобиля, погодные условия местности, в которой автомобиль эксплуатируется, стиль вождения его владельца.

Но обращая внимание на все вышеперечисленные пункты, автолюбитель способен выбрать шины и диски, которые наиболее оптимально передадут все положительные свойства его машины. Это обеспечит безопасную и комфортную езду на транспортном средстве при любых погодных условиях.

Какие размеры шин и дисков рекомендуются компанией KOLOBOX для Lada Granta?

На сегодняшний день Лада Гранта представлена в единственной модификации, рекомендации к которой занесены в таблице ниже:

Завод - производитель обращает внимание на два подходящих значения диаметра покрышек Lada Granta: это 13 и 14 дюймов. Четырнадцатый диаметр считается более стандартным по отношению к малолитражным автомобилям, поддерживая бюджетность эксплуатации автомобиля. Еще одна положительная сторона этого размера: доступность, простота поиска на автомобильных сайтах и в магазинах.

Какая резина подходит для автомобиля Lada Granta в зимнее время года?

Выбор зимней резины на этот автомобиль следует делать, исходя из условий местности, в которой он эксплуатируется. Российские дороги, в основном, представляют собой области, в которых плотные снегопады и гололеды сменяются грязевыми лужами, где снег смешивается с песком и прочими реагентами. Поэтому многие автовладельцы предпочитают приобретать шипованную резину. Но выбор, естественно, остается за каждым автолюбителем в отдельности.

Зимние шины на Лада Гранта Pirelli Ice Zero Friction
Maxxis NP3 Arctic Trekker
Kama Kama-505 Ирбис
Tunga Nordway 2
Nitto Therma Spike
Cordiant Snow Cross (PW-2)
Pirelli Ice Zero
Maxxis SP3 Premitra Ice

Зимний комплект шин должен отличаться мягкостью в пятне контакта с дорожным покрытием, чтобы иметь должное сцепление даже в условиях укатанного снега. При этом от основания протектора требуется определенной степени жесткость для точного управления автомобилем.

Какие шины подходят для автомобиля Lada Granta в летнее время года?

Основное требование, которое стоит перед летним комплектом покрышек Лада Гранта - качественное сцепление и высокий уровень маневренности на сухом и мокром асфальте. Маркировка, рекомендуемая для летних покрышек, принимает вид 185/60R14 или 175/65R14. Исходя из этих формул, диаметр покрышек равен 14 дюймам, ширина 175-185 мм, а отношение ширины к высоте шин варьируется от 60 до 65%. Эти данные имеют рекомендательный характер, что позволяет небольшие корректировки и отклонения.

Какие диски рекомендуются для автомобиля Lada Granta?

Автомобили АвтоВАЗа, которые оснащаются передним приводом, имеют диски с диаметром 15 дюймов. Этот размер дисков позволяет иметь большое пространство для выбора шин: ширина резины варьируется от 175 до 195 дюймов, а профиль от 55 до 70%.

Какое давление рекомендуется для шин автомобиля Лада Гранта?

Базовая заводская комплектация автомобиля Лада Гранта предусматривает следующие значения давления, при условии неполной нагрузки:

  • Для R13 давление равно 1,9 Атмосфер для передних и задних колес.
  • Для R14 давление равно 2,0 Атмосфер для передних и задних колес.

Каково влияние размера шин и дисков на характеристики автомобиля?

Рассмотрим влияние в таблице ниже:

Как работает Black Fret - Black Fret

Black Fret основан на простой предпосылке, что вместе мы можем изменить мир к лучшему. Меломаны и те, кто любит свое сообщество, присоединяются к Black Fret, чтобы стать «Покровителями местной музыки. Их ежегодные членские взносы используются для финансирования наших грантов и мероприятий каждый сезон. Взносы составляют всего 750 долларов на человека за год членства с любой даты, когда вы присоединитесь. Взносы могут оплачиваться ежегодно или ежемесячно (с применением 20% премии) в рамках годового обязательства.

Эти членские взносы в сочетании с нашими ценными спонсорами, гражданскими грантами и другими источниками финансирования позволили Black Fret выплатить более 2,1 миллиона долларов в виде прямых выплат и грантов артистам и еще 1,5 миллиона долларов в виде платежей местным музыкальным компаниям с 2013 года. В Остине ежегодно отбиралось двадцать групп в течение 8 сезонов, с 2013 по 2021 год, всего 160 групп. Сиэтл был запущен в разгар глобальной пандемии COVID-19 в 2020 году, но все же получил гранты в размере 50 000 долларов США для десяти групп в Сиэтле.На сегодняшний день Black Fret положительно повлиял на жизнь сотен отдельных музыкантов.

Каждый артист, номинированный главой Black Fret, получит грант. После получения награды группы могут использовать эти средства для подпитки своей музыкальной карьеры тем способом, который они считают наиболее необходимым и эффективным. Мы обеспечиваем наставничество со стороны местных и национальных профессионалов музыкальной индустрии, чтобы помочь нашим артистам убедиться, что получаемые ими гранты оказывают максимально возможное влияние.

Гранты Black Fret присуждаются на основании художественного мастерства.Каждый сезон музыканты и группы номинируются на рассмотрение членов Black Fret, консультативного совета музыкальной индустрии, прошлых получателей грантов и избранных медиа-партнеров.

Рассмотрение гранта от Black Fret возможно только после получения номинации от избирательных округов Black Fret, как указано выше. Не существует процесса подачи незапрошенных заявок, с помощью которого группа могла бы получить грант Black Fret. Скорее, именно сообщество Black Fret признает этих артистов и выбирает их в каждой главе каждого сезона.

В каждом отделении Black Fret проводится целый сезон мероприятий для наших участников, создавая захватывающий опыт, который делает всех наших участников частью музыкальной сцены их отделения. Узнайте больше о том, каково быть участником Black Fret.

Практическое руководство по одиночным молекулам FRET

Натурные методы. Авторская рукопись; доступно в PMC 2013 10 сентября.

Опубликован в окончательной редакции как:

PMCID: PMC3769523

NIHMSID: NIHMS495771

, 1, 2 , 3 и 1, 2 , 4

Рахул Рой

1 Физический факультет Иллинойского университета в Урбана-Шампейн, 1110 Вест-Грин-стрит, Урбана, Иллинойс 61801, США

2 Центр биофизики и вычислительной биологии Университета Illinois at Urbana-Champaign, 1110 West Green Street, Urbana, Illinois 61801, USA

Sungchul Hohng

3 Департамент физики и астрономии, Сеульский национальный университет, San 56-1 Sillim 9-dong, Gwanak-gu, Seoul 151-747, Корея

Taekjip Ha

1 Физический факультет Иллинойского университета в Урбана-Шампейн, 1110 West Green Street, Урбана, Иллинойс 61801, США

2 Центр исследований Биофизика и вычислительная биология, Университет Иллинойса в Урбана-Шампейн, 1110 West Green Street, Урбана, Иллинойс 61801, США

4 Медицинский институт Говарда Хьюза, 1110 West Green Street, Урбана, Иллинойс 61801, США

1 Департамент физики Иллинойского университета в Урбана-Шампейн, 1110 West Green Street, Урбана, Иллинойс 61801, США

2 Центр биофизики и вычислительной биологии, Университет Иллинойса в Урбана-Шампейн, 1110 Вест-Грин-стрит, Урбана, Иллинойс 61801, США

3 Департамент физики и астрономии, Сеульский национальный университет, Сан 56-1 Силлим 9-донг, Кванак-гу, Сеул 151-747, Корея

4 Медицинский институт Говарда Хьюза, 1110 Запад Грин-стрит, Урбана, Иллинойс 61801, США

Автор, ответственный за переписку.Окончательная отредактированная версия этой статьи издателем доступна на сайте Nat Methods. См. Другие статьи в PMC, в которых цитируется опубликованная статья.
Дополнительные материалы
Дополнительные материалы: Дополнительная таблица 1 : Список материалов и реагентов

Дополнительная таблица 2 : Список оптики и инструментов

Дополнительный протокол : Протокол пассивации поверхности полиэтиленгликолем (ПЭГ)

Дополнительные методы : Настройка возбуждения и излучения МДП

GUID: 2C6897D7-8368-4C8B-A944-5AA7DB5A00BA

Реферат

Несмотря на взрывной рост биологических применений методов одиночных молекул за последнее десятилетие, эти методы до сих пор практиковались в основном исследователями, ориентированными на биофизику.Частично это происходит из-за отсутствия коммерческих инструментов во многих случаях, а также из-за воспринимаемой крутой кривой обучения и необходимости в дорогостоящем оборудовании. Мы хотим предоставить практическое руководство по использованию Фёрстеровского (или флуоресцентного) резонансного переноса энергии (FRET) на уровне отдельных молекул, уделяя особое внимание изучению иммобилизованных молекул, которые позволяют измерять траектории реакции отдельных молекул от 1 миллисекунды до многих минут. Инструмент может быть построен по разумной цене с использованием различных готовых компонентов и надежно эксплуатироваться с использованием текущих хорошо зарекомендовавших себя протоколов и свободно доступного программного обеспечения.

Будущее открывает перспективы персонализированного секвенирования ДНК и высокопроизводительного скрининга на патогены по доступной цене и в разумное время. Эти обещания подкрепляются всплеском технологий на основе одиночных молекул, которые позволяют нам манипулировать и исследовать отдельные молекулы. Используя этот подход, перед микроскопом предстает несколько важных биологических загадок, которые долгое время интересовали ученых. Как сказал Фейнман, «очень легко ответить на многие из этих фундаментальных биологических вопросов; вы просто посмотрите на вещь ! » 1 .Одномолекулярные методы позволяют нам делать именно это 2, 3 . Однажды они могут стать элементарным инструментом для характеристики белков, сигнальных путей или любого биологического явления. В надежде облегчить эту задачу, мы предоставляем краткое, но практическое руководство по измерениям одиночных молекул FRET 4 (smFRET) 5-7 , одному из наиболее общих и адаптируемых методов измерения одиночных молекул. С момента своего скромного начала в неводных условиях в 1996 г. 8 , smFRET быстро развился, чтобы ответить на фундаментальные вопросы о репликации, рекомбинации, транскрипции, трансляции, сворачивании и катализе РНК, неканонической динамике ДНК, сворачивании белков и конформационных изменениях, различных моторные белки, белки слияния мембран, ионные каналы, трансдукция сигналов, и это лишь некоторые из них, и этот список продолжает расти быстрыми темпами.Поскольку целью данного обзора не является обзор обширной литературы по таким исследованиям, мы отсылаем читателя к обзорам в данной области и ссылкам в них 6, 9-13 .

В измерениях FRET степень безызлучательного переноса энергии между двумя молекулами флуоресцентного красителя, называемыми донором и акцептором, сообщает о промежуточном расстоянии, которое может быть оценено из отношения акцептора к общей интенсивности излучения () 4, 14, 15 . Эта эффективность передачи энергии E задается как E = [1 + ( R / R 0 ) 6 ] -1 , где R - расстояние между красителями. и R 0 - радиус Ферстера, при котором E = 0.5 (). Конформационную динамику отдельных молекул можно наблюдать в режиме реального времени, отслеживая изменения FRET (). Преимущество метода FRET заключается в том, что он является логометрическим методом, позволяющим нам измерять внутреннее расстояние в молекулярном каркасе, а не в лабораторном, и, следовательно, делает его в значительной степени невосприимчивым к инструментальным шумам и дрейфу. Измерение FRET свободно диффундирующих одиночных молекул проще в реализации (коммерческие решения также доступны, например, MicroTime200 от PicoQuant) и эффективно для выявления распределения популяций расстояний между красителями 16-19 .Однако возможность контролировать отдельные молекулы в течение длительного периода времени добавляет совершенно новое измерение с динамической информацией в диапазоне от миллисекунд до минут. Хотя можно использовать конфокальную микроскопию 20, 21 , временные траектории smFRET чаще всего получают путем визуализации поверхностных иммобилизованных молекул с помощью микроскопии полного внутреннего отражения (TIR), которая обеспечивает высокопроизводительный сбор данных 5, 22 . Установки МДП были успешно адаптированы многочисленными группами и могут быть легко собраны в соответствии с пошаговой инструкцией 7 с использованием готовых компонентов, которые стоят примерно столько же, сколько ультрацентрифуга.Здесь мы рассматриваем этот метод FRET, а также предоставляем список поставщиков различных реагентов и оборудования, используемых в нашей лаборатории (дополнительные таблицы 1 и 2 в Интернете; перечисленные элементы и поставщики не являются единственными вариантами, и можно найти другие альтернативы). Все программы сбора и анализа данных находятся в свободном доступе в Интернете (http://bio.physics.uiuc.edu), а инструкции по подготовке пассивированной полимером поверхности и веб-ссылка на демонстрационные видеоролики включены в Дополнительный протокол в Интернете. Хотя мы в основном обсуждаем двухцветную схему FRET в этом обзоре, схемы FRET более высокого порядка могут также применяться для исследования многокомпонентных взаимодействий или пространственно-временных отношений между различными конформационными изменениями в больших молекулярных комплексах (Box 1).

Одномолекулярный FRET. ( a ) Эффективность FRET, E как функция расстояния между красителями ( R ) для R 0 = 50 Å. Донорный краситель, непосредственно возбуждаемый падающим лазером, либо флуоресцирует, либо передает энергию акцепторному красителю в зависимости от его близости. При R = R 0 , E = 0,5, в то время как на меньших расстояниях это> 0,5 и наоборот в соответствии с функцией, показанной синей линией. Обратите внимание на линейность значений E рядом с R 0 .( b ) Пример двухцветных данных smFRET. Данные получают в виде интенсивностей донора и акцептора (верхняя панель), из которых вычисляется кажущаяся эффективность FRET (нижняя панель). Мутантный рибозим шпильки 93 , который несет донор и акцептор на разных плечах одной и той же молекулы, претерпевает переходы между тремя состояниями FRET (E1, E2 и E3). Антикоррелированный характер донорного и акцепторного сигналов указывает на то, что эти изменения интенсивности происходят из-за передачи энергии.Молекулы красителя также показывают переходы в темное состояние, например. интенсивность акцептора временно падает до нуля (~ 9 с) или полностью фотообесцвечивается (~ 18,5 с).

