Где производят лада х рей: АвтоВАЗ не собирается «убивать» Lada Xray — Российская газета

LADA XRAY 2021 года: фото, цены, комплектации, характеристики

• Подушка безопасности водителя
• Подушка безопасности переднего пассажира с функцией отключения
• Подголовники задних сидений 2 шт.
• Крепления для детских сидений ISOFIX
• Блокировка задних дверей от открывания детьми
• Автоматическое запирание дверей при начале движения
• Автоматическое включение аварийной сигнализации при экстренном торможении
• Автоматическое отпирание дверей и включение аварийной сигнализации при столкновении
• Иммобилайзер
• LED-дневные ходовые огни
• Система экстренного оповещения ЭРА-ГЛОНАСС
• Антиблокировочная система с электронным распределением тормозных сил (ABS, EBD)
• Система вспомогательного торможения (BAS)
• Система электронного контроля устойчивости (ESC) с функцией отключения
• Противобуксовочная система (TCS)
• Система помощи при трогании на подъеме (HSА)
• Защита двигателя и подкапотного пространства

• Бортовой компьютер
• Подсказчик переключения передач в комбинации приборов

• Заднее сиденье с раскладной спинкой в пропорции 60/40
• Панель приборов. Цвет черный
• Обивка сидений ткань. Цвет черный
• Розетка 12V на центральной консоли

• Усилитель рулевого управления
• Регулируемая по высоте рулевая колонка
• Регулировка ремней безопасности передних сидений по высоте
• Воздушный фильтр салона
• Легкая тонировка стекол
• Складной ключ
• Центральный замок с дистанционным управлением
• Электростеклоподъемники передних дверей
• Аудиоподготовка

• Наружные зеркала с боковыми указателями поворота в цвет кузова
• 15» стальные диски
• Колпаки колес декоративные
• Запасное стальное колесо временного использования 15»

• Подушка безопасности водителя
• Подушка безопасности переднего пассажира с функцией отключения
• Подголовники задних сидений 2 шт.
• Крепления для детских сидений ISOFIX

• Блокировка задних дверей от открывания детьми
• Автоматическое запирание дверей при начале движения
• Автоматическое включение аварийной сигнализации при экстренном торможении
• Автоматическое отпирание дверей и включение аварийной сигнализации при столкновении
• Иммобилайзер
• LED-дневные ходовые огни
• Система экстренного оповещения ЭРА-ГЛОНАСС
• Антиблокировочная система с электронным распределением тормозных сил (ABS, EBD)
• Система вспомогательного торможения (BAS)
• Система электронного контроля устойчивости (ESC) с функцией отключения
• Противобуксовочная система (TCS)
• Система помощи при трогании на подъеме (HSА)
• Защита двигателя и подкапотного пространства

• Бортовой компьютер
• Подсказчик переключения передач в комбинации приборов
• Заднее сиденье с раскладной спинкой в пропорции 60/40
• Панель приборов.

Цвет черный
• Обивка сидений ткань. Цвет черный
• Розетка 12V на центральной консоли

• Усилитель рулевого управления
• Регулируемая по высоте рулевая колонка
• Регулировка ремней безопасности передних сидений по высоте
• Воздушный фильтр салона
• Легкая тонировка стекол
• Складной ключ
• Центральный замок с дистанционным управлением
• Электростеклоподъемники передних дверей
• Кондиционер
• Охлаждаемый вещевой ящик
• Аудиоподготовка

• Наружные зеркала с боковыми указателями поворота в цвет кузова
• 15» стальные диски
• Колпаки колес декоративные
• Запасное стальное колесо временного использования 15»

• Подушка безопасности водителя
• Подушка безопасности переднего пассажира с функцией отключения
• Подголовники задних сидений 2 шт.
• Крепления для детских сидений ISOFIX
• Блокировка задних дверей от открывания детьми
• Автоматическое запирание дверей при начале движения

• Автоматическое включение аварийной сигнализации при экстренном торможении
• Автоматическое отпирание дверей и включение аварийной сигнализации при столкновении
• Иммобилайзер
• LED-дневные ходовые огни
• Система экстренного оповещения ЭРА-ГЛОНАСС
• Антиблокировочная система с электронным распределением тормозных сил (ABS, EBD)
• Система вспомогательного торможения (BAS)
• Система электронного контроля устойчивости (ESC) с функцией отключения
• Противобуксовочная система (TCS)
• Система помощи при трогании на подъеме (HSА)
• Защита двигателя и подкапотного пространства

• Бортовой компьютер
• Подсказчик переключения передач в комбинации приборов
• Заднее сиденье с раскладной спинкой в пропорции 60/40
• Панель приборов. Цвет черный

• Обивка сидений ткань. Цвет черный
• Противосолнечный козырек пассажира с зеркалом
• Розетка 12V на центральной консоли

• Усилитель рулевого управления
• Регулируемая по высоте рулевая колонка
• Регулировка ремней безопасности передних сидений по высоте
• Сиденье водителя с регулировкой по высоте
• Воздушный фильтр салона
• Легкая тонировка стекол
• Складной ключ
• Центральный замок с дистанционным управлением
• Электростеклоподъемники передних дверей
• Электростеклоподъемники задних дверей
• Подогрев передних сидений
• Электропривод и обогрев наружных зеркал
• Кондиционер
• Охлаждаемый вещевой ящик
• Мультифункциональное рулевое колесо
• Аудиосистема (2DIN, FM/AM с функцией RDS, USB, AUX, Bluetooth, Hands free), 4 динамика

• Наружные зеркала с боковыми указателями поворота в цвет кузова
• Наружные ручки дверей в цвет кузова
• 15» стальные диски
• Колпаки колес декоративные

• Запасное стальное колесо временного использования 15»

• Подушка безопасности водителя
• Подушка безопасности переднего пассажира с функцией отключения
• Подголовники задних сидений 2 шт.
• Крепления для детских сидений ISOFIX
• Блокировка задних дверей от открывания детьми
• Автоматическое запирание дверей при начале движения
• Автоматическое включение аварийной сигнализации при экстренном торможении
• Автоматическое отпирание дверей и включение аварийной сигнализации при столкновении
• Иммобилайзер
• LED-дневные ходовые огни
• Система экстренного оповещения ЭРА-ГЛОНАСС
• Антиблокировочная система с электронным распределением тормозных сил (ABS, EBD)
• Система вспомогательного торможения (BAS)
• Система электронного контроля устойчивости (ESC) с функцией отключения
• Противобуксовочная система (TCS)
• Система помощи при трогании на подъеме (HSА)

• Защита двигателя и подкапотного пространства

• Бортовой компьютер
• Подсказчик переключения передач в комбинации приборов
• Заднее сиденье с раскладной спинкой в пропорции 60/40
• Панель приборов. Цвет черный
• Обивка сидений ткань. Цвет черный
• Противосолнечный козырек пассажира с зеркалом
• Розетка 12V на центральной консоли

• Усилитель рулевого управления
• Регулируемая по высоте рулевая колонка
• Регулировка ремней безопасности передних сидений по высоте
• Сиденье водителя с регулировкой по высоте
• Воздушный фильтр салона
• Легкая тонировка стекол
• Усиленная тонировка задних стекол
• Складной ключ
• Центральный замок с дистанционным управлением
• Электростеклоподъемники передних дверей
• Электростеклоподъемники задних дверей
• Подогрев передних сидений
• Электропривод и обогрев наружных зеркал
• Обогрев ветрового стекла
• Датчики парковки задние

• Датчики дождя и света
• Климат-контроль
• Охлаждаемый вещевой ящик
• Мультифункциональное рулевое колесо
• Аудиосистема (2DIN, FM/AM с функцией RDS, USB, AUX, Bluetooth, Hands free), 4 динамика

• Наружные зеркала с боковыми указателями поворота черного цвета
• Наружные ручки дверей в цвет кузова
• 16» легкосплавные диски оригинальные
• Запасное стальное колесо временного использования 15»

• Подушка безопасности водителя
• Подушка безопасности переднего пассажира с функцией отключения
• Подголовники задних сидений 3 шт.
• Крепления для детских сидений ISOFIX
• Блокировка задних дверей от открывания детьми
• Автоматическое запирание дверей при начале движения
• Автоматическое включение аварийной сигнализации при экстренном торможении
• Автоматическое отпирание дверей и включение аварийной сигнализации при столкновении

• Иммобилайзер
• LED-дневные ходовые огни
• Противотуманные фары
• Система экстренного оповещения ЭРА-ГЛОНАСС
• Антиблокировочная система с электронным распределением тормозных сил (ABS, EBD)
• Система вспомогательного торможения (BAS)
• Система электронного контроля устойчивости (ESC) с функцией отключения
• Противобуксовочная система (TCS)
• Система помощи при трогании на подъеме (HSА)
• Защита двигателя и подкапотного пространства

• Бортовой компьютер
• Подсказчик переключения передач в комбинации приборов
• Заднее сиденье с раскладной спинкой в пропорции 60/40
• Панель приборов. Цвет (по выбору) черный/коричневый
• Обивка сидений комбинированная ткань/экокожа. Цвет (по выбору) черный/коричневый
• Противосолнечный козырек пассажира с зеркалом
• Розетка 12V на центральной консоли
• Подсветка мест входа-выхода в передних дверях

• Усилитель рулевого управления

• Регулируемая по высоте рулевая колонка
• Регулировка ремней безопасности передних сидений по высоте
• Сиденье водителя с регулировкой по высоте
• Воздушный фильтр салона
• Легкая тонировка стекол
• Складной ключ
• Центральный замок с дистанционным управлением
• Электростеклоподъемники передних дверей
• Электростеклоподъемники задних дверей
• Подогрев передних сидений
• Электропривод и обогрев наружных зеркал
• Обогрев ветрового стекла
• Датчики парковки задние
• Датчики дождя и света
• Климат-контроль
• Охлаждаемый вещевой ящик
• Мультифункциональное рулевое колесо
• Аудиосистема (2DIN, FM/AM с функцией RDS, USB, AUX, Bluetooth, Hands free), 4 динамика

• Наружные зеркала с боковыми указателями поворота в цвет кузова
• Наружные ручки дверей в цвет кузова
• 16» легкосплавные диски
• Запасное стальное колесо временного использования 15»