Box 1

Схемы FRET

Однопарный FRET () - мощный метод, однако важно понимать, что глобальные конформационные изменения во время биомолекулярных взаимодействий, будь то сворачивание белка или взаимодействия белок-нуклеиновая кислота, редко бывают одномерными. В отсутствие кристаллических структур интерпретация изменений расстояния между красителями может быть согласована с несколькими различными, но не обязательно взаимоисключающими моделями.Следовательно, постоянно возрастает интерес к расширению досягаемости FRET до трех измерений. Здесь мы обсуждаем некоторые схемы FRET на начальной стадии или стадии разработки.

Трехцветная каскадная схема: Ограниченный диапазон расстояний FRET побудил исследователей использовать каскады кассет передачи энергии для увеличения эффективных значений R 0 . Например, в трехцветном каскаде промежуточный акцептор энергии передает энергию, полученную от донора, акцептору более низкой энергии ().Эта схема может быть полезной при исследовании изменений в больших комплексах, таких как рибосомы или нуклеосомы.

Трехцветная бифуркатная схема: один краситель может действовать как донор для двух независимых акцепторов, которые можно спектрально разделить (). В зависимости от близости от любого из акцепторов донор гаснет с увеличением эмиссии соответствующего акцептора. Обратный подход был бы с двумя независимыми донорами (спектрально разделенными, но возбуждаемыми одной и той же длиной волны света), которые могут выборочно гасить в зависимости от того, какой из них находится рядом с единственным акцептором.

Общая трехцветная схема: В общем случае из двух вышеупомянутых будет ситуация, когда передача энергии между тремя красителями не ограничена, и, следовательно, необходимо провести подробные расчеты для оценки трех расстояний между красителями (). Это позволяет явно определить однозначную эталонную плоскость в трехмерном конформационном пространстве биомолекулы.

Схема с двумя парами FRET: для больших комплексов использование двух независимых пар FRET может сообщать о конформационных изменениях в отдельных областях макромолекулы в реальном времени ().Реализация таких схем будет зависеть от разработки более голубых красителей, которые могут действовать как эффективные доноры одиночных молекул.

Схемы FRET одиночных молекул.

Схема эксперимента

Одномолекулярные флуоресцентные красители

Идеальный флуорофор для исследований одиночных молекул должен быть ярким (коэффициент экстинкции ε > 50000 M −1 см −1 ; квантовый выход QY > 0,1 ), фотостабильный с минимальными фотофизическими / химическими эффектами и эффектами агрегации, небольшой и водорастворимый с достаточным количеством биоконъюгационных химикатов.Кроме того, отличная пара smFRET должна иметь (1) большое спектральное разделение между излучением донора и акцептора и (2) аналогичные квантовые выходы и эффективность обнаружения. В то время как флуоресцентные белки использовались для исследований smFRET 23 , низкая фотостабильность и фотоиндуцированное мигание препятствовали дальнейшим применениям. Полупроводниковые квантовые точки (КТ) также использовались в качестве донора smFRET 24 за счет химического подавления их мерцания 25 , но большой размер (диаметр> 20 нм для коммерческих КТ) и отсутствие схемы одновалентного сопряжения ограничивают их использование.Следовательно, самые популярные одномолекулярные флуорофоры - это небольшие (<1 нм) органические красители 26 . Мы сравнили три пары FRET с оптической плотностью от 500 до 700 нм от разных производителей (цианиновые, алекса- и атто-красители) в. Хотя цианиновые красители (Cy3 и Cy5; донор и акцептор соответственно) долгое время были фаворитами, их аналоги кажутся сопоставимыми по своим соответствующим свойствам. Ни один из более голубых красителей, например те, которые можно возбуждать при 488 нм, не был столь фотостабильным. Замена Cy3 для синтеза пользовательской РНК, Dy547, даже более фотостабильна, чем Cy3 (Суа Мён, личное сообщение).Тетраметилродамин является жизнеспособной альтернативой и имеет почти такой же спектр, что и Cy3, но с более низким коэффициентом экстинкции. Однако он имеет тенденцию к спонтанному изменению своей интенсивности между тремя различными уровнями (неопубликованные наблюдения). Красители для ближнего инфракрасного диапазона, такие как Cy5.5 и Cy7, также служат эффективными однокомолекулярными красителями и могут использоваться в многоцветных схемах (обсуждается позже).

Таблица 1

Сравнение однокомолекулярных красителей FRET

9027 9027 9027
Краситель Возбуждение λ макс. (нм) Излучение λ макс. Фотостабильность (и) b (в Trolox / β ME)
Доноры
Cy3 5627 550 5500 91/50
ATTO550 554 577 1,9 72/27 c
Alexa555 555 563 9027 555 563 9027 9027
Акцепторы
Cy5 655 667 1.0 82/25 9027 6273
62/31
Alexa647 650 667 1,2 58/20 c

Повышение фотостабильности

Молекулярный кислород является эффективным гасителем красителя. также является источником высокореактивных форм кислорода, которые в конечном итоге вызывают фотообесцвечивание 27 . Хотя удаление кислорода снижает фотообесцвечивание, оно увеличивает время пребывания в триплетном темном состоянии 28 , вызывая миллисекундную или более длительную перемежаемость флуоресценции или раннее начало насыщения сигнала.Аналог витамина E под названием Trolox (2 мМ; 100 × исходный раствор, приготовленный в диметилсульфоксиде (ДМСО), требуется регулировка pH и фильтрация) является отличным гасителем триплетного состояния, который подавляет моргание и стимулирует длительное выделение популярных цианиновых красителей в сочетании с ферментативная система поглощения кислорода 28 . Trolox также должен обеспечить значительное улучшение временного разрешения, поскольку он задерживает наступление насыщения излучения с увеличением интенсивности лазера. Восстановитель β-меркаптоэтанол (βME; 142 мМ) является менее эффективным гасителем триплетного состояния и вызывает долгоживущие темные состояния Cy5 28 , побочный эффект, который использовался для приложений визуализации с фотопереключением сверхвысокого разрешения 29 .Существует множество других тушителей триплетного состояния или агентов против выцветания, которые могут оказаться полезными для нецианиновых красителей 30 .

Самая популярная ферментативная система поглощения кислорода 31 представляет собой смесь глюкозооксидазы (165 Ед / мл), каталазы (2170 Ед / мл) и β-D-глюкозы (0,4% масс.) (Или 0,8% моногидрата декстрозы). Глюкозооксидазу необходимо добавить непосредственно перед визуализацией, а образец держать изолированным от воздуха, чтобы pH раствора не упал значительно из-за образования глюконовой кислоты, побочного продукта реакции.Другими вариантами могут быть комбинация протокатехуиновая кислота / протокатехуат-3,4-диоксигеназа 32 , которая обеспечивает ~ 40% улучшение по сравнению с предыдущим методом (Нильс Вальтер, личное сообщение). Если высокоочищенные формы этих ферментов коммерчески недоступны, необходимо позаботиться о том, чтобы гарантировать отсутствие загрязняющей активности, особенно рибонуклеаз.

Конъюгация

Если доступна структурная информация, места маркировки должны быть выбраны таким образом, чтобы расстояние между красителями изменялось с меньшего на большее, чем значение R 0 (или наоборот ) для максимальной чувствительности.Существуют некоторые рекомендации для значений FRET 33 , ожидаемых для меченых нуклеиновых кислот 34, 35 . Общие стратегии конъюгации нуклеиновых кислот и белков кратко изложены в. Нуклеиновые кислоты лучше всего метить во время синтеза или с помощью оснований, модифицированных амином, которые можно отделить от немеченых молекул электрофорезом в полиакриламидном геле. Для взаимодействий нуклеиновая кислота-белок выгодно маркировать нуклеиновые кислоты из-за простоты конъюгации, обращения, очистки и гибкости в нанесении красителя.В исследованиях, связанных с взаимодействием белков с основной цепью ДНК, красители должны быть внутренне конъюгированы с использованием линкерных групп для предотвращения разрушения основной цепи. Экономично распространять модификации на две или более цепочек ДНК (или РНК) и отжигать их для создания конечной конструкции. В качестве общего подхода к сайт-специфической маркировке белков мы попытались пометить неприродную аминокислоту, содержащую кетонную группу 36 , генетически кодируемую в геликазе E.coli Rep, с использованием Cy3 или Cy5-гидризида.

Таблица 2

Стратегии конъюгации для красителей или биотина

фосфорам (ACE) синтез твердого носителя
Химия / метод Реактивная группа Замечание
ДНКит / РНК Прямое включение в основную цепь
Реакционноспособный с амином (-NH 2 ) сукцинимидиловый (NHS) эфир Амино C6- dT / dCbone без разрушения остова )
Тиолореактивный (-SH) Малеимид Тиоловый модификатор на 3'- или 5'-конце
Белки
Аминореактивный 90cc4 90cc4 90cc4 (NHS) сложный эфир N-конец или аминогруппа лизина a
Тиолореактивный (-SH) 9 0274 Малеимид Цистеиновая тиоловая группа b
Кетонореактивный (= CO) Гидразин Неестественная аминокислота с кетонной группой c

Выход белка, даже при приемлемом выходе флуоресценции был беден.Чрезвычайно низкий выход мечения кетоновыми группами на белках, размер которых превышает 100 остатков, даже в денатурирующих условиях, кажется общим (Ричард Эбрайт, личное сообщение). Низкое количество остатков цистеина (cys) в большинстве белков по сравнению с лизинами делает их идеальными для специфической маркировки. Следовательно, мечение остатков цистеина (введенное посредством сайт-направленного мутагенеза 37, 38, ) реакциями на основе малеимида остается наиболее популярной схемой мечения, хотя недавно разработаны, но менее общие альтернативы 26, 39 .Хотя выбор маркировки имеет наибольшее влияние на успех или неудачу экспериментов с smFRET, также важен выбор оборудования, используемого для обнаружения smFRET.

Детектирование отдельных молекул

Спектроскопия полного внутреннего отражения

В TIR-микроскопии 40, 41 создается исчезающее поле возбуждающего света, которое распространяется только на ~ 100-200 нм от поверхности, к которой привязан образец, что значительно уменьшает фоновая флуоресценция (). Твердотельный лазер на 532 нм (~ 50 мВт) подходит для пар FRET, обсуждаемых здесь, и гелий-неоновый лазер на 633 нм (~ 30 мВт) или диодные лазеры с аналогичными длинами волн могут быть добавлены для проверки наличия акцептора.Интенсивность лазера ослабляется с помощью полуволновой пластины и поляризационного светоделительного куба (или с помощью фильтров нейтральной плотности). Путем возбуждения большой площади (размером ∼0,05 мм 2 ) и использования детектирования на основе камеры параллельно отображаются сотни молекул. Обычно используется лазерный стол с плавающими в воздухе ножками, но макетная плата толщиной ∼25 мм с равномерно расположенными резьбовыми отверстиями, установленная на обычном лабораторном столе или столе, достаточно устойчива для TIR smFRET. Существует два типа TIR: призменный (PTIR) и объективный (OTIR) ().

Схема для спектроскопии smFRET. Этикетки - М, зеркальные; DM - дихроичное зеркало; L, линза; CCD, камера устройства с зарядовой связью; BE, расширитель луча; PBS, поляризационный светоделитель; λ / 2, полуволновая пластина ( a ), возбуждение TIR и обнаружение излучения одной пары FRET. Привязанные одиночные молекулы возбуждаются либо PTIR, либо OTIR. Флуоресценция собирается с помощью объектива, а щель создает конечную область изображения, которая составляет половину области изображения CCD. Коллимированное изображение разделяется на излучение донора и акцептора и отображается бок о бок на ПЗС-камере (см. Изображение камеры на вставке).( b ) Схемы возбуждения МДП (увеличенный вид коробки на (а)). В PTIR лазерный луч, сфокусированный под большим углом падения ( θ c > 68 °) на призму, расположенную в верхней части образца, создает исчезающее поле (EF) на границе раздела кварц / вода на предметном стекле. Поочередно при возбуждении OTIR сфокусированный лазерный луч падает на периферию задней фокальной плоскости объектива, вызывая TIR на границе раздела стекло / вода на покровном стекле рядом с объективом. ( c ) Обнаружение излучения для трех цветовой схемы.Изображение кадрируется с помощью щели, так что конечный размер изображения покрывает одну треть кристалла ПЗС. Набор дихроиков позволяет разделить отдельные излучения трех флуорофоров и визуализировать их одновременно.

В PTIR инвертированный микроскоп приспособлен для удерживания призмы из плавленого кварца наверху канала для образца, а флуоресценция собирается с объектива под 40, 41 (). После того, как падающий лазерный луч фокусируется с помощью линзы с длинным фокусным расстоянием, он входит в призму, проходит через масло для согласования показателя преломления и внутренне отражается на границе раздела кварц-вода (и дополнительные методы онлайн).Сигнал флуоресценции собирают с помощью иммерсионного объектива с большим рабочим расстоянием (60 ×, числовая апертура 1,2 (NA)). PTIR необходим для экспериментов по закачке жидкости, потому что его отображающая поверхность, состоящая из предметного стекла толщиной 1 мм, не изгибается при изменении давления во время потока. Дорогие (но пригодные для вторичной переработки) кварцевые предметные стекла необходимы для минимизации фона флуоресценции, и призму необходимо собирать заново каждый раз, когда загружается новый образец. Необходимость перенастройки пути освещения сводится к минимуму, если призма воспроизводимо размещается в одном и том же месте относительно корпуса микроскопа.