• Подушка безопасности водителя

• Подушка безопасности переднего пассажира с функцией отключения
• Подголовники задних сидений 3 шт.
• Крепления для детских сидений ISOFIX
• Блокировка задних дверей от открывания детьми
• Автоматическое запирание дверей при начале движения
• Автоматическое включение аварийной сигнализации при экстренном торможении
• Автоматическое отпирание дверей и включение аварийной сигнализации при столкновении
• Иммобилайзер
• LED-дневные ходовые огни
• Противотуманные фары
• Система экстренного оповещения ЭРА-ГЛОНАСС
• Антиблокировочная система с электронным распределением тормозных сил (ABS, EBD)
• Система вспомогательного торможения (BAS)
• Система электронного контроля устойчивости (ESC) с функцией отключения
• Противобуксовочная система (TCS)
• Система помощи при трогании на подъеме (HSА)
• Защита двигателя и подкапотного пространства

• Бортовой компьютер
• Подсказчик переключения передач в комбинации приборов
• Заднее сиденье с раскладной спинкой в пропорции 60/40
• Панель приборов. Цвет (по выбору) черный/коричневый
• Обивка сидений комбинированная ткань/экокожа. Цвет (по выбору) черный/коричневый
• Противосолнечный козырек пассажира с зеркалом
• Розетка 12V на центральной консоли
• Подсветка мест входа-выхода в передних дверях

• Усилитель рулевого управления
• Регулируемая по высоте рулевая колонка
• Регулировка ремней безопасности передних сидений по высоте
• Сиденье водителя с регулировкой по высоте
• Воздушный фильтр салона
• Легкая тонировка стекол
• Усиленная тонировка задних стекол
• Складной ключ
• Центральный замок с дистанционным управлением
• Электростеклоподъемники передних дверей
• Электростеклоподъемники задних дверей
• Подогрев передних сидений
• Электропривод и обогрев наружных зеркал
• Обогрев ветрового стекла
• Датчики парковки задние
• Kамера заднего вида с динамическими линиями
• Датчики дождя и света
• Климат-контроль
• Охлаждаемый вещевой ящик
• Мультифункциональное рулевое колесо
• Мультимедийная система LADA EnjoY Pro с встроенными сервисами Яндекс. Авто (8’’ TFT-IPS ёмкостный HD дисплей, FM, 2 USB, Bluetooth, голосовое управление, Hands Free со сдвоенным микрофоном и функцией шумоподавления, Apple CarPlay, Android Auto), 6 динамиков

• Наружные зеркала с боковыми указателями поворота в цвет кузова
• Наружные ручки дверей в цвет кузова
• 16» легкосплавные диски
• Запасное стальное колесо временного использования 15»

• Подушка безопасности водителя
• Подушка безопасности переднего пассажира с функцией отключения
• Подголовники задних сидений 2 шт.
• Крепления для детских сидений ISOFIX
• Блокировка задних дверей от открывания детьми
• Автоматическое запирание дверей при начале движения
• Автоматическое включение аварийной сигнализации при экстренном торможении
• Автоматическое отпирание дверей и включение аварийной сигнализации при столкновении
• Иммобилайзер
• LED-дневные ходовые огни
• Система экстренного оповещения ЭРА-ГЛОНАСС
• Антиблокировочная система с электронным распределением тормозных сил (ABS, EBD)
• Система вспомогательного торможения (BAS)
• Система электронного контроля устойчивости (ESC) с функцией отключения
• Противобуксовочная система (TCS)
• Система помощи при трогании на подъеме (HSА)
• Защита двигателя и подкапотного пространства

• Бортовой компьютер
• Подсказчик переключения передач в комбинации приборов
• Заднее сиденье с раскладной спинкой в пропорции 60/40
• Панель приборов. Цвет черный
• Обивка сидений ткань. Цвет черный
• Противосолнечный козырек пассажира с зеркалом
• Розетка 12V на центральной консоли

• Усилитель рулевого управления
• Регулируемая по высоте рулевая колонка
• Регулировка ремней безопасности передних сидений по высоте
• Сиденье водителя с регулировкой по высоте
• Воздушный фильтр салона
• Легкая тонировка стекол
• Складной ключ
• Центральный замок с дистанционным управлением
• Электростеклоподъемники передних дверей
• Электростеклоподъемники задних дверей
• Подогрев передних сидений
• Электропривод и обогрев наружных зеркал
• Кондиционер
• Охлаждаемый вещевой ящик
• Мультифункциональное рулевое колесо
• Аудиосистема (2DIN, FM/AM с функцией RDS, USB, AUX, Bluetooth, Hands free), 4 динамика

• Наружные зеркала с боковыми указателями поворота в цвет кузова
• Наружные ручки дверей в цвет кузова
• 15» стальные диски
• Колпаки колес декоративные
• Запасное стальное колесо временного использования 15»

• Подушка безопасности водителя
• Подушка безопасности переднего пассажира с функцией отключения
• Подголовники задних сидений 2 шт.
• Крепления для детских сидений ISOFIX
• Блокировка задних дверей от открывания детьми
• Автоматическое запирание дверей при начале движения
• Автоматическое включение аварийной сигнализации при экстренном торможении
• Автоматическое отпирание дверей и включение аварийной сигнализации при столкновении
• Иммобилайзер
• LED-дневные ходовые огни
• Система экстренного оповещения ЭРА-ГЛОНАСС
• Антиблокировочная система с электронным распределением тормозных сил (ABS, EBD)
• Система вспомогательного торможения (BAS)
• Система электронного контроля устойчивости (ESC) с функцией отключения
• Противобуксовочная система (TCS)
• Система помощи при трогании на подъеме (HSА)
• Защита двигателя и подкапотного пространства

• Бортовой компьютер
• Подсказчик переключения передач в комбинации приборов
• Заднее сиденье с раскладной спинкой в пропорции 60/40
• Панель приборов. Цвет черный
• Обивка сидений ткань. Цвет черный
• Противосолнечный козырек пассажира с зеркалом
• Розетка 12V на центральной консоли

• Усилитель рулевого управления
• Регулируемая по высоте рулевая колонка
• Регулировка ремней безопасности передних сидений по высоте
• Сиденье водителя с регулировкой по высоте
• Воздушный фильтр салона
• Легкая тонировка стекол
• Усиленная тонировка задних стекол
• Складной ключ
• Центральный замок с дистанционным управлением
• Электростеклоподъемники передних дверей
• Электростеклоподъемники задних дверей
• Подогрев передних сидений
• Электропривод и обогрев наружных зеркал
• Обогрев ветрового стекла
• Датчики парковки задние
• Датчики дождя и света
• Климат-контроль
• Охлаждаемый вещевой ящик
• Мультифункциональное рулевое колесо
• Аудиосистема (2DIN, FM/AM с функцией RDS, USB, AUX, Bluetooth, Hands free), 4 динамика

• Наружные зеркала с боковыми указателями поворота черного цвета
• Наружные ручки дверей в цвет кузова
• 16» легкосплавные диски оригинальные
• Запасное стальное колесо временного использования 15»

• Подушка безопасности водителя
• Подушка безопасности переднего пассажира с функцией отключения
• Подголовники задних сидений 3 шт.
• Крепления для детских сидений ISOFIX
• Блокировка задних дверей от открывания детьми
• Автоматическое запирание дверей при начале движения
• Автоматическое включение аварийной сигнализации при экстренном торможении
• Автоматическое отпирание дверей и включение аварийной сигнализации при столкновении
• Иммобилайзер
• LED-дневные ходовые огни
• Противотуманные фары
• Система экстренного оповещения ЭРА-ГЛОНАСС
• Антиблокировочная система с электронным распределением тормозных сил (ABS, EBD)
• Система вспомогательного торможения (BAS)
• Система электронного контроля устойчивости (ESC) с функцией отключения
• Противобуксовочная система (TCS)
• Система помощи при трогании на подъеме (HSА)
• Защита двигателя и подкапотного пространства

• Бортовой компьютер
• Подсказчик переключения передач в комбинации приборов
• Заднее сиденье с раскладной спинкой в пропорции 60/40
• Панель приборов. Цвет (по выбору) черный/коричневый
• Обивка сидений комбинированная ткань/экокожа. Цвет (по выбору) черный/коричневый
• Противосолнечный козырек пассажира с зеркалом
• Розетка 12V на центральной консоли
• Подсветка мест входа-выхода в передних дверях

• Усилитель рулевого управления
• Регулируемая по высоте рулевая колонка
• Регулировка ремней безопасности передних сидений по высоте
• Сиденье водителя с регулировкой по высоте
• Воздушный фильтр салона
• Легкая тонировка стекол
• Усиленная тонировка задних стекол
• Складной ключ
• Центральный замок с дистанционным управлением
• Электростеклоподъемники передних дверей
• Электростеклоподъемники задних дверей
• Подогрев передних сидений
• Электропривод и обогрев наружных зеркал
• Обогрев ветрового стекла
• Датчики парковки задние
• Kамера заднего вида с динамическими линиями
• Датчики дождя и света
• Климат-контроль
• Охлаждаемый вещевой ящик
• Мультифункциональное рулевое колесо
• Мультимедийная система LADA EnjoY Pro с встроенными сервисами Яндекс. Авто (8’’ TFT-IPS ёмкостный HD дисплей, FM, 2 USB, Bluetooth, голосовое управление, Hands Free со сдвоенным микрофоном и функцией шумоподавления, Apple CarPlay, Android Auto), 6 динамиков

• Наружные зеркала с боковыми указателями поворота в цвет кузова
• Наружные ручки дверей в цвет кузова
• 16» легкосплавные диски
• Запасное стальное колесо временного использования 15»

LADA XRAY Cross — Официальный сайт LADA

• Подушка безопасности водителя
• Подушка безопасности переднего пассажира с функцией отключения
• Подголовники задних сидений 2 шт.
• Крепления для детских сидений ISOFIX
• Блокировка задних дверей от открывания детьми
• Автоматическое запирание дверей при начале движения
• Автоматическое включение аварийной сигнализации при экстренном торможении
• Автоматическое отпирание дверей и включение аварийной сигнализации при столкновении
• Иммобилайзер
• LED-дневные ходовые огни
• Противотуманные фары
• Система экстренного оповещения ЭРА-ГЛОНАСС
• Дисковые тормоза задних колес (только для 1. 8 МТ и АТ)
• Антиблокировочная система с электронным распределением тормозных сил (ABS, EBD)
• Система вспомогательного торможения (BAS)
• Система электронного контроля устойчивости (ESC) с функцией отключения
• Противобуксовочная система (TCS)
• Система помощи при трогании на подъеме (HSА)
• Защита двигателя и подкапотного пространства

• Бортовой компьютер
• Подсказчик переключения передач в комбинации приборов
• Центральный подлокотник с боксом
• Складная спинка переднего пассажирского сиденья
• Заднее сиденье с раскладной спинкой в пропорции 60/40
• Панель приборов. Цвет черный
• Обивка сидений ткань. Цвет черный
• Противосолнечный козырек пассажира с зеркалом
• Розетки 12V на центральной консоли, для задних пассажиров и в багажном отделении
• Двойной пол багажного отделения