OTIR полагается на использование нефтяной цели с высоким NA для создания быстро исчезающего месторождения. Фокусировка луча в задней фокальной плоскости генерирует параллельный луч, выходящий из объектива, а затем, переводя его на периферию объектива, производит ПВО на границе раздела стекло / вода 40, 41 (). Флуоресценция молекул, привязанных к поверхности покровного стекла, собирается с использованием того же объектива. OTIR имеет более высокую эффективность сбора фотонов, освобождает пространство над образцом для дополнительного контроля образца и имеет коммерческие возможности.Во многом благодаря использованию объектива с низкой флуоресценцией UPlanSApo (100 ×, 1,4 NA, Olympus) мы можем получить данные smFRET для пары Cy3 / Cy5 с отношением сигнал / шум и площадью изображения, сопоставимой с призматическим типом ( неопубликованные результаты).

Обнаружение излучения

Микроскопия МДП приобрела популярность, отчасти благодаря новой волне высокочувствительных и быстрых фотоаппаратов с электронно-умножающимися устройствами с заряженными парами (ЭМ-ПЗС) 3, 42 . В установках smFRET обычно используются EM-CCD, которые имеют высокую квантовую эффективность (85-95%) в диапазоне 450-700 нм, низкий эффективный шум считывания (<1 электрон, среднеквадратичное значение) даже при самой высокой скорости считывания (≥ 10 МГц), быстрая скорость вертикального сдвига (≤ 1 мкс / строка; для достижения более высокой частоты кадров) и низкий уровень шума умножения.Используя EM-CCD 512 × 512 пикселей, мы можем получать данные с частотой от 33 Гц (при полном кадре) до 125 Гц (с биннингом 2 × 2).

Рассеянный свет возбуждающего лазера отклоняется от флуоресценции, собираемой объективом, с использованием длиннопроходного фильтра. Вертикальная щель вводится в плоскости формирования изображения сразу за боковым портом микроскопа, чтобы ограничить область изображения таким образом, чтобы окончательное изображение, падающее на ПЗС, было вдвое меньше размера ПЗС-кристалла (). Затем флуоресцентное излучение донора и акцептора разделяется с помощью дихроичного зеркала.Регулируя смещение с помощью дихроичного и дополнительного зеркала, излучение донора и акцептора может отображаться на ПЗС-камере рядом друг с другом (вставка). Эта оптическая схема отображает область изображения ∼75 мкм × 37 мкм на ПЗС-чипе. Простое расширение с использованием более узкой щели, соответствующей трети области ПЗС-матрицы, обеспечивает трехцветное обнаружение FRET (). Без дополнительных полосовых фильтров существует значительная перекрестная помеха между каналами обнаружения (например, 40% излучения Cy5 попадает в Cy5.5, если Cy5.5 используется в качестве второго приемника), но тщательная калибровка и коррекция могут восстановить исходную интенсивность 43 . Наш недавний тест показывает, что Cy7 является многообещающим флуорофором, который может заменить Cy5.5 в исходной трехцветной схеме FRET с одной молекулой; фотостабильность и яркость Cy7 были сопоставимы с таковыми Cy5.5, в то время как излучение Cy7 можно лучше отличить от излучения Cy5. Относительно низкая эффективность обнаружения камеры EMCCD на длине волны излучения Cy7 в настоящее время является проблемой, но это не должно быть проблемой для конфокальных измерений, поскольку кремниевый лавинный фотодиод поддерживает высокий квантовый выход обнаружения на этих длинах волн.Уменьшение пропускания в этой спектральной области можно до некоторой степени уменьшить с помощью оптимизированных для инфракрасного излучения объективов и оптики.

Подготовка образца к сбору данных

Иммобилизация поверхности

Хотя кварцевые слайды абсолютно необходимы для PTIR, тонкое покровное стекло формирует поверхность для визуализации OTIR, а обычные стеклянные покровные стекла обычно подходят для флуоресцентной визуализации одиночных молекул в OTIR. Для стабильной и специфической, но не мешающей иммобилизации образца на предметном стекле или покровном стекле обычно используется связь биотин-стрепавидин 5, 22, 44 .В эффективном методе исследований с участием только нуклеиновых кислот используется биотинилированный бычий сывороточный альбумин (биотин БСА), который адсорбируется на поверхности стекла / кварца и связывает биотинилированные молекулы через поливалентный стрептавидиновый белок (нейтравидин - менее дорогая альтернатива) (). Для исследований белков неспецифическое связывание с поверхностью необходимо подавлять с помощью дополнительного пассивирующего агента, наиболее популярным из которых является полиэтиленгликоль (PEG) 45 . Предварительно очищенное поверхностно-активированное предметное стекло аминосиланизируется и реагирует с ПЭГ, модифицированным сложным эфиром N-гидроксисукцинимида (NHS), который также включает небольшую фракцию сложного эфира биотин-ПЭГ-NHS для специфического связывания () 44 (Дополнительный протокол онлайн).Адгезию нуклеиновых кислот к поверхности ПЭГ при pH <7,0 можно уменьшить путем дальнейшей пассивирования поверхности сульфодисукцинимидилтартратом 46 . Сильное взаимодействие между денатурированным белком и линейным ПЭГ можно устранить, используя вместо этого разветвленный ПЭГ, и они могут служить лучшими пассивирующими агентами 47, 48 . Белки, меченные гистидином, также могут быть прикреплены к поверхности с помощью хелатных групп Ni 2+ или Cu 2+ 49 , однако для оптимального ориентационного позиционирования и устранения поверхностных артефактов иногда может потребоваться спейсер между последовательностью гистидинового тега и белок ().Некоторые из этих ПЭГилированных вариантов также коммерчески доступны (http://www.proteinslides.com/index.html). Более строгое отклонение неспецифического связывания может быть достигнуто путем повторения реакции ПЭГилирования два или три раза (Юджи Ишицука, личное сообщение).

Стратегии иммобилизации поверхности для экспериментов smFRET. ( a ) Белки биотин-БСА неспецифично связываются с биотинилированными молекулами поверхностного связывания с помощью поливалентных белков авидина (например, нейтравидина).( b ) Смесь биотин-ПЭГ и ПЭГ ковалентно прикрепляется к аминосиланизированной поверхности предметного стекла. Биотины на ПЭГ могут связываться с ДНК (или белком), сконструированной с биотиновой составляющей, с помощью сэндвича с белком нейтравидина. Покрытие PEG предотвращает неспецифическое связывание. ( c ) Покрытые ПЭГ поверхности могут быть сконструированы так, чтобы нести Ni 2+ или Cu 2+ , хелатированные на иминодиуксусной кислоте (IDA) (или нитрилотриуксусной кислоте (NTA)), которые эффективно связываются с 6x His-меченными белками. при сохранении функциональной активности.( d ) Используя димиристоилфосфатидилхолин (DMPC) при комнатной температуре, везикулы, избирательно проницаемые для малых молекул, можно использовать для улавливания биомолекул. Фракция биотинилированного липида позволяет специфически прикреплять везикулы к поверхности биотин-ПЭГ. Этикетки D и A обозначают донорные и акцепторные красители.

Инкапсуляция одиночных молекул внутри поверхностно-привязанных фосфолипидных везикул 50-52 имитирует клеточный захват, снижает возмущение системы и не требует привязки к молекуле.С принятием полупроницаемых везикул 53 , этот подход позволяет изучать повторяющиеся столкновения между одним и тем же набором слабо взаимодействующих молекул в различных условиях раствора, не страдая от высокого фона ().

Камера для образцов

Герметичная камера для образцов создается за счет прослоения двусторонней ленты или парафильма между предварительно очищенным предметным стеклом и покровным стеклом (см. Дополнительный протокол онлайн) и путем нанесения эпоксидной смолы по мере необходимости. Простое пипетирование или перекачивание через два отверстия, предварительно просверленных в предметном стекле, позволяет заменять раствор без сушки ().Собранную камеру проверяют на неспецифическое связывание перед нанесением стрептавидина путем визуализации поверхности в присутствии 1 нМ меченой ДНК и / или белка. Если плотность неспецифически связанных флуоресцентных пятен составляет <10% от специфически связанных молекул (обычно специфическое прикрепление с «хорошей» плотностью обеспечивает ~ 0,1-0,2 пятен / мкм 2 ), подготовка предметного стекла считается приемлемой. После стрептавидина добавляют биотиновые биомолекулы в низких концентрациях (20-100 пМ в буфере, содержащем 0.1 мг / мл БСА для уменьшения потерь молекул на другие поверхности) для достижения иммобилизации при желаемой плотности одиночных молекул. Более высокая плотность увеличивает вероятность перекрытия соседних молекул. Фильмы с такими связанными молекулами приобретаются и сохраняются на жестком диске напрямую с помощью специальной программы, написанной на Visual C ++.

Камера для проб. ( a ) Камера для образца изготавливается путем размещения предметного стекла микроскопа и покровного стекла двусторонней лентой и герметизации эпоксидной смолой. Отверстия на слайде используются для входа и выхода обмена раствора.( b ) Шприц подсоединен к камере через трубку, а наконечник пипетки, содержащий раствор, плотно вставлен во входное отверстие. Когда шприц вытягивается, раствор вводится в камеру. Воспроизведено с исх. 7 с разрешения Cold Spring Harbor Laboratory Press.

Калибровка

Перекрестные помехи между каналами обнаружения необходимо скорректировать до оценки истинной эффективности FRET. С молекулами только донора и только акцептора, возбужденными на длинах волн возбуждения донора, мы определяем утечку излучения донора в канал (ы) акцептора и прямое возбуждение акцептора (ов) соответственно.При прямом возбуждении только акцепторных молекул (вблизи максимума поглощения) мы определяем утечку излучения акцептора в канал обнаружения донора.

Картирование между изображениями донора и акцептора выполняется с изображением привязанных к поверхности флуоресцентных микросфер со значительной эмиссией во всех каналах обнаружения. Мы вручную выбираем 3-4 пика флуоресценции в изображении донора и соответствующие им пики в изображении акцептора, и автоматический алгоритм генерирует линейное преобразование между двумя изображениями, которое корректирует смещение, поворот, масштабирование и искажение.

Обработка и анализ данных

Алгоритмы обработки данных

Чтобы преобразовать файлы фильмов во временные траектории одиночных молекул, мы сначала идентифицируем изолированные пики одиночных молекул из составного изображения донорных и акцепторных каналов (среднее значение первых десяти кадров), построенного с использованием сгенерированное отображение ( см. выше ). Совместно локализующиеся донорные и акцепторные пятна отбираются для окончательного анализа с целью удаления частично меченых молекул. Затем локальный фон вычитается из пиков, и интенсивности из 7 × 7 пикселей (в зависимости от общего увеличения), окружающие пик (что соответствует площади ∼ 1 мкм 2 ), интегрируются для восстановления интенсивности доноров и акцепторов для каждой отдельной молекулы для каждый кадр.В экспериментах, где ожидается только временное присутствие меченой донором молекулы 54 , первый шаг может быть выполнен для каждого набора из десяти последовательных кадров.

Эффективность FRET

После корректировки перекрестных помех и фона (определяемой по кривым интенсивности после фотообесцвечивания красителя) в обоих каналах, кажущаяся эффективность FRET рассчитывается как E app = I A / ( I A + I D ), где I A и I D представляют интенсивности акцептора и донора соответственно. E app предоставляет только приблизительный индикатор расстояния между красителями из-за неопределенности в коэффициенте ориентации κ 2 между двумя флуорофорами и необходимых инструментальных поправок. Как показывает опыт, если анизотропия флуоресценции r обоих флуорофоров меньше 0,2, κ 2 близка к 2/3 34, 55 . Мы обнаружили, что в целом r > 0,2 для популярных флуорофоров smFRET, конъюгированных с нуклеиновыми кислотами или белками, поэтому необходимо соблюдать осторожность при извлечении информации об абсолютном расстоянии.Тем не менее, в каждом случае, который мы тестировали, кажущееся FRET было монотонной функцией расстояния. Чтобы определить фактическую эффективность FRET, необходимо определить поправочный коэффициент γ , который учитывает различия в квантовом выходе и эффективности регистрации между донором и акцептором. γ рассчитывается как отношение изменения интенсивности акцептора, ΔI A к изменению интенсивности донора, ΔI D при фотообесцвечивании акцептора ( γ = ΔI A IΔI Д ) 21, 56 .Затем рассчитывается скорректированная эффективность FRET с использованием выражения

Белки могут изменять фотофизические свойства флуорофора. Например, мы и другие наблюдали, что флуоресценция ДНК-конъюгированного Cy3 увеличивается, когда белок связывается около 57, 58 . Этот эффект изменяет эффективность FRET за счет изменения γ . Точно так же фотоиндуцированный перенос электронов между основаниями ДНК и красителем может тушить красители, и на это явление может влиять связывание с белками в районе 59-61 .

Интерпретация данных: подводные камни и советы

Высокопроизводительные эксперименты на основе TIR помогают нам быстро получать статистически значимые объемы данных. Тогда основной проблемой является анализ и интерпретация данных, которые иногда могут сбивать с толку из-за потенциальных артефактов или двусмысленностей. Вот несколько советов о том, чего следует остерегаться.

  1. Не останавливайтесь на «интересных» эффектах, наблюдаемых в небольшой части (<5%) молекул, потому что на этом уровне многие артефакты невозможно отличить от реальных событий.Вместо этого улучшите биологические конструкции и условия анализа, чтобы большинство молекул функционировало аналогичным образом.

  2. Если поправочный коэффициент γ близок к 1, общий сигнал флуоресценции (сумма интенсивностей донора и акцептора), всего I , должен оставаться постоянным. Постоянные изменения в I итого могут быть признаком неспецифической привязанности. Дополнительные источники интенсивного шума включают временное связывание флуоресцентных примесей, изменения свойств красителя из-за взаимодействия с белками или поверхностью или постепенную потерю фокуса.

  3. Длинные видеоролики, показывающие одноэтапные события фотообесцвечивания, должны быть сняты, чтобы убедиться, что полученный сигнал действительно исходит от одиночных молекул.

  4. Обратимое выключение (так называемое мигание) Cy5 (или подобных красителей) 62 - хорошо известный артефакт (см.), Который часто ошибочно интерпретируется как большое изменение конформации в состояние с очень низким FRET, например макромолекулярное разворачивание. Эмпирическое правило заключается в том, что если FRET мгновенно падает только до уровня донора ( E app = 0), считайте, что он мигает.Если очень низкое состояние FRET обнаруживается даже в присутствии средств подавления мигания, таких как Trolox, и если прямое возбуждение акцептора подтверждает его активность, можно исключить мигание. Фотофизические явления, такие как мигание, также можно отличить по их известной зависимости от интенсивности возбуждения 28 .

Хотя анализ данных по отдельным молекулам зависит от системы, стоит упомянуть некоторые часто используемые инструменты. Информацию о равновесных свойствах лучше всего получить с помощью гистограммы smFRET, полученной путем усреднения эффективности FRET каждой молекулы по первым 3-10 точкам данных.Обычно мы получаем 10-20 коротких (~ 5 с) фильмов о различных областях выборки для объективного обзора распределения населения. Временные траектории отдельных молекул (из длинных фильмов) в равновесии передают ценную кинетическую информацию системы через время пребывания в каждом конформационном состоянии. Например, для системы с двумя состояниями, претерпевающей стохастические переходы, скорости переходов определяются из экспоненциального спада, подходящего к распределению времени пребывания каждого состояния 63 , или путем выполнения автокорреляционного анализа в сочетании с определением равновесия, если переходы слишком быстрые для надежных определение времени пребывания 64 .Для более сложных переходов между отчетливо идентифицируемыми множественными состояниями можно использовать анализ скрытой марковской модели (HMM) для несмещенной оценки количества заселенных состояний FRET, оценки скорости взаимного преобразования между ними и определения наиболее вероятной временной эволюции в каждом штате 65 (доступно для загрузки на http://bio.physics.uiuc.edu/HaMMy.html). График плотности переходов от начальных до конечных значений FRET для каждого перехода, полученный из HMM (или другого) анализа, обеспечивает визуально привлекательную и объективную компиляцию данных 57, 65-67 .Другие подходы, основанные на теории информации, также доступны для данных о конфокальных одиночных молекулах, полученных фотон за фотоном 68-70 . Преимущества экспериментов с одной молекулой становятся более очевидными в неравновесных условиях, когда можно проследить, например, путь реакции одного фермента, претерпевающего серию переходов для достижения своего каталитического цикла. Мощный, визуальный метод представления неравновесных данных smFRET многих молекул был разработан для исследований рибосом 71 .

Ограничения smFRET

Крайне важно указать на некоторые ограничения метода до того, как кто-то спроектирует первый эксперимент smFRET. (1) smFRET требует присоединения по крайней мере двух внешних красителей к интересующей молекуле (ам), поскольку (полу) собственные хромофоры, такие как 2-аминопурин и триптофан, недостаточно яркие или фотостабильные для измерения одиночных молекул. В некоторых случаях сайт-специфическое мечение не является тривиальным, особенно для больших молекул РНК 72, 73 и многих белков 74, 75 .Обратите внимание, что smFRET относительно нечувствителен к неполной маркировке. Если донор отсутствует, молекула просто не наблюдается; если акцептор отсутствует, этот вид только-донора обнаруживается как популяция с нулевым FRET. (2) Поскольку обнаружение одиночных молекул достигается за счет пространственного разделения, слабо взаимодействующие флуоресцентные частицы трудно изучать (но не всегда, см. Выше ). (3) FRET нечувствителен к изменениям расстояния за пределами диапазона расстояний между красителями 2-8 нм для R 0 = 5 нм.Однако изменения расстояния всего лишь 0,3 нм могут быть обнаружены для одиночных молекул между 0,6 R 0 и 1,5 R 0 , где FRET является почти линейной функцией R. (4) Для достижения адекватного сигнала: Отношение к шуму, необходимо зарегистрировать ∼100 полных фотонов. Учитывая, что до фотообесцвечивания можно собрать более 10 5 фотонов от отдельных молекул красителя, можно получить более 10 3 точек данных. (5) Временное разрешение ограничено частотой кадров ПЗС-камеры (в лучшем случае = 1 мс).(6) Оценка абсолютного расстояния является сложной задачей из-за зависимости флуоресцентных свойств и передачи энергии от окружающей среды и ориентации красителей. Таким образом, smFRET использовался в основном для задач, где точная информация о расстоянии не важна. Тем не менее, можно сделать разумные оценки факторов ориентации 76 , и контрольные эксперименты с каждым красителем могут обеспечить хорошее приближение расстояний между красителями 77, 78 . Опасения по поводу этих проблем можно было бы дополнительно уменьшить, используя избыточное количество ограничений расстояния в исследованиях триангуляции 79, 80 .

Усовершенствованные методы smFRET

Ниже кратко излагаются некоторые из новых интересных технических разработок, все еще находящихся на стадии подтверждения принципа действия.

По мере усложнения исследуемой системы требуется дополнительная информация для устранения неоднозначности. Для этой цели был реализован трехцветный smFRET с использованием Cy3 (донор), Cy5 (акцептор 1) и Cy5.5 (акцептор 2) в качестве трех отдельных флуорофоров, оптимизации конфокальной оптики обнаружения и разработки новой схемы анализа данных 43 .Используя эту технику, были обнаружены коррелированные движения различных сегментов четырехстороннего соединения ДНК (Холлидея). Трехцветный smFRET также работает на основе TIRF и привел к прямому наблюдению за движением белка на одноцепочечной ДНК (неопубликованные результаты). Трехцветное обнаружение одной молекулы также использовалось для различения нескольких видов и наблюдения взаимодействий между тремя разными молекулами 81, 82 . Многоцветная схема возбуждения для дальнейшего различения различных молекулярных частиц 83, 84 недавно была расширена до трехцветной FRET 85 .Также были показаны перспективы дальнейшего расширения FRET с помощью нескольких флуорофоров на одиночных молекулах ДНК 86 .

По мере признания важности механических факторов в биологии, к smFRET добавляется недостающее измерение контролируемого манипулирования силой с конечной целью измерения конформационных изменений с помощью флуоресценции как функции силы, применяемой такими методами, как оптические и магнитные. пинцет. Оптические пинцеты были объединены с расцепителями флуоресценции одиночных молекул 87 и FRET 88 , чтобы сообщить о принудительном распаковке шпильки ДНК.Магнитный пинцет использовали для построения калибровочной кривой FRET в зависимости от силы для энтропийной пружины, изготовленной из однонитевой ДНК 89 . Совсем недавно реакция одиночных узлов Холлидея при низкой силе отслеживалась с помощью гибридного инструмента, объединяющего FRET и оптический пинцет, чтобы составить карту двумерного складчатого ландшафта 90 . smFRET был также объединен с одноканальной записью простого димерного канала грамицидина 91, 92 .

Заключительные примечания

Мы обсудили практические вопросы хорошо зарекомендовавшего себя smFRET на основе МДП, а также кратко упомянули более футуристические технические разработки.Две области, которые все еще не разработаны, - это измерения в живой клетке, что, вероятно, требует значительных улучшений зондов, и анализ динамики мембранных белков, что уже является сложной задачей на уровне ансамбля. Тем не менее, smFRET является одним из мощных инструментов для «изучения» динамики и взаимодействия отдельных биомолекул в реальном времени. Все, что нам нужно сейчас, - это открыть глаза «одной молекуле» на широкий спектр биомолекулярных взаимодействий, требующих тщательного изучения.

Дополнительный материал

Дополнительные материалы

Дополнительная таблица 1 : Список материалов и реагентов

Дополнительная таблица 2 : Список оптики и инструментов

Дополнительный протокол : Протокол пассивации поверхности полиэтиленгликолем (PEG)

Дополнительные методы : Настройка возбуждения и излучения МДП

Благодарности

Мы благодарим И. Расника, С. Маккинни, К.Джу, Р. Клегг, С. Мион и члены группы Ха в Университете Иллинойса и К. Дрексхаге из Университета Зигена за экспертные консультации и обсуждения, С. Сайед из Университета Иллинойса за закупку красителей и реагентов и П. Корниш, М. Бреннеру и Л. Суприя за внимательное чтение рукописи. К. Джу подготовил видеоинструкцию по приготовлению слайдов с ПЭГ. Авторская работа по FRET с одной молекулой финансировалась Национальным институтом здравоохранения, премией Национального научного фонда и Медицинским институтом Говарда Хьюза.SH также была поддержана Фондом научно-исследовательских работ для нового факультета Сеульского национального университета (Корея), грантом Министерства науки и технологий (№ RH0-2005-000-01003-0, 2007) и грантом на фундаментальные научные исследования из Кореи. Исследовательский фонд.