• Электроусилитель рулевого управления
• Регулируемая по высоте и по вылету рулевая колонка
• Регулировка ремней безопасности передних сидений по высоте
• Сиденье водителя с регулировкой по высоте
• Воздушный фильтр салона
• Легкая тонировка стекол
• Складной ключ
• Центральный замок с дистанционным управлением
• Электростеклоподъемники передних дверей
• Электростеклоподъемники задних дверей
• Подогрев передних сидений 3х уровневый
• Электропривод и обогрев наружных зеркал
• Датчики парковки задние
• Кондиционер
• Охлаждаемый вещевой ящик
• Мультифункциональное рулевое колесо
• Аудиосистема (2DIN, FM/AM с функцией RDS, USB, AUX, Bluetooth, Hands free), 4 динамика

• Наружные зеркала с боковыми указателями поворота в цвет кузова
• Наружные ручки дверей в цвет кузова
• Рейлинги
• Декоративная насадка выпускной трубы
• 16» легкосплавные диски (только для 1. 6 МТ)
• 17» легкосплавные диски Proton
• Запасное стальное колесо временного использования 15»

• LADA Ride Select (селектор выбора режима движения) (только для МТ)
• Электронная блокировка дифференциала (EDL) (только для МТ)

• Подушка безопасности водителя
• Подушка безопасности переднего пассажира с функцией отключения
• Подголовники задних сидений 3 шт.
• Крепления для детских сидений ISOFIX
• Блокировка задних дверей от открывания детьми
• Автоматическое запирание дверей при начале движения
• Автоматическое включение аварийной сигнализации при экстренном торможении
• Автоматическое отпирание дверей и включение аварийной сигнализации при столкновении
• Иммобилайзер
• LED-дневные ходовые огни
• Противотуманные фары с функцией освещения поворота
• Система экстренного оповещения ЭРА-ГЛОНАСС
• Дисковые тормоза задних колес (только для 1.8 МТ и АТ)
• Антиблокировочная система с электронным распределением тормозных сил (ABS, EBD)
• Система вспомогательного торможения (BAS)
• Система электронного контроля устойчивости (ESC) с функцией отключения
• Противобуксовочная система (TCS)
• Система помощи при трогании на подъеме (HSА)
• Защита двигателя и подкапотного пространства

• Бортовой компьютер
• Подсказчик переключения передач в комбинации приборов
• Центральный подлокотник с боксом
• Складная спинка переднего пассажирского сиденья
• Заднее сиденье с раскладной спинкой в пропорции 60/40
• Панель приборов. Цвет (по выбору) оранжевый/черный
• Обивка сидений комбинированная ткань/экокожа. Цвет (по выбору) оранжевый/серый
• Отделка руля и чехла селектора КПП кожей
• Противосолнечный козырек пассажира с зеркалом
• Розетки 12V на центральной консоли, для задних пассажиров и в багажном отделении
• Розетка USB для задних пассажиров
• Выдвижной ящик под сиденьем переднего пассажира
• Двойной пол багажного отделения
• Атмосферная подсветка салона
• Подсветка мест входа-выхода в передних дверях

• Электроусилитель рулевого управления
• Регулируемая по высоте и по вылету рулевая колонка
• Регулировка ремней безопасности передних сидений по высоте
• Сиденье водителя с регулировкой по высоте
• Воздушный фильтр салона
• Легкая тонировка стекол
• Усиленная тонировка задних стекол
• Складной ключ
• Центральный замок с дистанционным управлением
• Электростеклоподъемники передних дверей
• Электростеклоподъемники задних дверей
• Подогрев рулевого колеса
• Подогрев передних сидений 3х уровневый
• Подогрев задних сидений
• Электропривод и обогрев наружных зеркал
• Обогрев ветрового стекла
• Датчики парковки задние
• Kамера заднего вида с динамическими линиями
• Датчики дождя и света
• Климат-контроль
• Охлаждаемый вещевой ящик
• Круиз-контроль и ограничитель скорости
• Мультифункциональное рулевое колесо
• Мультимедийная система LADA EnjoY Pro с встроенными сервисами Яндекс. Авто (8’’ TFT-IPS ёмкостный HD дисплей, FM, 2 USB, Bluetooth, голосовое управление, Hands Free со сдвоенным микрофоном и функцией шумоподавления, Apple CarPlay, Android Auto), 6 динамиков

• Наружные зеркала с боковыми указателями поворота в цвет кузова
• Наружные ручки дверей в цвет кузова
• Рейлинги
• Декоративная насадка выпускной трубы
• 17» легкосплавные диски Proton
• Запасное стальное колесо временного использования 15»

• Подушка безопасности водителя
• Подушка безопасности переднего пассажира с функцией отключения
• Подголовники задних сидений 2 шт.
• Крепления для детских сидений ISOFIX
• Блокировка задних дверей от открывания детьми
• Автоматическое запирание дверей при начале движения
• Автоматическое включение аварийной сигнализации при экстренном торможении
• Автоматическое отпирание дверей и включение аварийной сигнализации при столкновении
• Иммобилайзер
• LED-дневные ходовые огни
• Противотуманные фары
• Система экстренного оповещения ЭРА-ГЛОНАСС
• Дисковые тормоза задних колес (только для 1. 8 МТ и АТ)
• Антиблокировочная система с электронным распределением тормозных сил (ABS, EBD)
• Система вспомогательного торможения (BAS)
• Система электронного контроля устойчивости (ESC) с функцией отключения
• Противобуксовочная система (TCS)
• Система помощи при трогании на подъеме (HSА)
• Защита двигателя и подкапотного пространства

• Бортовой компьютер
• Подсказчик переключения передач в комбинации приборов
• Центральный подлокотник с боксом
• Складная спинка переднего пассажирского сиденья
• Заднее сиденье с раскладной спинкой в пропорции 60/40
• Обивка потолка черного цвета
• Панель приборов. Цвет черный
• Обивка сидений комбинированная ткань/экокожа. Цвет черный
• Противосолнечный козырек пассажира с зеркалом
• Розетки 12V на центральной консоли, для задних пассажиров и в багажном отделении
• Двойной пол багажного отделения

• Электроусилитель рулевого управления
• Регулируемая по высоте и по вылету рулевая колонка
• Регулировка ремней безопасности передних сидений по высоте
• Сиденье водителя с регулировкой по высоте
• Воздушный фильтр салона
• Легкая тонировка стекол
• Складной ключ
• Центральный замок с дистанционным управлением
• Электростеклоподъемники передних дверей
• Электростеклоподъемники задних дверей
• Подогрев передних сидений 3х уровневый
• Электропривод и обогрев наружных зеркал
• Датчики парковки задние
• Kамера заднего вида с динамическими линиями
• Кондиционер
• Охлаждаемый вещевой ящик
• Мультифункциональное рулевое колесо
• Мультимедийная система LADA EnjoY Pro с встроенными сервисами Яндекс. Авто (8’’ TFT-IPS ёмкостный HD дисплей, FM, 2 USB, Bluetooth, голосовое управление, Hands Free со сдвоенным микрофоном и функцией шумоподавления, Apple CarPlay, Android Auto), 6 динамиков

• Крыша кузова черного цвета
• Наружные зеркала с боковыми указателями поворота черного цвета
• Наружные ручки дверей в цвет кузова
• Рейлинги
• Декоративная насадка выпускной трубы
• 17» легкосплавные диски Proton
• Запасное стальное колесо временного использования 15»

• Подушка безопасности водителя
• Подушка безопасности переднего пассажира с функцией отключения
• Подголовники задних сидений 3 шт.
• Крепления для детских сидений ISOFIX
• Блокировка задних дверей от открывания детьми
• Автоматическое запирание дверей при начале движения
• Автоматическое включение аварийной сигнализации при экстренном торможении
• Автоматическое отпирание дверей и включение аварийной сигнализации при столкновении
• Иммобилайзер
• LED-дневные ходовые огни
• Противотуманные фары с функцией освещения поворота
• Система экстренного оповещения ЭРА-ГЛОНАСС
• Дисковые тормоза задних колес (только для 1. 8 МТ и АТ)
• Антиблокировочная система с электронным распределением тормозных сил (ABS, EBD)
• Система вспомогательного торможения (BAS)
• Система электронного контроля устойчивости (ESC) с функцией отключения
• Противобуксовочная система (TCS)
• Система помощи при трогании на подъеме (HSА)
• Защита двигателя и подкапотного пространства

• Бортовой компьютер
• Подсказчик переключения передач в комбинации приборов
• Центральный подлокотник с боксом
• Складная спинка переднего пассажирского сиденья
• Заднее сиденье с раскладной спинкой в пропорции 60/40
• Панель приборов. Цвет (по выбору) оранжевый/черный
• Обивка сидений комбинированная ткань/экокожа. Цвет (по выбору) оранжевый/серый
• Отделка руля и чехла селектора КПП кожей
• Противосолнечный козырек пассажира с зеркалом
• Розетки 12V на центральной консоли, для задних пассажиров и в багажном отделении
• Розетка USB для задних пассажиров
• Выдвижной ящик под сиденьем переднего пассажира
• Двойной пол багажного отделения
• Подсветка мест входа-выхода в передних дверях

• Электроусилитель рулевого управления
• Регулируемая по высоте и по вылету рулевая колонка
• Регулировка ремней безопасности передних сидений по высоте
• Сиденье водителя с регулировкой по высоте
• Воздушный фильтр салона
• Легкая тонировка стекол
• Складной ключ
• Центральный замок с дистанционным управлением
• Электростеклоподъемники передних дверей
• Электростеклоподъемники задних дверей
• Подогрев рулевого колеса
• Подогрев передних сидений 3х уровневый
• Подогрев задних сидений
• Электропривод и обогрев наружных зеркал
• Обогрев ветрового стекла
• Датчики парковки задние
• Датчики дождя и света
• Климат-контроль
• Охлаждаемый вещевой ящик
• Круиз-контроль и ограничитель скорости
• Мультифункциональное рулевое колесо
• Аудиосистема (2DIN, FM/AM с функцией RDS, USB, AUX, Bluetooth, Hands free), 4 динамика

• Наружные зеркала с боковыми указателями поворота в цвет кузова
• Наружные ручки дверей в цвет кузова
• Рейлинги
• Декоративная насадка выпускной трубы
• 17» легкосплавные диски Proton
• Запасное стальное колесо временного использования 15»

• LADA Ride Select (селектор выбора режима движения) (только для МТ)
• Электронная блокировка дифференциала (EDL) (только для МТ)

• Подушка безопасности водителя
• Подушка безопасности переднего пассажира с функцией отключения
• Подголовники задних сидений 3 шт.
• Крепления для детских сидений ISOFIX
• Блокировка задних дверей от открывания детьми
• Автоматическое запирание дверей при начале движения
• Автоматическое включение аварийной сигнализации при экстренном торможении
• Автоматическое отпирание дверей и включение аварийной сигнализации при столкновении
• Иммобилайзер
• LED-дневные ходовые огни
• Противотуманные фары с функцией освещения поворота
• Система экстренного оповещения ЭРА-ГЛОНАСС
• Дисковые тормоза задних колес (только для 1.8 МТ и АТ)
• Антиблокировочная система с электронным распределением тормозных сил (ABS, EBD)
• Система вспомогательного торможения (BAS)
• Система электронного контроля устойчивости (ESC) с функцией отключения
• Противобуксовочная система (TCS)
• Система помощи при трогании на подъеме (HSА)
• Защита двигателя и подкапотного пространства

• Бортовой компьютер
• Подсказчик переключения передач в комбинации приборов
• Центральный подлокотник с боксом
• Складная спинка переднего пассажирского сиденья
• Заднее сиденье с раскладной спинкой в пропорции 60/40
• Панель приборов. Цвет (по выбору) оранжевый/черный
• Обивка сидений комбинированная ткань/экокожа. Цвет (по выбору) оранжевый/серый
• Отделка руля и чехла селектора КПП кожей
• Противосолнечный козырек пассажира с зеркалом
• Розетки 12V на центральной консоли, для задних пассажиров и в багажном отделении
• Розетка USB для задних пассажиров
• Выдвижной ящик под сиденьем переднего пассажира
• Двойной пол багажного отделения
• Атмосферная подсветка салона
• Подсветка мест входа-выхода в передних дверях

• Электроусилитель рулевого управления
• Регулируемая по высоте и по вылету рулевая колонка
• Регулировка ремней безопасности передних сидений по высоте
• Сиденье водителя с регулировкой по высоте
• Воздушный фильтр салона
• Легкая тонировка стекол
• Усиленная тонировка задних стекол
• Складной ключ
• Центральный замок с дистанционным управлением
• Электростеклоподъемники передних дверей
• Электростеклоподъемники задних дверей
• Подогрев рулевого колеса
• Подогрев передних сидений 3х уровневый
• Подогрев задних сидений
• Электропривод и обогрев наружных зеркал
• Обогрев ветрового стекла
• Датчики парковки задние
• Kамера заднего вида с динамическими линиями
• Датчики дождя и света
• Климат-контроль
• Охлаждаемый вещевой ящик
• Круиз-контроль и ограничитель скорости
• Мультифункциональное рулевое колесо
• Мультимедийная система LADA EnjoY Pro с встроенными сервисами Яндекс. Авто (8’’ TFT-IPS ёмкостный HD дисплей, FM, 2 USB, Bluetooth, голосовое управление, Hands Free со сдвоенным микрофоном и функцией шумоподавления, Apple CarPlay, Android Auto), 6 динамиков

• Крыша кузова черного цвета
• Наружные зеркала с боковыми указателями поворота черного цвета
• Наружные ручки дверей в цвет кузова
• Рейлинги
• Декоративная насадка выпускной трубы
• 17» легкосплавные диски Proton
• Запасное стальное колесо временного использования 15»

• Подушка безопасности водителя
• Подушка безопасности переднего пассажира с функцией отключения
• Подголовники задних сидений 3 шт.
• Крепления для детских сидений ISOFIX
• Блокировка задних дверей от открывания детьми
• Автоматическое запирание дверей при начале движения
• Автоматическое включение аварийной сигнализации при экстренном торможении
• Автоматическое отпирание дверей и включение аварийной сигнализации при столкновении
• Иммобилайзер
• LED-дневные ходовые огни
• Противотуманные фары с функцией освещения поворота
• Система экстренного оповещения ЭРА-ГЛОНАСС
• Дисковые тормоза задних колес (только для 1. 8 МТ и АТ)
• Антиблокировочная система с электронным распределением тормозных сил (ABS, EBD)
• Система вспомогательного торможения (BAS)
• Система электронного контроля устойчивости (ESC) с функцией отключения
• Противобуксовочная система (TCS)
• Система помощи при трогании на подъеме (HSА)
• Защита двигателя и подкапотного пространства

• Бортовой компьютер
• Подсказчик переключения передач в комбинации приборов
• Центральный подлокотник с боксом
• Складная спинка переднего пассажирского сиденья
• Заднее сиденье с раскладной спинкой в пропорции 60/40
• Панель приборов. Цвет (по выбору) оранжевый/черный
• Обивка сидений комбинированная ткань/экокожа. Цвет (по выбору) оранжевый/серый
• Отделка руля и чехла селектора КПП кожей
• Противосолнечный козырек пассажира с зеркалом
• Розетки 12V на центральной консоли, для задних пассажиров и в багажном отделении
• Розетка USB для задних пассажиров
• Выдвижной ящик под сиденьем переднего пассажира
• Двойной пол багажного отделения
• Атмосферная подсветка салона
• Подсветка мест входа-выхода в передних дверях

• Электроусилитель рулевого управления
• Регулируемая по высоте и по вылету рулевая колонка
• Регулировка ремней безопасности передних сидений по высоте
• Сиденье водителя с регулировкой по высоте
• Воздушный фильтр салона
• Легкая тонировка стекол
• Усиленная тонировка задних стекол
• Складной ключ
• Центральный замок с дистанционным управлением
• Электростеклоподъемники передних дверей
• Электростеклоподъемники задних дверей
• Подогрев рулевого колеса
• Подогрев передних сидений 3х уровневый
• Подогрев задних сидений
• Электропривод и обогрев наружных зеркал
• Обогрев ветрового стекла
• Датчики парковки задние
• Kамера заднего вида с динамическими линиями
• Датчики дождя и света
• Климат-контроль
• Охлаждаемый вещевой ящик
• Круиз-контроль и ограничитель скорости
• Мультифункциональное рулевое колесо
• Мультимедийная система LADA EnjoY Pro с встроенными сервисами Яндекс. Авто (8’’ TFT-IPS ёмкостный HD дисплей, FM, 2 USB, Bluetooth, голосовое управление, Hands Free со сдвоенным микрофоном и функцией шумоподавления, Apple CarPlay, Android Auto), 6 динамиков

• Наружные зеркала с боковыми указателями поворота в цвет кузова
• Наружные ручки дверей в цвет кузова
• Рейлинги
• Декоративная насадка выпускной трубы
• 17» легкосплавные диски Proton
• Запасное стальное колесо временного использования 15»

• Подушка безопасности водителя
• Подушка безопасности переднего пассажира с функцией отключения
• Подголовники задних сидений 3 шт.
• Крепления для детских сидений ISOFIX
• Блокировка задних дверей от открывания детьми
• Автоматическое запирание дверей при начале движения
• Автоматическое включение аварийной сигнализации при экстренном торможении
• Автоматическое отпирание дверей и включение аварийной сигнализации при столкновении
• Иммобилайзер
• LED-дневные ходовые огни
• Противотуманные фары с функцией освещения поворота
• Система экстренного оповещения ЭРА-ГЛОНАСС
• Дисковые тормоза задних колес (только для 1. 8 МТ и АТ)
• Антиблокировочная система с электронным распределением тормозных сил (ABS, EBD)
• Система вспомогательного торможения (BAS)
• Система электронного контроля устойчивости (ESC) с функцией отключения
• Противобуксовочная система (TCS)
• Система помощи при трогании на подъеме (HSА)
• Защита двигателя и подкапотного пространства

• Бортовой компьютер
• Подсказчик переключения передач в комбинации приборов
• Центральный подлокотник с боксом
• Складная спинка переднего пассажирского сиденья
• Заднее сиденье с раскладной спинкой в пропорции 60/40
• Панель приборов. Цвет (по выбору) оранжевый/черный
• Обивка сидений комбинированная ткань/экокожа. Цвет (по выбору) оранжевый/серый
• Отделка руля и чехла селектора КПП кожей
• Противосолнечный козырек пассажира с зеркалом
• Розетки 12V на центральной консоли, для задних пассажиров и в багажном отделении
• Розетка USB для задних пассажиров
• Выдвижной ящик под сиденьем переднего пассажира
• Двойной пол багажного отделения
• Атмосферная подсветка салона
• Подсветка мест входа-выхода в передних дверях

• Электроусилитель рулевого управления
• Регулируемая по высоте и по вылету рулевая колонка
• Регулировка ремней безопасности передних сидений по высоте
• Сиденье водителя с регулировкой по высоте
• Воздушный фильтр салона
• Легкая тонировка стекол
• Усиленная тонировка задних стекол
• Складной ключ
• Центральный замок с дистанционным управлением
• Электростеклоподъемники передних дверей
• Электростеклоподъемники задних дверей
• Подогрев рулевого колеса
• Подогрев передних сидений 3х уровневый
• Подогрев задних сидений
• Электропривод и обогрев наружных зеркал
• Обогрев ветрового стекла
• Датчики парковки задние
• Kамера заднего вида с динамическими линиями
• Датчики дождя и света
• Климат-контроль
• Охлаждаемый вещевой ящик
• Круиз-контроль и ограничитель скорости
• Мультифункциональное рулевое колесо
• Мультимедийная система LADA EnjoY Pro с встроенными сервисами Яндекс. Авто (8’’ TFT-IPS ёмкостный HD дисплей, FM, 2 USB, Bluetooth, голосовое управление, Hands Free со сдвоенным микрофоном и функцией шумоподавления, Apple CarPlay, Android Auto), 6 динамиков

• Крыша кузова черного цвета
• Наружные зеркала с боковыми указателями поворота черного цвета
• Наружные ручки дверей в цвет кузова
• Рейлинги
• Декоративная насадка выпускной трубы
• 17» легкосплавные диски Proton
• Запасное стальное колесо временного использования 15»

• Подушка безопасности водителя
• Подушка безопасности переднего пассажира с функцией отключения
• Подголовники задних сидений 2 шт.
• Крепления для детских сидений ISOFIX
• Блокировка задних дверей от открывания детьми
• Автоматическое запирание дверей при начале движения
• Автоматическое включение аварийной сигнализации при экстренном торможении
• Автоматическое отпирание дверей и включение аварийной сигнализации при столкновении
• Иммобилайзер
• LED-дневные ходовые огни
• Система экстренного оповещения ЭРА-ГЛОНАСС
• Антиблокировочная система с электронным распределением тормозных сил (ABS, EBD)
• Система вспомогательного торможения (BAS)
• Система электронного контроля устойчивости (ESC) с функцией отключения
• Противобуксовочная система (TCS)
• Система помощи при трогании на подъеме (HSА)
• Защита двигателя и подкапотного пространства