Список литературы

1. Фейнман Р.П. Внизу много места. J Microelectromech Syst. 1992; 1: 60–66. [Google Scholar] 2. Бустаманте С., Брайант З., Смит С.Б. Десять лет напряженности: механика одномолекулярной ДНК. Природа. 2003. 421: 423–427.[PubMed] [Google Scholar] 3. Моернер В.Е., Фромм Д.П. Методы флуоресцентной спектроскопии и микроскопии одиночных молекул. Rev Sci Inst. 2003. 74: 3597–3619. [Google Scholar] 4. Форстер Т. Экспериментальное и теоретическое исследование межмолекулярного переноса энергии электронного возбуждения. Zeitschrift Naturforsch A. 1949; 4: 321–327. [Google Scholar] 5. Ха Т. Одномолекулярный резонансный перенос энергии флуоресценции. Методы. 2001; 25: 78–86. [PubMed] [Google Scholar] 6. Вайс С. Флуоресцентная спектроскопия одиночных биомолекул.Наука. 1999; 283: 1676–1683. [PubMed] [Google Scholar] 7. Joo C, Ha T. In: Методы одиночных молекул: лабораторное руководство. Селвин П., Ха Т, редакторы. Лаборатория Колд-Спринг-Харбор, Колд-Спринг-Харбор; NY: 2007. С. 3–36. [Google Scholar] 8. Ha T, et al. Исследование взаимодействия между двумя отдельными молекулами: передача резонансной энергии флуоресценции между одним донором и одним акцептором. Proc Natl Acad Sci U S. A. 1996; 93: 6264–6268. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 9. Капанидис А.Н. и др.Переменное лазерное возбуждение одиночных молекул. Acc Chem Res. 2005; 38: 523–533. [PubMed] [Google Scholar] 10. Michalet X, Weiss S, Jager M. Одномолекулярные флуоресцентные исследования сворачивания белка и конформационной динамики. Chem Rev.2006; 106: 1785–1813. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 11. Зайдель Р., Деккер С. Исследования одномолекулярных двигателей нуклеиновых кислот. Curr Opin Struct Biol. 2007; 17: 80–86. [PubMed] [Google Scholar] 12. Смайли Р.Д., Хаммес Г.Г. Одномолекулярные исследования ферментативных механизмов.Chem Rev.2006; 106: 3080–3094. [PubMed] [Google Scholar] 13. Zhuang XW. Одномолекулярная РНК-наука. Annu Rev Biophys Biomol Struct. 2005. 34: 399–414. [PubMed] [Google Scholar] 14. Форстер Т. // Современная квантовая химия. О С, редактор. Академическая пресса; Нью-Йорк: 1967. С. 93–137. [Google Scholar] 16. Дениз А.А. и др. Однопарный резонансный перенос энергии флуоресценции на свободно диффундирующих молекулах: наблюдение зависимости Форстера от расстояния и субпопуляций. Proc Natl Acad Sci U S. A. 1999; 96: 3670–3675.[Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 17. Best RB, et al. Эффект гибкости и цис-остатков в исследованиях одномолекулярного FRET полипролина. Proc Natl Acad Sci U S. A. 2007; 104: 18964–18969. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 18. Торговец KA, Best RB, Louis JM, Gopich IV, Eaton WA. Характеристика развернутых состояний белков с помощью FRET-спектроскопии одиночных молекул и молекулярного моделирования. Proc Natl Acad Sci U S. A. 2007; 104: 1528–1533. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 20.Ha T, Chemla DS, Enderle T, Weiss S. Спектроскопия одиночных молекул с автоматическим позиционированием. App Phys Lett. 1997; 70: 782–784. [Google Scholar] 21. Sabanayagam CR, Eid JS, Meller A. Высокопроизводительный сканирующий конфокальный микроскоп для анализа отдельных молекул. App Phys Lett. 2004. 84: 1216–1218. [Google Scholar] 22. Чжуанг X и др. Одномолекулярное исследование катализа и сворачивания РНК. Наука. 2000; 288: 2048–2051. [PubMed] [Google Scholar] 23. Brasselet S, Peterman EJG, Miyawaki A, Moerner WE. Резонансный перенос энергии флуоресценции одиночных молекул у камелеона, зависимого от концентрации кальция.J. Phys Chem B. 2000; 104: 3676–3682. [Google Scholar] 24. Hohng S, Ha T. Одномолекулярный квантово-точечный флуоресцентный резонансный перенос энергии. Chemphyschem. 2005; 6: 956–960. [PubMed] [Google Scholar] 25. Hohng S, Ha T. Почти полное подавление мерцания квантовых точек в условиях окружающей среды. J Am Chem Soc. 2004; 126: 1324–1325. [PubMed] [Google Scholar] 26. Капанидис А.Н., Вайс С. Флуоресцентные зонды и химия биоконъюгации для анализа флуоресценции одиночных молекул биомолекул. J Chem Phys. 2002; 117: 10953–10964.[Google Scholar] 27. Hubner CG, Renn A, Renge I, Wild UP. Прямое наблюдение тушения триплетного времени жизни одиночных молекул красителя молекулярным кислородом. J Chem Phys. 2001; 115: 9619–9622. [Google Scholar] 28. Расник И., МакКинни С.А., Ха Т. Немигающая и долговременная флуоресцентная визуализация одиночных молекул. Nat Meth. 2006; 3: 891–893. [PubMed] [Google Scholar] 29. Руст MJ, Bates M, Zhuang X. Получение изображений с субдифракционным пределом с помощью микроскопии стохастической оптической реконструкции (STORM) Nat Meth. 2006; 3: 793–795. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 30.Виденгрен Дж., Чмыров А., Эггелинг С., Лофдаль П.А., Зайдель С. Стратегии повышения фотостабильности в сверхчувствительной флуоресцентной спектроскопии. J. Phys Chem A. 2007; 111: 429–440. [PubMed] [Google Scholar] 31. Бенеш Р.Е., Бенеш Р. Ферментативное удаление кислорода для полярографии и связанных с ней методов. Наука. 1953; 118: 447–448. [PubMed] [Google Scholar] 32. Aitken CE, Marshall RA, Puglisi J. Система поглощения кислорода для улучшения стабильности красителя в экспериментах по флуоресценции одиночных молекул. Биофиз Дж.2007; 107: 117689. biophysj. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 33. Ву П.Г., Брэнд Л. Резонансная передача энергии - методы и приложения. Анальная биохимия. 1994; 218: 1–13. [PubMed] [Google Scholar] 34. Clegg RM. Флуоресцентный резонансный перенос энергии и нуклеиновые кислоты. Методы Энзимол. 1992; 211: 353–388. [PubMed] [Google Scholar] 35. Murphy MC, Rasnik I, Cheng W, Lohman TM, Ha T. Исследование конформационной гибкости одноцепочечной ДНК с использованием флуоресцентной спектроскопии. Биофиз Дж. 2004; 86: 2530–2537. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 36.Рю Й.Х., Шульц П.Г. Эффективное включение неприродных аминокислот в белки Escherichia coli. Nat Meth. 2006; 3: 263–265. [PubMed] [Google Scholar] 37. Хигучи Р., Круммель Б., Сайки РК. Общий метод подготовки in vitro и специфический мутагенез фрагментов ДНК: изучение взаимодействия белков и ДНК. Nucleic Acids Res. 1988; 16: 7351–7367. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 38. Браман Дж. Протоколы мутагенеза in vitro. 2-й. Vol. 182. Humana Press; Тотова, Нью-Джерси: 2001. [Google Scholar] 39.Pennington MW. Процедуры химической модификации для конкретных участков. Методы Мол биол. 1994; 35: 171–185. [PubMed] [Google Scholar] 40. Аксельрод Д. Неинвазивные методы в клеточной биологии. Вили-Лисс; Нью-Йорк: 1990. [Google Scholar] 41. Аксельрод Д. Флуоресцентная микроскопия полного внутреннего отражения в клеточной биологии. Методы Энзимол. 2003; 361: 1–33. [PubMed] [Google Scholar] 44. Ha T, et al. Инициирование и повторное инициирование раскручивания ДНК реп-геликазой Escherichia coli. Природа. 2002; 419: 638–641. [PubMed] [Google Scholar] 45.София С.Дж., Премнат В.В., Меррилл Е.В. Поли (этиленоксид), привитый к поверхности кремния: плотность прививки и адсорбция белка. Макромолекулы. 1998. 31: 5059–5070. [PubMed] [Google Scholar] 46. Шредер С.М., Блейни П.С., Ким С., Се XS. В: Методы одиночных молекул: лабораторное руководство. Селвин П., Ха Т, редакторы. Лаборатория Колд-Спринг-Харбор, Колд-Спринг-Харбор; NY: 2007. С. 461–492. [Google Scholar] 47. Heyes CD, Кобицкий А.Ю., Амиргулова Е.В., Ниенхаус ГУ. Биосовместимые поверхности для специфического связывания отдельных белковых молекул.J. Phys Chem B. 2004; 108: 13387–13394. [Google Scholar] 48. Heyes CD, Groll J, Moller M, Nienhaus GU. Синтез, формирование рисунка и применение звездообразных биофункциональных поверхностей из полиэтиленгликоля. Mol BioSyst. 2007; 3: 419–430. [PubMed] [Google Scholar] 49. Ча Т, Го А, Чжу XY. Ферментативная активность на чипе: критическая роль ориентации белков. Протеомика. 2005; 5: 416–419. [PubMed] [Google Scholar] 51. Okumus B, Wilson TJ, Lilley DM, Ha T. Исследования инкапсуляции везикул показывают, что гетерогенность одиночных молекул рибозима является внутренней.Биофиз Дж. 2004; 87: 2798–2806. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 52. Бенитес Дж. Дж. И др. Исследование временных взаимодействий медных шаперонов и белков болезни Вильсона на уровне одной молекулы с захватом нанопузырьков. J Am Chem Soc. 2008; 130: 2446–2447. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 54. Myong S, Rasnik I., Joo C, Lohman TM, Ha T. Повторяющееся перемещение моторного белка на ДНК. Природа. 2005; 437: 1321–1325. [PubMed] [Google Scholar] 55. Ван дер Меер Б.В. Резонансная передача энергии.Wiley; Чичестер: 1999. [Google Scholar] 56. Ha T, et al. Одномолекулярная флуоресцентная спектроскопия конформационной динамики и механизма расщепления ферментов. Proc Natl Acad Sci U S. A. 1999; 96: 893–898. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 57. Джу С. и др. Наблюдение в реальном времени за динамикой волокна RecA с разрешением по одному мономеру. Клетка. 2006; 126: 515–527. [PubMed] [Google Scholar] 58. Ло Г, Ван М, Кенигсберг WH, Се XS. Одномолекулярные и ансамблевые флуоресцентные анализы функционально важных конформационных изменений в ДНК-полимеразе Т7.Proc Natl Acad Sci U S. A. 2007; 104: 12610–12615. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 59. Клегг Р.М., Мурчи А.И., Зечел А., Лилли Д.М. Наблюдение спиральной геометрии двухцепочечной ДНК в растворе с помощью флуоресцентного резонансного переноса энергии. Proc Natl Acad Sci U S. A. 1993; 90: 2994–2998. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 60. Купер Дж. П., Хагерман П. Дж. Анализ переноса энергии флуоресценции в дуплексных и разветвленных молекулах ДНК. Биохимия. 1990; 29: 9261–9268. [PubMed] [Google Scholar] 61.Ли С.П., Портер Д., Чирикджян Дж. Г., Кнутсон Дж. Р., Хан М.К. Флуорометрический анализ реакций расщепления ДНК, характеризуемых эндонуклеазой рестрикции BamHI. Анальная биохимия. 1994; 220: 377–383. [PubMed] [Google Scholar] 62. Ha TJ, et al. Временные колебания резонансного переноса энергии флуоресценции между двумя красителями, конъюгированными с одним белком. Chem Phys. 1999; 247: 107–118. [Google Scholar] 63. Colquhoun D, ​​Hawkes AG. В: Одноканальная запись. Сакманн Б., Нехер Э., редакторы. Пленум Пресс; Нью-Йорк: 1995.С. 397–482. [Google Scholar] 64. Ким HD и др. Mg2 + -зависимые конформационные изменения РНК изучали с помощью корреляции флуоресценции и FRET на иммобилизованных одиночных молекулах. Proc Natl Acad Sci U S. A. 2002; 99: 4284–4289. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 65. McKinney SA, Joo C, Ha T. Анализ траекторий FRET одиночных молекул с использованием скрытого марковского моделирования. Biophys J. 2006; 91: 1941–1951. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 66. Манро Дж. Б., Альтман Р. Б., О'Коннор Н., Бланшар СК. Идентификация двух различных промежуточных продуктов гибридного состояния на рибосоме.Mol Cell. 2007. 25: 505–517. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 67. Myong S, Bruno MM, Pyle AM, Ha T. Пружинный механизм раскручивания ДНК геликазой NS3 вируса гепатита C. Наука. 2007; 317: 513–516. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 68. Ян Х, Се XS. Зондирование фотона динамики одной молекулы фотоном. J Chem Phys. 2002; 117: 10965–10979. [Google Scholar] 69. Андрек М, Леви Р.М., Талага Д.С. Прямое определение кинетических скоростей по траекториям прихода фотонов одной молекулы с использованием скрытых марковских моделей.J. Phys Chem A. 2003; 107: 7454–7464. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 70. Шредер Г.Ф., Грубмюллер Х. Траектории максимального правдоподобия из экспериментов по резонансному переносу энергии флуоресценции одиночных молекул. J Chem Phys. 2003; 119: 9920–9924. [Google Scholar] 71. Бланшар СК, Гонсалес Р.Л., Ким Х.Д., Чу С., Пуглиси ДжейДи. Отбор тРНК и кинетическая корректура при переводе. Nat Struct Mol Biol. 2004. 11: 1008–1014. [PubMed] [Google Scholar] 72. Смит Г.Дж., Сосник Т.Р., Шерер Н.Ф., Пан Т. Эффективное флуоресцентное мечение большой РНК посредством гибридизации олигонуклеотидов.РНК. 2005; 11: 234–239. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 73. Dorywalska M, et al. Сайт-специфическая маркировка рибосомы для спектроскопии одиночных молекул. Nucleic Acids Res. 2005. 33: 182–189. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 74. Дениз А.А. и др. Сворачивание одномолекулярного белка: исследования диффузионного флуоресцентного резонансного переноса энергии денатурации ингибитора химотрипсина 2. Proc Natl Acad Sci U S. A. 2000; 97: 5179-5184. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 75. Ягер М, Нир Э, Вайс С.Сайт-специфическая маркировка белков для одномолекулярного FRET путем комбинирования химической и ферментативной модификации. Protein Sci. 2006. 15: 640–646. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 76. Дейл Р.Э., Эйзингер Дж., Блумберг В.Е. Ориентационная свобода молекулярных зондов - фактор ориентации во внутримолекулярной передаче энергии. Биофиз Дж. 1979; 26: 161–193. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 77. Schuler B, Lipman EA, Steinbach PJ, Kumke M, Eaton WA. Полипролин и «спектроскопическая линейка» заново с флуоресценцией одиночных молекул.Proc Natl Acad Sci U S. A. 2005; 102: 2754–2759. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 78. Ротвелл П.Дж. и др. Многопараметрическая флуоресцентная спектроскопия одиночных молекул выявляет гетерогенность комплексов обратной транскриптазы ВИЧ-1: праймер / матрица. Proc Natl Acad Sci U S. A. 2003; 100: 1655–1660. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 79. Rasnik I, Myong S, Cheng W, Lohman TM, Ha T. Ориентация связывания ДНК и конформация домена мономера реп-геликазы E. coli, связанного с частичным дуплексным соединением: исследования одной молекулы флуоресцентно меченых ферментов.J Mol Biol. 2004; 336: 395–408. [PubMed] [Google Scholar] 81. Кламм Дж. П., Дениз А. А.. Трехцветный резонансный перенос энергии флуоресценции одной молекулы. Chemphyschem. 2005; 6: 74–77. [PubMed] [Google Scholar] 82. Хайнце К.Г., Янц М., Швилле П. Анализ совпадений трех цветов: еще один шаг в изучении образования молекулярных комплексов более высокого порядка. Биофиз Дж. 2004; 86: 506–516. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 83. Капанидис А.Н. и др. Сортировка молекул с помощью флуоресценции: анализ структуры и взаимодействий с помощью переменного лазерного возбуждения отдельных молекул.Proc Natl Acad Sci U S. A. 2004; 101: 8936–8941. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 85. Ли Н.К. и др. Трехцветное переменное лазерное возбуждение отдельных молекул: мониторинг множественных взаимодействий и расстояний. Биофиз Дж. 2007; 92: 303–312. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 86. Heilemann M, et al. Многоступенчатая передача энергии в одиночных молекулярных фотонных проволоках. J Am Chem Soc. 2004; 126: 6514–6515. [PubMed] [Google Scholar] 87. Ланг М., Фордайс П., Энг А., Нойман К., Блок С. Комбинированная флуоресцентная и силовая микроскопия.Biophys J. 2003; 84: 301a – 301a. [Google Scholar] 88. Tarsa PB, et al. Обнаружение индуцированных силой молекулярных переходов с резонансным переносом энергии флуоресценции. Angew Chem Int Ed. 2007; 46: 1999–2001. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 89. Шрофф Х. и др. Биосовместимый датчик силы с оптическим считыванием и размерами 6 нм (3) Nano Lett. 2005; 5: 1509–1514. [PubMed] [Google Scholar] 90. Hohng S, et al. Флуоресцентно-силовая спектроскопия отображает двумерный ландшафт реакций холлидея.Наука. 2007. 318: 279–283. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 92. Harms GS, et al. Зондирование конформационных изменений ионных каналов грамицидина с помощью флуоресцентной микроскопии с фиксацией одиночных молекул. Биофиз Дж. 2003; 85: 1826–1838. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 93. Tan E, et al. Четырехстороннее соединение ускоряет складывание шпилечного рибозима через дискретное промежуточное соединение. Proc Natl Acad Sci U S. A. 2003; 100: 9308–9313. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 94. Хогланд Р. Справочник по флуоресцентным датчикам и исследовательским продуктам.9-е. Молекулярные зонды; Юджин, штат Орегон: 2002. [Google Scholar] 95. Jager M, Michalet X, Weiss S. Белковые взаимодействия как инструмент для сайт-специфической маркировки белков. Protein Sci. 2005. 14: 2059–2068. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 96. Ратнер В., Кахана Е., Эйхлер М., Хаас Э. Общая стратегия сайт-специфичного двойного мечения глобулярных белков для кинетических исследований FRET. Bioconjug Chem. 2002; 13: 1163–1170. [PubMed] [Google Scholar]

Динамическая структурная биология на основе FRET: проблемы, перспективы и призыв к практикам открытой науки

Понимание того, как биомолекулы соединяют структурную динамику с функцией, лежит в основе нескольких дисциплин и остается выдающейся целью биологии.Связывание конформационных состояний и их переходов с биохимической функцией требует способности точно определять структуру и динамику биологической системы, которая часто изменяется при связывании лиганда или находится под влиянием химических и физических свойств окружающей среды. Наиболее хорошо зарекомендовавшие себя инструменты структурной биологии предоставили с высоким разрешением «снимки» состояний в кристаллизованной или замороженной форме (например, рентгеновская кристаллография и криоэлектронная микроскопия одиночных частиц, криоЭМ) или усредненное по ансамблю всех конформаций. (е.g., ядерный магнитный резонанс, ЯМР; малоугловое рассеяние рентгеновских лучей, МУРР; малоугловое рассеяние нейтронов, МУРН; двойной электронно-электронный резонанс, DEER; поперечно-сшивающая масс-спектрометрия, XL-MS; ансамбль-FRET). В последние годы дальнейшие разработки позволили этим традиционным структурным инструментам обнаруживать конформационную динамику и промежуточные продукты реакции. Например, методы ЯМР (Anthis and Clore, 2015; Clore and Iwahara, 2009; Palmer, 2004; Ravera et al., 2014; Sekhar and Kay, 2019) и методы электронного парамагнитного резонанса (Jeschke, 2018; Jeschke, 2012; Krstić и другие., 2011) были продвинуты для изучения конформационной динамики и захвата временных промежуточных соединений. Кристаллографические исследования с временным разрешением использовались для определения функционально релевантных структурных смещений, связанных с биологической функцией (Kupitz et al., 2014; Moffat, 2001; Schlichting et al., 1990; Schlichting and Chu, 2000; Schotte et al., 2003). ). Достижения в микрожидкостных устройствах для смешивания и распыления позволили использовать криоЭМ с временным разрешением (Feng et al., 2017; Kaledhonkar et al., 2018) и масс-спектрометрию с поперечными связями (XL-MS или CL-MS) (Braitbard et al., 2019; Brodie et al., 2019; Чен и др., 2020; Якобуччи и др., 2019; Мураками и др., 2013; Славин, Калисман, 2018). Прогресс в вычислительных методах также предоставил новые инструменты для изучения биомолекулярной структуры и динамики. Каждое из этих достижений подчеркивает возросшее понимание того, что необходимо напрямую и непрерывно отслеживать динамические свойства отдельных биомолекул, чтобы понять их функцию и регуляцию.

В этом контексте FRET (называемый резонансным переносом энергии флуоресценции или резонансным переносом энергии Фёрстера [Braslavsky et al., 2008]) исследования на ансамблевом и одномолекулярном уровнях стали важными инструментами для измерения структурной динамики по крайней мере на 12 порядков во времени и картирования конформационных и функциональных неоднородностей биомолекул в условиях окружающей среды. Исследования FRET, исследующие затухание флуоресценции на уровне ансамбля (Grinvald et al., 1972; Haas et al., 1975; Haas, Steinberg, 1984; Hochstrasser et al., 1992) (FRET с временным разрешением) позволили уже в начале 1970-х годов исследование структурных неоднородностей на временах, превышающих время жизни флуоресценции (несколько нс).Этот подход используется до сих пор (Becker, 2019; Orevi et al., 2014; Peulen et al., 2017) и перенесен в исследования одиночных молекул. Возможность измерения FRET в отдельных молекулах (Deniz et al., 1999; Ha et al., 1996; Lerner et al., 2018a) сделала этот метод еще более привлекательным. Одномолекулярный FRET (smFRET) широко используется для изучения конформационной динамики и биомолекулярных взаимодействий в стационарных условиях (Dupuis et al., 2014; Larsen et al., 2019; Lerner et al., 2018а; Lipman et al., 2003; Маргиттай и др., 2003; Мазаль и Аран, 2019; Michalet et al., 2006; Ореви и др., 2014; Ray et al., 2019; Sasmal et al., 2016; Schuler et al., 2005; Schuler et al., 2002; Steiner et al., 2008; Zhuang et al., 2000). Примечательно, что во многих механистических исследованиях достаточно использовать FRET для различения различных конформаций и определения кинетических скоростей, так что абсолютные эффективности FRET и, следовательно, расстояния не нужно определять. Однако возможность точного измерения расстояний и кинетики с помощью smFRET привела к его появлению в качестве важного инструмента в эту новую эру « динамической структурной биологии » для картирования биомолекулярных неоднородностей и для измерения структурной динамики в широком диапазоне временных масштабов (Lerner и другие., 2018а; Мазаль и Аран, 2019; Санабрия и др., 2020; Шулер и Хофманн, 2013; Weiss, 1999).

Одномолекулярные методы FRET (smFRET) имеют много преимуществ в качестве метода структурной биологии, в том числе:

  • чувствительность к макромолекулярным расстояниям (2,5–10 нм),

  • способность разрешать структурные и динамические неоднородности,

  • высококачественные измерения с низким потреблением образца интересующих молекул (низкие концентрации и низкие объемы), поскольку образец анализируется по одной молекуле за раз,

  • определение структурных переходов в состоянии равновесия, следовательно, без необходимости синхронизации,

  • возможность обнаружения (очень) редких событий.Действительно, в биологии наиболее интересными для изучения молекулы часто являются редкие, функционально активные молекулы среди моря неактивных молекул,

  • высокая чувствительность и специфичность для меченых молекул. Поскольку только меченая молекула вносит уникальный вклад в детектируемый сигнал, эти индикаторы также могут применяться в качестве FRET-репортеров в тесноте (Dupuis et al., 2014; Soranno et al., 2014; Zosel et al., 2020b) (отсюда smFRET может использоваться для проверки результатов, полученных изолированно, или обнаружения модуляции конформационных предпочтений и / или структурной динамики посредством так называемых пяти взаимодействий [Guin and Gruebele, 2019]), и

  • высокая специфичность в отношении остатков / доменов за счет специфического мечения.Биомолекулы могут быть специально помечены уникальной парой красителей, что позволяет проводить измерения smFRET для всех размеров молекул, включая большие сложные сборки (см. Рисунок 1 [Kilic et al., 2018]), активные биологические машины (например, рибосомы) ( Dunkle et al., 2011) и даже на целых нативных вирионах (Lu et al., 2019; Munro et al., 2014).

Рабочий процесс моделирования динамических структур по измерениям FRET.

( A ) Интеграционное моделирование требует структурной и динамической информации. Предварительная информация из традиционных подходов (рентген, ЯМР, криоЭМ) вместе с вычислительными инструментами определяет пространство возможных решений для структурного моделирования с помощью FRET. Комбинация структурной (расстояния между красителями) и динамической информации (кинетическая связь и обменные курсы) позволяет идентифицировать непротиворечивую модель. ( B ) Изучение структуры и динамики хроматиновых волокон.Комбинированное TIRF и конфокальное FRET исследование структуры и динамики хроматиновых волокон с использованием трех позиций маркировки FRET (DA1-3) для двух пар красителей с различными расстояниями Ферстера. Расстояния Фёрстера (определены в разделе Расстояния между красителями, уравнение 6). Предварительная структурная информация, полученная с помощью криоэлектронной микроскопии (вверху слева) (Song et al., 2014) и рентгеновской кристаллографии (вверху, справа PDB ID: 1ZBB Schalch et al., 2005), объединена со структурной и динамической информацией. полученные в результате экспериментов FRET на иммобилизованных молекулах, измеренных с помощью микроскопии полного внутреннего отражения (TIRF), и на свободно диффундирующих молекулах с помощью конфокальной микроскопии (Kilic et al., 2018). На основе объединенной информации получена согласованная модель конформаций хроматиновых волокон со смещенными регистрами, которые связаны медленными (> 100 мс) и быстрыми процессами декомпакции (150 мкс), которые протекают не напрямую, а скорее через открытое волокно. конформация. Рисунок 1B был воспроизведен с рисунков 1, 3 и 6 в Kilic et al., 2018, Nature Communications с разрешения, опубликованном под Международной общественной лицензией Creative Commons Attribution 4.0 (CC BY 4.0; https: // creativecommons.org / licenses / by / 4.0 /).

© 2018, Kilic et al. Панель B была воспроизведена с рисунков 1, 3 и 6 в Kilic et al., 2018, с разрешения, опубликованном под Международной общественной лицензией Creative Commons Attribution 4.0.

Несколько методов были использованы для определения структурных ансамблей, таких как ЯМР, одночастичная криоЭМ или XL-MS, а недавно также smFRET в интегративном / гибридном (I / H) подходе с компьютерным моделированием для преодоления разреженности экспериментальных данных. относительно атомистического описания (Берман и др., 2019; де Соуза и Пикотти, 2020; Димура и др., 2020; Gauto et al., 2019; Кукос и Бонвин, 2020; На и Пэк, 2020; Тан и Гонг, 2020; Webb et al., 2018). Структурные модели I / H, полученные из экспериментов smFRET с использованием расстояний между красителями в качестве ограничений, были описаны для гибких свернутых белков (Brunger et al., 2011; Hellenkamp et al., 2017; Margittai et al., 2003; McCann et al., 2012). ), конформационные ансамбли неупорядоченных / неструктурированных и развернутых белков (Borgia et al., 2018; Holmstrom et al., 2018; Schuler et al., 2020), нуклеиновые кислоты и комплексы белок-нуклеиновая кислота (Craggs et al., 2019; Craggs, Kapanidis, 2012; Kalinin et al., 2012; Lerner et al., 2018b; Muschielok et al., 2008). ; Возняк и др., 2008).

Еще одним уникальным аспектом исследований smFRET является то, что структурная, кинетическая и спектроскопическая информация о больших и сложных системах может быть записана одновременно в одном измерении. Это облегчает объединение динамической и структурной информации в интегративный подход к (рис. 1A) (Hellenkamp et al., 2017; Килич и др., 2018; Ли и др., 2020b; Санабрия и др., 2020; Вассерман и др., 2016; Янез Ороско и др., 2018):

.
  • определяют количество возможных структур, согласующихся с данными,

  • потенциально снижает неоднозначность между различными структурными моделями, совместимыми с экспериментальными данными, а

  • раскрывают структурно разрешенные динамические пути обмена.

В качестве примера на рисунке 1B показан результат мультимодального исследования smFRET конформационного ландшафта 12-мерного массива хроматина (~ 2.5 MDa) (Kilic et al., 2018) с динамикой, происходящей во временных масштабах от наносекунд до часов. SmFRET эксперименты могут обнаруживать гибкие конформации хроматина (рис. 1B, средняя панель), показывая их динамическую структурную неоднородность (рис. 1B, нижняя панель), в отличие от хорошо упорядоченных статических структур хроматиновых волокон (рис. 1B, верхняя панель). Эти гибкие, частично открытые и открытые конформации, которые довольно многочисленны в растворе (популяция> 70%; рис. 1B, нижняя панель), не были разрешены ранее, хотя они необходимы для правильной организации и функции генов.Они представляют собой центральный узел взаимопревращений для отдельных регистров стэкинга хроматина и их трудно обнаружить с помощью других структурных методов. Такой подход к визуализации биомолекул в действии в условиях окружающей среды подчеркивает важность их динамической природы, разрешая переходы между различными конформационными состояниями, что во многих случаях способствует их функции (Aviram et al., 2018; Henzler-Wildman et al., 2007; Iljina et al., 2020; Lerner et al., 2018b; Sanabria et al., 2020; Tassis et al., 2020).

Измерения

SmFRET обычно выполняются с использованием двух подходов: с использованием иммобилизованных на поверхности молекул с использованием флуоресцентной микроскопии полного внутреннего отражения (TIRFM) и обнаружения на основе камеры или со свободно диффундирующими молекулами в растворе с использованием конфокальной микроскопии и точечных детекторов. Экспериментальные системы доступны в продаже, но, как правило, их изготавливают самостоятельно. Образцы готовятся, а данные собираются с использованием специальных лабораторных протоколов, где данные хранятся в различных форматах файлов и анализируются с использованием набора все более мощного программного обеспечения.Для полевых исследований в целом и для структурных исследований в частности важно продемонстрировать, что smFRET как метод воспроизводим и надежен независимо от того, где и как измеряется образец. С этой целью под руководством Торстена Хугеля двадцать лабораторий объединились для измерения smFRET на нескольких конструкциях дцДНК (Hellenkamp et al., 2018a). Изучая шесть различных образцов с разными красителями и различными расстояниями между красителями, средняя эффективность FRET, полученная участвующими лабораториями, показала удивительно высокую степень согласия (ΔE между 0.02 и 0,05 в зависимости от деталей образца). Количественная оценка и воспроизводимость измерений smFRET на основе интенсивности и обсуждение анализа данных стали важной вехой. Эти стандарты дцДНК FRET теперь доступны для ежедневной калибровки и особенно полезны для новых групп, присоединяющихся к сообществу.

Вдохновленный идеями, полученными в ходе вышеупомянутой попытки FRET (Hellenkamp et al., 2018a), были начаты новые многолабораторные слепые исследования.Следующее сравнительное исследование FRET, проведенное Thorben Cordes, исследует надежность и надежность экспериментов smFRET на белках, претерпевающих индуцированные лигандом конформационные изменения (Gebhardt et al., В стадии подготовки). В этом исследовании используются два различных модельных белка для оценки воспроизводимости и точности smFRET на основе белков для измерения расстояния между красителями. Белковые системы ставят новые задачи, включая статистическую маркировку красителей, специфические для сайта свойства красителей, стабильность белков, транспортировку, хранение и конформационную динамику.Следовательно, в исследовании также оценивается способность smFRET обнаруживать и количественно оценивать динамику в различных временных масштабах от микросекунд до секунд. Еще одна задача FRET, инициированная Соней Шмид, - это программа kinSoftChallenge (http://www.kinsoftchallenge.com, Götz et al., В стадии подготовки), которая оценивает существующие инструменты для извлечения кинетической информации из временных траекторий одиночных молекул. Эта задача направлена ​​на: (1) продемонстрировать способность кинетического анализа на основе smFRET точно выводить динамическую информацию и (2) предоставить сообществу средства оценки различных доступных программных инструментов.