• Бортовой компьютер
• Подсказчик переключения передач в комбинации приборов
• Заднее сиденье с раскладной спинкой в пропорции 60/40
• Панель приборов. Цвет черный
• Обивка сидений ткань. Цвет черный
• Розетка 12V на центральной консоли

• Электроусилитель рулевого управления
• Регулируемая по высоте и по вылету рулевая колонка
• Регулировка ремней безопасности передних сидений по высоте
• Воздушный фильтр салона
• Легкая тонировка стекол
• Складной ключ
• Центральный замок с дистанционным управлением
• Электростеклоподъемники передних дверей
• Аудиоподготовка

• Наружные зеркала с боковыми указателями поворота в цвет кузова
• Наружные ручки дверей в цвет кузова
• Рейлинги
• Декоративная насадка выпускной трубы
• 16» легкосплавные диски (только для 1.6 МТ)
• Запасное стальное колесо временного использования 15»

• Подушка безопасности водителя
• Подушка безопасности переднего пассажира с функцией отключения
• Подголовники задних сидений 2 шт.
• Крепления для детских сидений ISOFIX
• Блокировка задних дверей от открывания детьми
• Автоматическое запирание дверей при начале движения
• Автоматическое включение аварийной сигнализации при экстренном торможении
• Автоматическое отпирание дверей и включение аварийной сигнализации при столкновении
• Иммобилайзер
• LED-дневные ходовые огни
• Система экстренного оповещения ЭРА-ГЛОНАСС
• Антиблокировочная система с электронным распределением тормозных сил (ABS, EBD)
• Система вспомогательного торможения (BAS)
• Система электронного контроля устойчивости (ESC) с функцией отключения
• Противобуксовочная система (TCS)
• Система помощи при трогании на подъеме (HSА)
• Защита двигателя и подкапотного пространства

• Бортовой компьютер
• Подсказчик переключения передач в комбинации приборов
• Заднее сиденье с раскладной спинкой в пропорции 60/40
• Панель приборов. Цвет черный
• Обивка сидений ткань. Цвет черный
• Розетка 12V на центральной консоли

• Электроусилитель рулевого управления
• Регулируемая по высоте и по вылету рулевая колонка
• Регулировка ремней безопасности передних сидений по высоте
• Воздушный фильтр салона
• Легкая тонировка стекол
• Складной ключ
• Центральный замок с дистанционным управлением
• Электростеклоподъемники передних дверей
• Кондиционер
• Охлаждаемый вещевой ящик
• Мультифункциональное рулевое колесо
• Аудиосистема (2DIN, FM/AM с функцией RDS, USB, AUX, Bluetooth, Hands free), 4 динамика

• Наружные зеркала с боковыми указателями поворота в цвет кузова
• Наружные ручки дверей в цвет кузова
• Рейлинги
• Декоративная насадка выпускной трубы
• 16» легкосплавные диски (только для 1.6 МТ)
• Запасное стальное колесо временного использования 15»

• Подушка безопасности водителя
• Подушка безопасности переднего пассажира с функцией отключения
• Подголовники задних сидений 2 шт.
• Крепления для детских сидений ISOFIX
• Блокировка задних дверей от открывания детьми
• Автоматическое запирание дверей при начале движения
• Автоматическое включение аварийной сигнализации при экстренном торможении
• Автоматическое отпирание дверей и включение аварийной сигнализации при столкновении
• Иммобилайзер
• LED-дневные ходовые огни
• Противотуманные фары
• Система экстренного оповещения ЭРА-ГЛОНАСС
• Антиблокировочная система с электронным распределением тормозных сил (ABS, EBD)
• Система вспомогательного торможения (BAS)
• Система электронного контроля устойчивости (ESC) с функцией отключения
• Противобуксовочная система (TCS)
• Система помощи при трогании на подъеме (HSА)
• Защита двигателя и подкапотного пространства

• Бортовой компьютер
• Подсказчик переключения передач в комбинации приборов
• Центральный подлокотник с боксом
• Складная спинка переднего пассажирского сиденья
• Заднее сиденье с раскладной спинкой в пропорции 60/40
• Панель приборов. Цвет черный
• Обивка сидений ткань. Цвет черный
• Противосолнечный козырек пассажира с зеркалом
• Розетки 12V на центральной консоли, для задних пассажиров и в багажном отделении
• Двойной пол багажного отделения

• Электроусилитель рулевого управления
• Регулируемая по высоте и по вылету рулевая колонка
• Регулировка ремней безопасности передних сидений по высоте
• Сиденье водителя с регулировкой по высоте
• Воздушный фильтр салона
• Легкая тонировка стекол
• Складной ключ
• Центральный замок с дистанционным управлением
• Электростеклоподъемники передних дверей
• Электростеклоподъемники задних дверей
• Подогрев передних сидений 3х уровневый
• Электропривод и обогрев наружных зеркал
• Датчики парковки задние
• Кондиционер
• Охлаждаемый вещевой ящик
• Мультифункциональное рулевое колесо
• Аудиосистема (2DIN, FM/AM с функцией RDS, USB, AUX, Bluetooth, Hands free), 4 динамика

• Наружные зеркала с боковыми указателями поворота в цвет кузова
• Наружные ручки дверей в цвет кузова
• Рейлинги
• Декоративная насадка выпускной трубы
• 16» легкосплавные диски (только для 1. 6 МТ)
• Запасное стальное колесо временного использования 15»

• Подушка безопасности водителя
• Подушка безопасности переднего пассажира с функцией отключения
• Подголовники задних сидений 2 шт.
• Крепления для детских сидений ISOFIX
• Блокировка задних дверей от открывания детьми
• Автоматическое запирание дверей при начале движения
• Автоматическое включение аварийной сигнализации при экстренном торможении
• Автоматическое отпирание дверей и включение аварийной сигнализации при столкновении
• Иммобилайзер
• LED-дневные ходовые огни
• Система экстренного оповещения ЭРА-ГЛОНАСС
• Дисковые тормоза задних колес (только для 1.8 МТ и АТ)
• Антиблокировочная система с электронным распределением тормозных сил (ABS, EBD)
• Система вспомогательного торможения (BAS)
• Система электронного контроля устойчивости (ESC) с функцией отключения
• Противобуксовочная система (TCS)
• Система помощи при трогании на подъеме (HSА)
• Защита двигателя и подкапотного пространства

• Бортовой компьютер
• Подсказчик переключения передач в комбинации приборов
• Заднее сиденье с раскладной спинкой в пропорции 60/40
• Панель приборов. Цвет черный
• Обивка сидений ткань. Цвет черный
• Розетка 12V на центральной консоли

• Электроусилитель рулевого управления
• Регулируемая по высоте и по вылету рулевая колонка
• Регулировка ремней безопасности передних сидений по высоте
• Воздушный фильтр салона
• Легкая тонировка стекол
• Складной ключ
• Центральный замок с дистанционным управлением
• Электростеклоподъемники передних дверей
• Кондиционер
• Охлаждаемый вещевой ящик
• Мультифункциональное рулевое колесо
• Аудиосистема (2DIN, FM/AM с функцией RDS, USB, AUX, Bluetooth, Hands free), 4 динамика

• Наружные зеркала с боковыми указателями поворота в цвет кузова
• Наружные ручки дверей в цвет кузова
• Рейлинги
• Декоративная насадка выпускной трубы
• 16» легкосплавные диски (только для 1.6 МТ)
• 17» легкосплавные диски Proton
• Запасное стальное колесо временного использования 15»

• LADA Ride Select (селектор выбора режима движения) (только для МТ)
• Электронная блокировка дифференциала (EDL) (только для МТ)

• Подушка безопасности водителя
• Подушка безопасности переднего пассажира с функцией отключения
• Подголовники задних сидений 2 шт.
• Крепления для детских сидений ISOFIX
• Блокировка задних дверей от открывания детьми
• Автоматическое запирание дверей при начале движения
• Автоматическое включение аварийной сигнализации при экстренном торможении
• Автоматическое отпирание дверей и включение аварийной сигнализации при столкновении
• Иммобилайзер
• LED-дневные ходовые огни
• Противотуманные фары
• Система экстренного оповещения ЭРА-ГЛОНАСС
• Дисковые тормоза задних колес (только для 1.8 МТ и АТ)
• Антиблокировочная система с электронным распределением тормозных сил (ABS, EBD)
• Система вспомогательного торможения (BAS)
• Система электронного контроля устойчивости (ESC) с функцией отключения
• Противобуксовочная система (TCS)
• Система помощи при трогании на подъеме (HSА)
• Защита двигателя и подкапотного пространства

• Бортовой компьютер
• Подсказчик переключения передач в комбинации приборов
• Центральный подлокотник с боксом
• Складная спинка переднего пассажирского сиденья
• Заднее сиденье с раскладной спинкой в пропорции 60/40
• Обивка потолка черного цвета
• Панель приборов. Цвет черный
• Обивка сидений комбинированная ткань/экокожа. Цвет черный
• Противосолнечный козырек пассажира с зеркалом
• Розетки 12V на центральной консоли, для задних пассажиров и в багажном отделении
• Двойной пол багажного отделения

• Электроусилитель рулевого управления
• Регулируемая по высоте и по вылету рулевая колонка
• Регулировка ремней безопасности передних сидений по высоте
• Сиденье водителя с регулировкой по высоте
• Воздушный фильтр салона
• Легкая тонировка стекол
• Складной ключ
• Центральный замок с дистанционным управлением
• Электростеклоподъемники передних дверей
• Электростеклоподъемники задних дверей
• Подогрев передних сидений 3х уровневый
• Электропривод и обогрев наружных зеркал
• Датчики парковки задние
• Kамера заднего вида с динамическими линиями
• Кондиционер
• Охлаждаемый вещевой ящик
• Мультифункциональное рулевое колесо
• Мультимедийная система LADA EnjoY Pro с встроенными сервисами Яндекс. Авто (8’’ TFT-IPS ёмкостный HD дисплей, FM, 2 USB, Bluetooth, голосовое управление, Hands Free со сдвоенным микрофоном и функцией шумоподавления, Apple CarPlay, Android Auto), 6 динамиков

• Крыша кузова черного цвета
• Наружные зеркала с боковыми указателями поворота черного цвета
• Наружные ручки дверей в цвет кузова
• Рейлинги
• Декоративная насадка выпускной трубы
• 17» легкосплавные диски Proton
• Запасное стальное колесо временного использования 15»

• LADA Ride Select (селектор выбора режима движения) (только для МТ)
• Электронная блокировка дифференциала (EDL) (только для МТ)

• Подушка безопасности водителя
• Подушка безопасности переднего пассажира с функцией отключения
• Подголовники задних сидений 3 шт.
• Крепления для детских сидений ISOFIX
• Блокировка задних дверей от открывания детьми
• Автоматическое запирание дверей при начале движения
• Автоматическое включение аварийной сигнализации при экстренном торможении
• Автоматическое отпирание дверей и включение аварийной сигнализации при столкновении
• Иммобилайзер
• LED-дневные ходовые огни
• Противотуманные фары с функцией освещения поворота
• Система экстренного оповещения ЭРА-ГЛОНАСС
• Дисковые тормоза задних колес (только для 1. 8 МТ и АТ)
• Антиблокировочная система с электронным распределением тормозных сил (ABS, EBD)
• Система вспомогательного торможения (BAS)
• Система электронного контроля устойчивости (ESC) с функцией отключения
• Противобуксовочная система (TCS)
• Система помощи при трогании на подъеме (HSА)
• Защита двигателя и подкапотного пространства

• Бортовой компьютер
• Подсказчик переключения передач в комбинации приборов
• Центральный подлокотник с боксом
• Складная спинка переднего пассажирского сиденья
• Заднее сиденье с раскладной спинкой в пропорции 60/40
• Панель приборов. Цвет (по выбору) оранжевый/черный
• Обивка сидений комбинированная ткань/экокожа. Цвет (по выбору) оранжевый/серый
• Отделка руля и чехла селектора КПП кожей
• Противосолнечный козырек пассажира с зеркалом
• Розетки 12V на центральной консоли, для задних пассажиров и в багажном отделении
• Розетка USB для задних пассажиров
• Выдвижной ящик под сиденьем переднего пассажира
• Двойной пол багажного отделения
• Подсветка мест входа-выхода в передних дверях

• Электроусилитель рулевого управления
• Регулируемая по высоте и по вылету рулевая колонка
• Регулировка ремней безопасности передних сидений по высоте
• Сиденье водителя с регулировкой по высоте
• Воздушный фильтр салона
• Легкая тонировка стекол
• Складной ключ
• Центральный замок с дистанционным управлением
• Электростеклоподъемники передних дверей
• Электростеклоподъемники задних дверей
• Подогрев рулевого колеса
• Подогрев передних сидений 3х уровневый
• Подогрев задних сидений
• Электропривод и обогрев наружных зеркал
• Обогрев ветрового стекла
• Датчики парковки задние
• Датчики дождя и света
• Климат-контроль
• Охлаждаемый вещевой ящик
• Круиз-контроль и ограничитель скорости
• Мультифункциональное рулевое колесо
• Аудиосистема (2DIN, FM/AM с функцией RDS, USB, AUX, Bluetooth, Hands free), 4 динамика

• Наружные зеркала с боковыми указателями поворота в цвет кузова
• Наружные ручки дверей в цвет кузова
• Рейлинги
• Декоративная насадка выпускной трубы
• 17» легкосплавные диски Proton
• Запасное стальное колесо временного использования 15»

Двигатели Лада Х-рей — подробные характеристики

На модель Лада Х-рей устанавливают сразу два отечественных бензиновых силовых агрегата: ВАЗ 21129 объемом 1. 6 литров 106 л.с. 148 Нм и ВАЗ 21179 объемом 1.8 литров 122 л.с. 170 Нм. Также тут встречается мотор Рено Н4М объемом 1.6 литра мощностью 110-113 л.с. 150-152 Нм.

Двигатель Лада Х-рей 1.6 литра

Этот силовой агрегат является адаптацией известного по Приоре мотора ВАЗ 21127 к ЕВРО 5, то есть дальним родственником агрегата 21083. Здесь конечно увеличенный рабочий объем, новая ГБЦ с парой распредвалов и гидрокомпенсаторами, впускной тракт переменной длины, а также датчик абсолютного давления и температуры воздуха вместо уже устаревшего ДМРВ.

Основными проблемами данного двигателя являются небольшой ресурс помпы, жор масла, троение на холодную и нередко лопающиеся расширительные бачки охлаждающей жидкости.

Первое время Lada Xray оснащалась силовым агрегатом от Renault-Nissan с индексом h5Mk, хорошо известным по ряду моделей франко-японского концерна. Этот алюминиевый мотор с цепным приводом ГРМ и фазорегулятором на впускном валу не имеет гидрокомпенсаторов, поэтому здесь требуется периодически производить регулировку тепловых зазоров клапанов.

Летом 2019 года франко-японский двс с индексом Н4М вернулся в модельную гамму в связи с установкой на X-RAY вариатора Jatco JF015E. Его мощность повысили до 113 л.с. и 152 Нм.

Список типичных неисправностей этого силового агрегата нельзя назвать слишком большим. Можно припомнить разве что проблемы с заводкой в сильный мороз, небольшой жор масла и нежное реле блока зажигания, а еще быстрый износ подушек двигателя и ремня генератора.

Хэтчбек до рестайлинга 2015 — 2019

	1.6 л 21129 МКП5	1.6 л h5M МКП5
Тип	инжектор	инжектор
Топливо	бензин АИ-92	бензин АИ-92
Расположение	поперечное	6 л h5M МКП5″>поперечное
Цилиндры	4 в ряд	4 в ряд
Клапана	16	16
Рабочий объем	1596 см³	1598 см³
Мощность	106 л.с.	110 л.с.
Крутящий момент	148 Нм	150 Нм
Разгон до 100 км/ч	11.4 с	11.1 с
Скорость (макс)	176 км/ч	181 км/ч
Экологич. класс	Евро 5	Евро 4
Расход город	9.3 л	8.9 л
Расход трасса	5.9 л	5.6 л
Расход смешанный	7.2 л	6.8 л

Renault Sandero Stepway против Lada XRAY

Не секрет, что французский концерн активно участвует в разработках и развитии АвтоВАЗа. Модель «Икс-Рэй» — это уже новый, совместный продукт, отличающийся не только неплохой проходимостью, но и достойным качеством и оснащением. За основу данного автомобиля был взят Renault Sandero Stepway. Поэтому многие отечественные водители хотят определиться, какой из двух хетчбэков лучше.

Сравнение экстерьера Renault Sandero Stepway и Lada XRAY

Дизайн «Икс-Рэй» многие автовладельцы и блогеры отмечают в числе главных плюсов модели. С другой стороны, броские Х-образные выштамповки далеко не всем водителям кажутся удачным решением.

При сравнении экстерьера Renault Sandero Stepway и Lada XRAY сразу заметно различие в позиционировании. Российский хетчбэк изначально создавался как более доступная альтернатива французскому. Среди наиболее очевидных отличий — отсутствие пластикового обвеса и рейлингов, а также меньший диаметр колесных дисков в базе.

Не так давно в модельном ряду «Лады» появилась улучшенная кросс-версия «Икс-Рэй». В ней пластиковый обвес и рейлинги уже появляются, но и стоить данная версия будет уже ощутимо дороже «Сандеро Степвэй».

Французская модель очертаниями кузова больше похожа на SUV. Можно согласиться с тем, что в версии АвтоВАЗа автомобиль выглядит более внушительно, зато хетчбэк от «Рено» выигрывает по элегантности, собранности и динамичности облика. Общими преимуществами для обеих моделей являются внушительный клиренс в 195 миллиметров и защита картера, устанавливаемая по умолчанию.

Сравнение интерьера

«Степвэй» оказывается более выгодным вариантом и при сравнении интерьера. Он превосходит оппонента в плане качества материалов и эргономики салона. Цветовая гамма исполнения внутреннего пространства у «Рено» более строгая, а потому ощущается дороже. Аналогичное ощущение возникает при сопоставлении приборной панели и самих датчиков.

Оснащение начальных комплектаций «Лады» беднее. В первых двух исполнениях отсутствует даже кондиционер. «Икс-Рэй» догоняет «Сандеро» по функциональности только в топовой версии, а цена на нее уже чуть выше.

Но самым главным преимуществом «Рено» является включение в комплектацию не только фронтальных, но и боковых эйрбэгов. У «Лады» они недоступны даже в списке опций заметно более дорогой кросс-версии.

Сравнение ходовых характеристик

По мощности моторов есть небольшая разница в пользу «Лады». Для модели предлагаются 106- и 122-сильные двигатели объемом 1.6 и 1.8. У «Рено» сама линейка силовых агрегатов обширнее. Для «Сандеро Степвэй» доступны 82-, 102- и 113-сильные 1,6-литровые двигатели.

Соответственно, за российским хетчбэком сохраняется преимущество и при сравнении ходовых характеристик. Однако разница здесь чисто номинальная и в реальной жизни не ощущается. «Икс-Рэй» потратит 11,1, а «Сандеро» — 10,4 секунды для разгона до 100 км/ч. Логичным следствием этого является чуть меньший расход топлива у французской модели, экономия также небольшая – 0,3 литра (6,9 в смешанном цикле).

Вместе с тем у «Рено» есть одно важное преимущество перед машиной от АвтоВАЗа — это наличие среди перечня предлагаемых КПП не только механики и вариатора (в исполнении City), но и классического автомата. Применяемая в машине японская АКПП заслужила репутацию безукоризненно надежной и ресурсной.

Итог сравнения

Подводя итог сравнения, можно заключить что «Сандеро» во многих отношениях является более выгодным вариантом. Французский автомобиль выигрывает по безопасности, эргономике, уровню оснащения, а также стоимости. Что касается дизайна салона и экстерьера, то у модели «Степвэй» они производят впечатление более дорогих, чем у отечественного конкурента.

Провести собственное сопоставление Renault Sandero Stepway против Lada XRAY и сделать выводы самостоятельно вы сможете после прохождения тест-драйва. В Красноярске расположены сразу два автосалона «СИАЛАВТО» — официального дилера «Рено». Вас ждут на проспекте Котельникова, 20, и улице Пограничников, 101а. Для записи на тест-драйв просто воспользуйтесь онлайн-формой на сайте.

LADA XRAY Cross – загородный тест-драйв

LADA XRAY Cross – загородный тест-драйв — Новости — LADA XRAY Cross – автомобиль спортивный и динамичный. Он отличается от стандартной версии увеличенным клиренсом (215 мм), новыми пружинами и амортизаторами, 17-дюймовыми колёсными дисками, а также контрастным пластиковым обвесом. Колея расширена как спереди (на 19 мм), так и сзади (на 54 мм).

 
Что касается подвески, то спереди установлены рычаги в виде буквы «L», как у LADA Vesta, а сзади – дисковые тормоза. Приводные валы здесь усилены, а стабилизаторы поперечной устойчивости модернизированы. Уровень вибрации снижен за счёт изменения точки крепления электоромотора к рулевой рейке. При этом сам руль подогревается и регулируется и по углу наклона, и по вылету – от себя/на себя и вверх/вниз.
 
Багажник LADA XRAY Cross достаточно вместительный. Так называемый подпол подойдёт для небольших вещей, а на боковой стенке есть розетка на 12В. Примечательно, что в комплектацию кроссовера входит полноценное запасное колесо с шиной Pirelli.
 
Задние кресла в салоне подогреваются, а места для ног здесь больше, чем в обычном XRAY, благодаря оптимизированному положению спинок передних сидений. На передней панели появился контроллер LADA Ride Select в виде шайбы. Он позволяет настраивать режимы работы системы стабилизации. Здесь четыре кнопки – снег, песок, отключение и Sport. Последняя «оживляет» педаль газа.
 
Как этот кроссовер показывает себя в сложных условиях выяснил пилот команды LADA Sport ROSNEFT Владимир Шешенин. Вместе с LADA XRAY Cross он отправился в село Сосновка самарской области, где расположен полигон ПАО Роснефть.
 
Автомобиль остро реагирует на руление, поэтому движение легко контролировать. Несмотря на внушительный клиренс LADA XRAY Cross, у водителя отсутствует ощущение высокого центра тяжести, а ход автомобиля плавный, неровности практически не ощущаются.
 
Внутри установлен двигатель объёмом 1,8 литра, работающий в паре с пятиступенчатой «механикой». Коробка передач обеспечивает быстрое и точное переключение. Машина хорошо реагирует при разгоне и остановке. Система стабилизации отлично корректирует «уводы». Режим Sport, активируемый кнопкой на шайбе LADA Ride Select, задействует несколько систем стабилизации. В результате машина лучше отзывается на нажатие педали газа.
 
Что можно сказать в итоге? Большой дорожный просвет LADA XRAY Cross весьма актуален для российских дорожных условий, особенно при поездках за город.

 

Отправляя сообщение, я выражаю свое согласие и разрешаю ПАО «АВТОВАЗ», а также, по их поручению, третьим лицам осуществлять обработку моих персональных данных (фамилия, имя, отчество, год, месяц, дата и место рождения; адрес, номер паспорта и сведения о дате выдачи паспорта и выдавшем его органе; образование, профессия, место работы и должность; домашний, рабочий и мобильный телефоны; адрес электронной почты и другие данные, требуемые для отправки сообщения), включая сбор, систематизацию, накопление, хранение, уточнение, использование, распространение (в том числе трансграничную передачу), обезличивание, уничтожение персональных данных), в целях связанных с возможностью предоставления информации о товарах и услугах, которые потенциально могут представлять интерес, а также в целях сбора и обработки статистической информации и проведения маркетинговых исследований. Согласие на обработку персональных данных в соответствии с указанными выше условиями я предоставляю на 10 (десять) лет. Я уведомлен и согласен с тем, что указанное согласие может быть мной отозвано посредством направления письменного заявления заказным почтовым отправлением с описью вложения, либо вручено лично под подпись.

Отправляя сообщение, я выражаю свое согласие и разрешаю ПАО «АВТОВАЗ», а также, по их поручению, третьим лицам осуществлять обработку моих персональных данных (фамилия, имя, отчество, год, месяц, дата и место рождения; адрес, номер паспорта и сведения о дате выдачи паспорта и выдавшем его органе; образование, профессия, место работы и должность; домашний, рабочий и мобильный телефоны; адрес электронной почты и другие данные, требуемые для отправки сообщения), включая сбор, систематизацию, накопление, хранение, уточнение, использование, распространение (в том числе трансграничную передачу), обезличивание, уничтожение персональных данных), в целях связанных с возможностью предоставления информации о товарах и услугах, которые потенциально могут представлять интерес, а также в целях сбора и обработки статистической информации и проведения маркетинговых исследований. Согласие на обработку персональных данных в соответствии с указанными выше условиями я предоставляю на 10 (десять) лет. Я уведомлен и согласен с тем, что указанное согласие может быть мной отозвано посредством направления письменного заявления заказным почтовым отправлением с описью вложения, либо вручено лично под подпись.

Отправляя сообщение, я выражаю свое согласие и разрешаю ПАО «АВТОВАЗ», а также, по их поручению, третьим лицам осуществлять обработку моих персональных данных (фамилия, имя, отчество, год, месяц, дата и место рождения; адрес, номер паспорта и сведения о дате выдачи паспорта и выдавшем его органе; образование, профессия, место работы и должность; домашний, рабочий и мобильный телефоны; адрес электронной почты и другие данные, требуемые для отправки сообщения), включая сбор, систематизацию, накопление, хранение, уточнение, использование, распространение (в том числе трансграничную передачу), обезличивание, уничтожение персональных данных), в целях связанных с возможностью предоставления информации о товарах и услугах, которые потенциально могут представлять интерес, а также в целях сбора и обработки статистической информации и проведения маркетинговых исследований. Согласие на обработку персональных данных в соответствии с указанными выше условиями я предоставляю на 10 (десять) лет. Я уведомлен и согласен с тем, что указанное согласие может быть мной отозвано посредством направления письменного заявления заказным почтовым отправлением с описью вложения, либо вручено лично под подпись.

Гарантия на автомобили LADA (Лада) в официальном сервисе

Гарантийные обязательства действительны при:

1. Своевременном и обязательном выполнении потребителем Планового технического обслуживания автомобиля (ТО) в официальном сервисе LADA и контрольно-осмотровых работ по выявлению дефектов ЛКП и антикоррозийного покрытия кузова автомобиля

2. Наличии «Сервисной книжки», «Гарантийного талона» и соблюдении их требований (в случае потери или порчи необходимо срочно обратиться в официальный сервис LADA)

3. Соблюдении требований «Руководства по эксплуатации»

4. Внесении изменений в конструкцию автомобиля, заводские настройки, параметры электронных блоков управления и в программное обеспечение только в официальном сервисе LADA и одобренные ПАО «АВТОВАЗ»

5. Соблюдении технологии ремонта и обслуживания автомобиля выполненных только в официальном сервисе LADA

6. Своевременном устранении других неисправностей после их обнаружения в официальном сервисе LADA

7. Использовании качественных автокомпонентов, расходных материалов и топлива

Окончательное решение по устранению неисправности на автомобиле принимает официальный сервис LADA или ПАО «АВТОВАЗ»

Подробная информация об условиях действия гарантии описана в гарантийном талоне

Как воспользоваться гарантией

Обратится в официальный сервис LADA и предъявить документы:

1. Гарантийный талон

2. Сервисную книжку

3. Свидетельство о регистрации

4. Документ, подтверждающий право управления автомобилем (при необходимости)

Предоставить официальному сервису LADA автомобиль для подтверждения наличия неисправности

При невозможности передвижения автомобиля своим ходом необходимо обратиться в ближайший официальный сервис LADA для организации ремонта на месте или эвакуации автомобиля

При подтверждении неисправности в рамках гарантии оплата эвакуации будет производиться за счет официального сервиса LADA

ГАРАНТИЙНЫЙ СРОК НА НОВЫЙ АВТОМОБИЛЬ LADA Vesta

36 МЕСЯЦЕВ ИЛИ 100 000 КМ ПРОБЕГА (ЧТО НАСТУПИТ РАНЕЕ)

Срок гарантии 6 лет на все детали кузова автомобилей LADA от сквозной коррозии.

При несвоевременном прохождении контрольно-осмотровых работ по состоянию ЛКП и антикоррозийного покрытия кузова, согласно талонам «Сервисной книжки», гарантия изготовителя на кузов утрачивается. В течение первого года эксплуатации автомобиля контрольно-осмотровые работы по состоянию ЛКП и антикоррозийного покрытия кузова проводятся не позднее дня прохождения мероприятий по талону технического обслуживания № 1 на автомобиль.

Гарантийный срок исчисляется со дня передачи автомобиля первому владельцу.

Гарантийные обязательства изготовителя действительны при своевременном и обязательном выполнении потребителем планового технического обслуживания автомобиля в уполномоченных организациях изготовителя. Устранение в автомобиле неисправностей, возникших в период гарантии по вине изготовителя, выполняется за счет изготовителя. Устранение неисправностей эксплуатации и работы, выполняемые по талонам технического обслуживания и контрольно-осмотровых работ по состоянию ЛКП и антикоррозийного покрытия кузова, производятся за счет потребителя. За счет потребителя производятся также диагностические работы, проводимые по его инициативе и не связанные с устранением неисправностей, возникших по вине изготовителя в период гарантии, эксплуатационные регулировки вследствие ненадлежащей эксплуатации автомобиля, воздействия внешних и других факторов, в том числе: прочистка топливной системы, регулировка углов установки колес, регулировка двигателя, осмотр и регулировка тормозов, регулировка механизма сцепления. Гарантийные обязательства действительны при своевременном выполнении планового технического обслуживания.

Гарантия на отдельные комплектующие изделия:

36 МЕСЯЦЕВ ИЛИ 50 000 КМ ПРОБЕГА

Наконечники, стойки, втулки рулевых тяг и стабилизаторы поперечной устойчивости, шаровые шарниры, сайлент-блоки, резинометаллические шарниры, опоры и буферы хода сжатия стоек, рычагов подвесок и силовых агрегатов, привода ведущих колес с защитными чехлами, резиновые шланги и патрубки, фары, выключатели, переключатели и приборы управления компонентами (модули управления: светотехникой, стеклоподъемниками, обогревом сидений), тросы ручного привода тормоза, шланги гибкие переднего и заднего тормоза, водяной и электробензонасосы, расширительный бачок и его компоненты.

24 МЕСЯЦА

Аккумуляторные батареи.

12 МЕСЯЦЕВ или 35 000 КМ ПРОБЕГА

Амортизаторы, подшипники качения, элементы системы отработавших газов, в том числе каталитические нейтрализаторы, датчики содержания кислорода.

Гарантия не распространяется на:

— Коррозионные процессы крепежных деталей, деталей подвески, трансмиссии, двигателя, элементов кузова и его отделки, деталей, не являющихся элементами кузова (диски колес, детали выхлопной системы и т. д.), которые могут проявиться в процессе эксплуатации автомобиля.