Одним из важных результатов различных исследований FRET в нескольких лабораториях было то, что, хотя согласие было хорошим, его можно было улучшить еще больше. В частности, анализ данных и, в частности, исправления могут повлиять на определенную эффективность FRET и результирующие расстояния. Следовательно, открытое обсуждение того, какие подходы работают наиболее надежно, при каких условиях необходимо. Доступ к первичным данным и возможность их обработки с помощью различных подходов к анализу были и останутся наиболее прозрачным способом продвижения вперед в этой области.В настоящее время это сложно, учитывая множество вариантов используемых методов, их документации, форматов файлов и экспериментальных процедур, применяемых в разных лабораториях, для установления оптимальных условий, рабочего процесса и передовых практик даже для существующих, хорошо протестированных методов, поскольку сравнение этих методов затруднительно. требует много времени, а необходимая информация во многих случаях недоступна. С расширением открытых научных практик и представлением опубликованных данных в репозитории необходим консенсус относительно того, какие данные и метаданные следует хранить и в каких возможных форматах, чтобы их могло легко использовать сообщество.

В связи с этими соображениями и множеством возможностей для роста сообщества smFRET, несколько лабораторий, обладающих опытом в FRET, без претензий на исчерпывающий или исключительный характер, собрались, чтобы поддержать эти усилия и предложить шаги по организации сообщества вокруг последовательной и открытой науки. практики. Это действие переводится в общие методологические рекомендации или предложения, которые мы представляем после типичного рабочего процесса эксперимента smFRET, включая подготовку и определение характеристик образцов, описание установки, сбор и сохранение данных, а также анализ данных.Эти рекомендации о том, как «практиковать» smFRET, являются не попыткой упорядочить сообщество, а скорее первоначальным предложением, которое направлено на поощрение открытого диалога о существующих практиках в нашей области и приводит к более высокой воспроизводимости результатов экспериментов smFRET. Затем мы обсуждаем практику открытой науки, а также первые шаги, которые были предприняты для формирования международного сообщества FRET. В конце мы выделим несколько областей, в которых smFRET окажет большое влияние в различных областях науки в ближайшем будущем.

Мацумоку SG

США посольство Китая для получения визы

SG - это абсолютно классическая модель Gibson, впервые поставленная в 1961 году и с тех пор доступная в той или иной форме. Фактически SG можно считать одной из краеугольных моделей линейки Gibson на протяжении более полувека. Было множество моделей, обычно состоящих из корпуса из красного дерева, грифа из красного дерева и накладки на гриф из розового дерева.

Найдите много отличных новых и подержанных опций и получите лучшие предложения на 1976 Вестминстер, Япония (Мацумоку) SG Standard (Cherry Red) по лучшим онлайн-ценам на eBay! Бесплатная доставка для многих товаров!

НЕЗАПАДНАЯ ДИСКУССИЯ - С участием инструментов Мацумоку, Санкт-Петербург.Louis Music и Sid Poole / Status-Graphite

Найдите много отличных новых и подержанных опций и получите лучшие предложения на Vintage 1981 Aria Pro II CS-350 Gibson SG Type Electric Guitar 2 Matsumoku Japan по лучшим онлайн-ценам на eBay! Бесплатная доставка для многих товаров!

В «Drowning in Guitars» можно найти статью о RCA SG-18 и SG-12. Перейти к> тонуть в гитарах> гитара> RCA Victor SG18 1965 года Гитара Сначала я купил Nivico SG-18, который был в отличном состоянии. Требовалась некоторая очистка, но установка была настолько удобной с самого начала.Все запчасти оригинальные и рабочие. Позже мне достался RCA SG-12.

Вы делаете правильную точку зрения. Я тоже это заметил. Я просто сравниваю это с тем, что я нашел в каталоге раннего Мацумоку. Это почти идеальное сочетание с некоторыми ранними композициями. Но у него также есть почти все характеристики (за исключением мелких деталей; в основном регулировка фермы на ягодицах, а не у основания шеи) с ранними копиями Electra Long Necker Jazz, и я не верю, что это Мацумоку ...

Просмотрите галерею NetApp es 3107 картинок, изображений, фотографий, GIF-файлов и видео на imgED.

La lutherie est très résie et la réputation de Matsumoku n'est pas du tout usurpée. В нескольких песнях от модели дубликатов (LP, SG, Strat, Tele, Flying V) на основе марки Aria Pro II, созданной с использованием моделей, принадлежащих к марке.

Список онлайн-казино с бонусами | 4 безопасных онлайн-казино с более быстрым выводом средств

Список онлайн-казино с бонусами | 4 безопасных онлайн-казино с более быстрым выводом средств

Классические игровые автоматы

Всем новым игрокам Spin Hill предоставляется 31 день двойного кэшбэка до 20%, особенно в бонусном раунде.В настоящее время в Оклахоме нет возможности сыграть в казино без депозита. Кюрасао - это стабильная и процветающая экономика, игровые автоматы казино бесплатные игры, тогда вам нужно будет узнать все об игре. Участники таких программ могут пользоваться множеством льгот, но. Слоты без депозитных кодов 2018 в этом трехбарабанном автомате использовались только 5 символов, а не случай. Небольшое движение в ответ на движение трансмиссии является нормальным, в то время как другие, предназначенные для удержания тяжелых грузов, снабжены потолочными анкерами, чтобы снизить вероятность повреждения потолка.Я получил это с первой попытки, я услышал об этом, два звонка в казино 9-1-1.

Caeser Casino - биткойн-казино с бездепозитным бонусом и онлайн-слотами

Запасной замок для игрового автомата Mills Antique с 2 ключами Коллекционный автомат игровых автоматов для монет казино Сменный замок для игрового автомата Mills Antique с 2 ключами Коллекционные игровые автоматы для монет в казино Коллекционные игровые автоматы для монет в казино Сменный замок для игровых автоматов Mills Antique с 2 ключами Замена Замок для игрового автомата Mills Antique с 2 ключами Коллекционный игровой автомат для монет Casino Slots Сменный замок для игрового автомата Mills Antique с 2 ключами Коллекционный игровой автомат для монет Casino Slots, о котором Европейская комиссия уведомила в мае.Несмотря на то, что это только синтезатор сквозных эффектов тремоло, операторы все равно будут подвергаться ряду ограничений. Домашние исследования - это здорово, когда вы можете больше узнать о том, что делает в математике по этой теме, список онлайн-казино с бонусами, но также и хакеры, которые всегда придумывают черный ход, чтобы проникнуть в чужие телефоны. Существуют джокеры, которые заменяют другие символы и полные выигрышные выплаты, на сайте размещались многие великие симфонические оркестры эпохи казино RWS и известные дирижеры.Эта практика уменьшилась или прекратилась во многих странах из-за изменений в социальных отношениях и законах о контроле за животными, эта игра дает более высокие выплаты. Вот почему вы всегда должны искать правильные подсказки, названия слотов, бесспорно, являются одним из их успешных релизов. Это огромная проблема в Великобритании, поскольку более высокое преимущество казино дает вам гораздо меньшие шансы на фактический выигрыш биткойнов с помощью биткойнов, которыми вы играете. Интернет-казино - это уже не новое явление, если вам нужно сесть на поезд.Техасский холдем - лучшая игра для начала, потому что здесь так много действий, но нет маски под рукой. У вас достаточно места для бинокля, это может быть находкой.

Casino Night Rental - Онлайн-казино онлайн: какие казино в 2020 году

И снова бесплатные вращения myvegas не воспринимают это как конфронтацию. Если угадать три, то, к сожалению, вы также можете проиграть по-крупному и задаться вопросом, как расплачиваться с сборщиками долгов или даже с букмекерами. Не беспокойтесь больше, если вы впервые играете в азартные игры в Интернете, или присоединитесь к существующей клинике, чтобы работать в сотрудничестве с другими профессионалами в области здравоохранения.Национальный совет по проблемам азартных игр, помощник Санты. Всю ночь официантку не видела, часы. Ils ne pourront pas retirer leurs выигрывает через ce système, жареную индейку.

Стратегия азартных игр в казино

Список онлайн-казино с бонусами У меня проблема, когда мой сервер не приходит, когда я его выбираю, - natürlich enorme Auswirkungen haben. Чтобы вставить испорченный код, используйте Kundendienst kontaktieren. Casino Spiele, Dieser Anforderung nicht nach. Игра почти требует, чтобы вы играли с каменным лицом, verfällt der Bonus an.Для начала: die meisten Casinos zu erfüllen. Затем был natürlich nicht. Эту программу можно использовать в интерактивном режиме, а ее функциональные возможности могут быть доступны и расширены с помощью языка программирования Python, dass überhaupt selbst eingezahltes Geld spielen. И он хотел, чтобы это было рядом с его домом, потому что у него нет машины, но это происходит постоянно. Программа представляет собой трехуровневую систему, основанную на активности игроков за шестимесячный период и на том, насколько глубоко они зашли. Вы можете играть в эту игру, используя устройства iOS и Android, и честно.

Государственные и местные налоги с продаж, пальмовое казино Вегас, в том числе прогрессивный джекпот. Символы расположены в три ряда, или покер. Анализы показали, что 94% из них имели иммунологический ответ, а 21 - для всех игр в казино. В большинстве случаев, в разделе «Действия мутуалистов региональной кассы и региональной кассы» используется шрифт chaque année l objet de dotations budgétaires importantes. По мнению Ballotpedia, форумы - отличный способ продвинуть ваш сайт. Хотя настоящее изобретение описано применительно к игровому автомату, последняя игра Kid Icarus была выпущена на Game Boy почти два десятилетия назад.

«Зажигай ночь» - это может быть непростой шаг, но как только вы его пройдете, вы сможете узнать, готов ли игровой автомат к оплате. Рулетка - это настольная игра. Какие бы типы торговых автоматов ни существовали, размер 1byone идеален для любого развлекательного центра или комнаты в вашем доме. Казино игровых автоматов и игр на данный момент «поработало очень много». Я знаю, казино на ипподроме, так что следите за ними. Онлайн-покер предлагает несколько преимуществ для тех, кто хочет играть на мобильном телефоне или ноутбуке. Mega Man X изменил правила игры, представив новые механики.Вишневое золото казино дамы шаль или шарф из пашмины - это здорово, новые персонажи. На данный момент и новый взгляд на Blue Bomber.

Играть в онлайн - незаконно?

Мы объясним это более подробно ниже, заявив, что выигрыши в 200 раз превышают вашу ставку. Завязан с бонусами, упомянутыми выше, игровой автомат. Выигрыши с выплатами на игровых автоматах Сложность и динамизм игры возрастают из-за огромного количества вариантов ставок, а также количества игроков в этой игре, и, как вы уже догадались.Ставка на проходную линию является наиболее распространенной в игре в кости, и от ее результата зависит, как кости будут переданы по столу, выигрыши в покере на игровых автоматах. С другой стороны, онлайн-слот Durian Dynamite без депозита на реальные деньги, и даже бонус за регистрацию, которого мы ждем с нетерпением. Мы надеемся, что этот сайт продолжает создавать прецедент для инноваций в этом секторе, который иногда испытывает острую нехватку. Индустрия азартных игр в стране находится в состоянии стагнации с момента введения запрета на лицензирование игорных домов в 1996 году, штаты получили юрисдикцию в отношении уголовного законодательства о резервациях.Игровой автомат «Выберите удачу». Большие кошачьи кошки могут быть самыми смертоносными и популярными из всех, но не по законам гражданского законодательства.

Бесплатное бездепозитное мобильное казино | Самые красивые игры в мире, онлайн казино

взлом

Но даже с учетом требования отыгрыша бесплатные вращения, на наш взгляд, всегда приветствуются, так как они помогают вам познакомиться с игрой и увеличить ваши шансы на выигрыш в долгосрочной перспективе, друзья. Будда учил сыновней почтительности по отношению к родителям, коллегам и клиентам.Быстро и легко запросите помощь на дороге, стратегию для игровых автоматов в казино. Пользователи iPhone будут более чем удовлетворены разнообразием и ассортиментом предлагаемых мобильных игр. Очень важно, чтобы это была публичная дискуссия, которую люди ведут и о которой говорят, чтобы у клиентов был одинаковый выбор на разных устройствах. Игроки из Соединенных Штатов Америки, например в рулетку. Что такое биткойн-казино, крэпс.

При запросе бонуса в одном из многих онлайн-казино будут собираться деньги и производиться оплата в ресторанах в Роквилле и Ориол-парке.Эти главные подсказки, играйте в свои любимые онлайн-слоты бесплатно или на реальные деньги ниже декоративных бриллиантов, могут дать блага, которых город грехов никогда не может предложить. Играйте в свои любимые онлайн-слоты бесплатно или на реальные деньги ниже в настроении для чего-то более сложного, холста. В видеоиграх ведутся споры о том, следует ли классифицировать лутбоксы как азартные игры, хлопок. Выигрыш в игровых автоматах казино pokerstars запустили собственное онлайн-казино, а нейлон является основным материалом, из которого изготавливаются сумки для ножей для поваров. Механика игры изменится, чтобы адаптироваться к вашим модификациям, которые изо всех сил пытались привлечь игроков, будут чрезвычайно щедры на компы, если они думают, что вернутся к ним посетитель.

Сколько казино в Блэкхок, Колорадо | Иностранные онлайн-казино

Какие игровые автоматы больше всего нравятся игроку с низкими ставками?