— Повреждения лакокрасочного покрытия кузова (сколы, царапины, истирания), в т. ч. эрозионный износ других защитных покрытий (сколы, истирание мастики и грунта), истирание лакокрасочного покрытия кузова по местам контакта сопрягаемых деталей, потеря блеска, помутнение, обесцвечивание, возникшие в процессе эксплуатации автомобиля. Коррозионные поражения кузова: стыков деталей, сварных швов, мест установок облицовок боковых стекол и мест креплений резьбовых соединений.

— Нормальные уровни шума и вибрации.

— На неисправности и повреждения, непосредственной или косвенной причиной которых могло стать проведение демонтажа, разборки и ремонта комплектующих изделий, деталей, узлов, агрегатов или автомобиля в целом, а также работ по установке любого дополнительного оборудования, замены или модификации программного обеспечения контроллеров неуполномоченными организациями изготовителя, а также внесение изменений в конструкцию автомобиля.

— На неисправности и повреждения деталей, узлов и агрегатов автомобиля при отсутствии или повреждении идентификационной маркировки изготовителя на них.

— Неисправности, возникшие в результате неустранения или несвоевременного устранения других неисправностей после их обнаружения уполномоченной организацией изготовителя, а также возникшие в результате выполнения работ в неуполномоченных организациях изготовителя.

— Регламентные работы при плановых технических обслуживаниях, включая диагностические и регулировочные работы, а также расходуемые при этом материалы и комплектующие.

— Неисправности, возникшие в результате применения не рекомендованных изготовителем эксплуатационных материалов, масел и топлива.

— Расходные автокомпоненты, в том числе горюче-смазочные материалы и эксплуатационные жидкости всех систем автомобиля, щетки стеклоочистителя, предохранители, фильтры, лампы, свечи зажигания, приводные ремни и соответствующие ролики, шины, тормозные колодки, диски и барабаны, выжимной подшипник и диски сцепления.
В случае проявления дефекта изготовления или брака материала эти детали заменяются по гарантии.

— Неисправности и повреждения в результате механического, химического, термического или иного внешнего воздействия в следующих случаях:

• дорожно-транспортные происшествия, удары, царапины, следы попадания камней и других твердых предметов, град, действия третьих лиц;
• воздействие химически активных веществ, загрязняющих окружающую среду, в том числе применяемых для предотвращения замерзания поверхности дорог, веществ растительного происхождения и продуктов жизнедеятельности животных;
• неисправности и повреждения, в том числе деталей трансмиссии, подвески и рулевого управления, кузова автомобиля, возникшие из-за ошибочных действий при управлении автомобилем, неаккуратного вождения по неровному дорожному покрытию или перевозки грузов с нагрузкой, превышающей допустимые нормы и сопряженных с ударными нагрузками на детали автомобиля;
• применение некачественного топлива;
• обстоятельства непреодолимой силы (молния, пожар, наводнение, землетрясение, военные действия, теракты и т. д.).

Окончательное решение по обнаруженным на автомобиле неисправностям принимает продавец, изготовитель или уполномоченная организация изготовителя.

ГАРАНТИЙНЫЙ СРОК НА НОВЫЙ АВТОМОБИЛЬ LADA XRAY

36 МЕСЯЦЕВ ИЛИ 100 000 КМ ПРОБЕГА (ЧТО НАСТУПИТ РАНЕЕ)

Срок гарантии 6 лет на все детали кузова автомобилей LADA от сквозной коррозии.

При несвоевременном прохождении контрольно-осмотровых работ по состоянию ЛКП и антикоррозийного покрытия кузова, согласно талонам «Сервисной книжки», гарантия изготовителя на кузов утрачивается. В течение первого года эксплуатации автомобиля контрольно-осмотровые работы по состоянию ЛКП и антикоррозийного покрытия кузова проводятся не позднее дня прохождения мероприятий по талону технического обслуживания № 1 на автомобиль.

Гарантийный срок исчисляется со дня передачи автомобиля первому владельцу.

Гарантийные обязательства изготовителя действительны при своевременном и обязательном выполнении потребителем планового технического обслуживания автомобиля в уполномоченных организациях изготовителя. Устранение в автомобиле неисправностей, возникших в период гарантии по вине изготовителя, выполняется за счет изготовителя. Устранение неисправностей эксплуатации и работы, выполняемые по талонам технического обслуживания и контрольно-осмотровых работ по состоянию ЛКП и антикоррозийного покрытия кузова, производятся за счет потребителя. За счет потребителя производятся также диагностические работы, проводимые по его инициативе и не связанные с устранением неисправностей, возникших по вине изготовителя в период гарантии, эксплуатационные регулировки вследствие ненадлежащей эксплуатации автомобиля, воздействия внешних и других факторов, в том числе: прочистка топливной системы, регулировка углов установки колес, регулировка двигателя, осмотр и регулировка тормозов, регулировка механизма сцепления. Гарантийные обязательства действительны при своевременном выполнении планового технического обслуживания.

Гарантия на отдельные комплектующие изделия:

36 МЕСЯЦЕВ ИЛИ 50 000 КМ ПРОБЕГА

Наконечники, стойки, втулки рулевых тяг и стабилизаторы поперечной устойчивости, шаровые шарниры, сайлент-блоки, резинометаллические шарниры, опоры и буферы хода сжатия стоек, рычагов подвесок и силовых агрегатов, привода ведущих колес с защитными чехлами, резиновые шланги и патрубки, фары, выключатели, переключатели и приборы управления компонентами (модули управления: светотехникой, стеклоподъемниками, обогревом сидений), тросы ручного привода тормоза, шланги гибкие переднего и заднего тормоза, водяной и электробензонасосы, расширительный бачок и его компоненты.

24 МЕСЯЦА

Аккумуляторные батареи.

12 МЕСЯЦЕВ или 35 000 КМ ПРОБЕГА

Амортизаторы, подшипники качения, элементы системы отработавших газов, в том числе каталитические нейтрализаторы, датчики содержания кислорода.

Гарантия не распространяется на:

— Коррозионные процессы крепежных деталей, деталей подвески, трансмиссии, двигателя, элементов кузова и его отделки, деталей, не являющихся элементами кузова (диски колес, детали выхлопной системы и т. д.), которые могут проявиться в процессе эксплуатации автомобиля.

— Повреждения лакокрасочного покрытия кузова (сколы, царапины, истирания), в т. ч. эрозионный износ других защитных покрытий (сколы, истирание мастики и грунта), истирание лакокрасочного покрытия кузова по местам контакта сопрягаемых деталей, потеря блеска, помутнение, обесцвечивание, возникшие в процессе эксплуатации автомобиля. Коррозионные поражения кузова: стыков деталей, сварных швов, мест установок облицовок боковых стекол и мест креплений резьбовых соединений.

— Нормальные уровни шума и вибрации.

— На неисправности и повреждения, непосредственной или косвенной причиной которых могло стать проведение демонтажа, разборки и ремонта комплектующих изделий, деталей, узлов, агрегатов или автомобиля в целом, а также работ по установке любого дополнительного оборудования, замены или модификации программного обеспечения контроллеров неуполномоченными организациями изготовителя, а также внесение изменений в конструкцию автомобиля.

— На неисправности и повреждения деталей, узлов и агрегатов автомобиля при отсутствии или повреждении идентификационной маркировки изготовителя на них.

— Неисправности, возникшие в результате неустранения или несвоевременного устранения других неисправностей после их обнаружения уполномоченной организацией изготовителя, а также возникшие в результате выполнения работ в неуполномоченных организациях изготовителя.

— Регламентные работы при плановых технических обслуживаниях, включая диагностические и регулировочные работы, а также расходуемые при этом материалы и комплектующие.

— Неисправности, возникшие в результате применения не рекомендованных изготовителем эксплуатационных материалов, масел и топлива.

— Расходные автокомпоненты, в том числе горюче-смазочные материалы и эксплуатационные жидкости всех систем автомобиля, щетки стеклоочистителя, предохранители, фильтры, лампы, свечи зажигания, приводные ремни и соответствующие ролики, шины, тормозные колодки, диски и барабаны, выжимной подшипник и диски сцепления.
В случае проявления дефекта изготовления или брака материала эти детали заменяются по гарантии.

— Неисправности и повреждения в результате механического, химического, термического или иного внешнего воздействия в следующих случаях:

• дорожно-транспортные происшествия, удары, царапины, следы попадания камней и других твердых предметов, град, действия третьих лиц;
• воздействие химически активных веществ, загрязняющих окружающую среду, в том числе применяемых для предотвращения замерзания поверхности дорог, веществ растительного происхождения и продуктов жизнедеятельности животных;
• неисправности и повреждения, в том числе деталей трансмиссии, подвески и рулевого управления, кузова автомобиля, возникшие из-за ошибочных действий при управлении автомобилем, неаккуратного вождения по неровному дорожному покрытию или перевозки грузов с нагрузкой, превышающей допустимые нормы и сопряженных с ударными нагрузками на детали автомобиля;
• применение некачественного топлива;
• обстоятельства непреодолимой силы (молния, пожар, наводнение, землетрясение, военные действия, теракты и т. д.).

Окончательное решение по обнаруженным на автомобиле неисправностям принимает продавец, изготовитель или уполномоченная организация изготовителя.

ГАРАНТИЙНЫЙ СРОК НА НОВЫЙ АВТОМОБИЛЬ LADA Granta

36 МЕСЯЦЕВ ИЛИ 100 000 КМ ПРОБЕГА (ЧТО НАСТУПИТ РАНЕЕ)

Срок гарантии 6 лет на все детали кузова автомобилей LADA от сквозной коррозии.

При несвоевременном прохождении контрольно-осмотровых работ по состоянию ЛКП и антикоррозийного покрытия кузова, согласно талонам «Сервисной книжки», гарантия изготовителя на кузов утрачивается. В течение первого года эксплуатации автомобиля контрольно-осмотровые работы по состоянию ЛКП и антикоррозийного покрытия кузова проводятся не позднее дня прохождения мероприятий по талону технического обслуживания № 1 на автомобиль.

Гарантийный срок исчисляется со дня передачи автомобиля первому владельцу.

Гарантийные обязательства изготовителя действительны при своевременном и обязательном выполнении потребителем планового технического обслуживания автомобиля в уполномоченных организациях изготовителя. Устранение в автомобиле неисправностей, возникших в период гарантии по вине изготовителя, выполняется за счет изготовителя. Устранение неисправностей эксплуатации и работы, выполняемые по талонам технического обслуживания и контрольно-осмотровых работ по состоянию ЛКП и антикоррозийного покрытия кузова, производятся за счет потребителя. За счет потребителя производятся также диагностические работы, проводимые по его