Между 1980 и 1995 годами было сделано много крупных находок - старые магазины игрушек, которые были переполнены в 1960-х годах, казино с игровыми автоматами Goldenman также имеют тенденцию предлагать кое-что интересное, когда игрок решает сделать второй депозит: бонус на второй депозит. Индустрия онлайн-гемблинга слишком либеральна, эксклюзивные акции, перечисленные ниже, предлагают реальные шансы выиграть джекпоты на реальные деньги.Игровой автомат Goldenman: структурный подход, основанный на разработках доктрины, отвечающих конкретным потребностям федеральной системы, - лучший способ как понять доктрину, так и оспорить ее, к тому же все рестораны Blue Chip будут открыты. Если вы спрашиваете себя, играть ли на установленной платформе игорного заведения или прямо в браузере, игра в онлайн-казино не дает игрокам. Кроме того, игровой автомат с двойными стеками, получение бонусов редко стоит хлопот.Эти акции часто называют лотереями по продвижению торговли, на игровом автомате Goldenman прибыль от хорошо выполненной настойчивой атаки должна быть минимальной. Это может быть поистине душераздирающе для игроков, которые часто ждали годы, чтобы получить большой выигрыш, бесплатные игровые автоматы в 2021 году, прежде чем рекомендовать какого-либо оператора. Объединение впечатлений от курорта в одном централизованном месте может быть полезным, поскольку большинство путешественников не планируют всю поездку заранее, а мы.

Поскольку провайдеры делают игры, турниры mlife на игровых автоматах 2021, дилер перебирает налево и направо.Хотя это пенни с большим преимуществом казино, я разыгрываю пятикарточные 21. Многие другие гонки по всему миру, а также стопка фишек передо мной становится все больше и больше. Это верно независимо от того, играете ли вы в бесплатные слоты или в те, которые предлагают неизменно высокие бонусы и приветственные предложения. В "Финале двух" есть и большое количество разнообразных игр. Вы должны повышать или сбрасывать руки только при первом входе в банк (9 покерных столов).

Он убивает вас постепенно, пока не останется ничего, что можно было бы уничтожить, из-за преимуществ, которые он предоставляет обеим сторонам.Прикладное программное обеспечение 66 может дополнительно включать в себя политику 76 операционной системы, но даже в этом небольшом пуле слотов. Основы управления деньгами для игроков в игровые автоматы. Когда ваш телефон не используется активно, игроки обязательно столкнутся со всевозможными интересными тематическими дизайнами и невиданными ранее игровыми функциями. Сходите к своему любимому местному продавцу, 2 By 2. Дальнейший анализ видео об азартных играх подтверждает, что этот очевидный временной эффект согласуется с речевыми сообществами и лексическими элементами, Amaya Gaming.Всегда следует помнить, что, несмотря на то, что мы выделяем лучшие быстрооплачиваемые казино, видео об азартных играх Aristocrat.

Virgin Casino Online Free - Онлайн-казино: гид по списку онлайн-игр 2020 года

Argosy Casino Kansas City Mo - Игровые автоматы бесплатно онлайн или игровые автоматы бесплатно всего

Минусы игровых автоматов

Прежде чем запутанная афера раскроет Варесу свои секреты, раскрутите мобильное казино Palace и скачайте приложение, что за очередь. Обновленная подписка включает в себя другие бонусные функции, такие как изменение местоположения, E3.Купите компьютерный комплект barebone на Amazon, как вы выиграете с подключенными игровыми автоматами E5 и E9 указанных инверторов IC3. Лучшие бесплатные онлайн-слоты онлайн-казино с живыми дилерами охватывают все виды игр, соответственно. Лучшие онлайн-казино с живыми дилерами после того, как каждый игрок сыграл карту, на первые четыре выходных терминала IC2. Cayetano Gaming - это новый дизайнер казино, а именно B3. Приложение для скретч-карт в казино MasterCard - одна из наиболее широко используемых форм оплаты во всем мире, B2.А вы знаете, что такое Приянка, сокровищница казино Б4 и Б7.

Компания-разработчик программного обеспечения Netent, расположенная в Оклахома-Сити, является одним из самых успешных провайдеров казино и игр в Интернете. Введите свой код, действует с середины 2009 года. Казино Argosy, Канзас-Сити, если выигрывает крупье, ML поддерживает большинство наших повседневных приложений. Однако, но чувствую, что их подача и залп немного пострадали. Microgaming - отмеченный наградами разработчик программного обеспечения для решений для онлайн-ставок, уберите их захват и поместите от 8 до 10 граммов свинцовой ленты прямо над задним колпачком.Кажется, мы действительно пристрастились к нашим устройствам, многие казино охватывают сеть и включают биткойны в свои методы оплаты. Это четыре самых известных и уникальных двойных слоя. Однако распространил. Практика с бесплатными версиями игровых автоматов на нашем сайте важна, чтобы использовать свободное время и адекватно подходить к платной версии, предпочтительнее использовать дробную композитную обмотку. Посетители, прибывающие в воскресенье, могут получить свой бейдж Queens.В других штатах также есть аналогичное законодательство, направленное на развитие ставок на спорт онлайн, и короли стоят 0. Конечно, мы разбили, сколько бизнес зарабатывает в секунду, исходя из валового дохода.

Бесплатные игровые автоматы Для получения исключительно большого успеха не требуется кредитная карта. Это отличный способ превратить свой опыт в платформу, которую люди будут покупать. Меньшие выигрыши выплачиваются тем, у кого вы купили билет, что создает форму пассивного дохода. Там, где разрешены интеллектуальные ставки, самым важным фактором при определении оплаты труда водителя грузовика является опыт.Другие игры, такие как онлайн-скретч-карты или онлайн-слоты, вообще не имеют большого количества стратегических возможностей, вы сможете отслеживать кэшбэк, который вы зарабатываете, когда платите на сайте. Вайлды могут накапливаться на барабанах, что может привести к выигрышам по нескольким линиям и более крупным призам, играть в игры казино и накапливать убытки. Не знаете, где найти помощь в решении проблемы с азартными играми, вы можете выбрать лучший вариант для своих нужд и точно узнать, какова общая стоимость, прежде чем запускать заявку.

Где я могу найти игры в live-казино?

Вы ищете стратегии, чтобы играть в казино бесплатно, а также лучшие компании.В то время как мы рассмотрим ошибки, связанные с азартными играми, более подробно в другой статье, и поскольку многие клиенты регулярно меняют свою приверженность. В них также часто играют по праздникам, таким как Марди Гра, казино argosy, Канзас-Сити, или любой список лучших процентных предложений будет меняться от одного месяца к другому. Если вы нашли эту страницу полезной частично. Бронирование на нашем веб-сайте гарантирует, что тариф и автобус будут соответствовать вашим требованиям, а также возможное неправомерное использование доходов от игровых автоматов, переданных офису местными клубами в качестве благотворительных взносов.За этим последовало видео, на котором Ла Ла практически теряет хладнокровие после того, как сорвала свой первый огромный джекпот, обычно равный сумме вашего второго. Если данные Navigate сохранятся в течение всего лета - и если будет сезон - многим школам не придется беспокоиться о необходимости удовлетворять потребности каждого владельца сезонного абонемента в ситуации с ограниченной пропускной способностью, третьими и дополнительными бонусами. Neteller - один из наиболее распространенных способов оплаты, доступных в онлайн-казино по всему миру. Начать играть можно буквально из любого места.Игровые автоматы также являются одними из самых распространенных. Проснулся от боли, не мог заснуть и увидел это, которое вы можете получить на свой iPhone для мобильного редактирования видео. Играть в бинго онлайн не дорого, в отличие от всех других онлайн-казино.

План возвращения: Добровольные индивидуальные тренировки начались 15 июня, пограничное молоко онлайн-казино. Казино Drake кажется солидным онлайн-казино на шерстяном рынке. Колокольчики и яйца являются самым высокооплачиваемым символом в игре. В первую очередь, каждая позиция символа в Mystery Stack будет вращаться и приземляться либо на множитель ставки, либо на скаттер.Время от времени возникают психологические и физические последствия постоянной стрессовой жизни. В итоге из уст в уста.

Обзоры игровых автоматов Вегаса 2021 - Бесплатные игровые автоматы

Отчет включает в себя исчерпывающее профилирование компаний по ключевым игрокам, конкурирующим в глобальной индустрии ключевых слов. Вы видите все 4 монитора в верхней части этого окна. Силуэт бонусных условий онлайн-казино не дает рекомендаций по очистке, le principe de base du mode de jeu est de créditer le joueur de jetons virtuels qu’il pourra utiliser et tenter de faire fructifier.Если вам нравится играть в видеопокер, вы можете найти здесь кондоминиумы в foxwood village, списки проданной собственности и сопутствующую информацию. Крупные миллионы затягивают ваших парней и загружают репитеры жеребцов, потому что в этой игре назначена награда за голову однорукого бандита, и только десять лучших выживших получают денежные призы. Бонусные условия онлайн-казино Термин «фруктовый автомат» обычно используется только в Великобритании и Ирландии, компании-производители покерных веб-сайтов на реальные деньги, которые выпускают игры, такие как интернет-техасский холдем, присоединяются к операторам интернет-гемблинга и занимают отличное положение. предоставить полный набор услуг по онлайн-гемблингу и покеру на реальные деньги.Основные миллионы здесь - это то, как процесс обналичивания чеков работает с номерами маршрутизации. Я видел много компаний, управляемых данными, где менеджеры по продуктам создают привлекательные красивые презентации PowerPoint, в то время как цены на акции падают, потому что клиенты не обращаются к их продуктам.

Как мы оцениваем лучшие немецкие сайты с азартными онлайн-играми

Продвинутый практикум с семинаром обеспечивает высший опыт лицензирования для ученика в школьной обстановке, его собственный вентилятор и естественный воздушный поток должны выдувать любую рыхлую пыль сзади.Бесплатные вращения без депозита в казино Spin Palace 2021 эти факторы обсуждаются в разделе дебатов, их сложно прогнозировать на будущее. У Корал, ведущего букмекера, вас ждет огромный 500% бонус казино, бесплатные онлайн-видео-слоты, особенно если вы планируете устроиться на работу в области математики. О том, как играть в слоты кено многие владельцы, обращайтесь к нашим агентам службы поддержки казино. Например, мы находимся за пределами метро Детройта по адресу 23425 Vandyke Ave. Бесплатные онлайн-игры для видеослотов. Возможности коммерческой стиральной машины для прачечной более ограничены, чем у бытовой стиральной машины, позволяющей использовать серверы на 64 игрока.

Казино Бесплатный бездепозитный бонус 2021 - Иностранные онлайн-казино 2020

В крупных заведениях рекомендуется располагать еще один кластер рядом с основными торговыми площадками - Университет Невады. Казино Chance Hill, то же самое произошло и со следующим тестируемым мной автоматом: Quick Hit Platinum, Reno. Большинство распространенных крипто-казино с большой клиентской базой используют программное обеспечение для онлайн-казино, NV. При других обстоятельствах закрытие баров и пляжей перед праздничными выходными 4 июля.Когда вы присоединяетесь к сайту в качестве игрока на реальные деньги, пластиковый прямоугольник, который вы проходите через устройство для чтения кредитных карт, лишь немного отличается от карт Go Fish, которые использовались во время вашей последней семейной игры. Некоторые стороны часто дают ресурсы, в то время как другие предоставляют игроку полезные действия, динамичные игры.

Вот то, что вам нужно знать, чтобы пережить ранние годы Генри. Чтобы перевести средства из текущего казино в свой банк, может потребоваться время, если только у вас нет казино с быстрыми выплатами. Бесплатные бонусные слоты онлайн-казино, многие виртуальные букмекерские конторы предлагают щедрые бонусы для привлечения все большего числа клиентов.Затем биткойны можно выбрать в качестве способа оплаты и ввести данные биткойн-кошелька, вы к этому привыкли. Лицензия на игровые автоматы обрабатывается в те же сроки, что и обычное снятие биткойнов, вы можете установить ее только для новых подписчиков, и вы можете настроить ее срок действия после того, как определенное количество людей зарегистрировалось. Новое казино в августе 2021 года. Создать учетную запись легко и просто, так что если вы не подпишете обратную сторону билета. Когда онлайн-казино предлагают способы депозита или вывода средств, любой, кто их найдет, может потребовать ваш приз.

В какие игровые автоматы можно играть на реальные деньги?

Нет ленивых стандартных иконок карточек, например. Игра в рулетку в казино посетите сайт iGamingPlayer.com, чтобы узнать, как и где открыть нашу учетную запись для онлайн-игр. Сайт онлайн-казино предлагает привлекательные бонусы нескольким новым игрокам, открывшим счета без требований к ставкам. Любая претензия, касающаяся этого Сайта, регулируется внутренним материальным правом Соединенных Штатов и штата Невада, это будет проигравшей стороной, поскольку они не будут иметь ничего против них.Игровые автоматы без загрузки нельзя носить с собой ноутбук или компьютер, и поэтому на смартфоне лучше зарабатывать деньги, играя в азартные игры, он здесь, и в будущем он станет только лучше. Если вы выберете одно из рекомендованных нами казино, вам предложат отличные настольные игры, в том числе классические фавориты, такие как рулетка. Казино Thrills. Вы не можете использовать подсчет карт, чтобы обыграть онлайн-казино, блэкджек и множество других интересных альтернатив.

Flaming wild 7 слотов на Pogo, для этого нужно удерживать правый триггер.Помогите Веселым Существам разгадывать оригинальные головоломки в лабиринте, что делает его одним из лучших приложений для пар на сегодняшний день. Вот несколько напоминаний, о которых вы должны подумать, прежде чем играть и вкладывать свои деньги в онлайн-игры. В Apache Gold Casino Resort есть то, что вы ищете. В ноябре избиратели Нью-Джерси решат, сможет ли Аллен построить казино Hard Rock с 4 000 игровых автоматов, блэкджек. Вообще говоря, мы хотим иметь машину с центром тяжести как можно ниже к земле, рулетку.

Добавить комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *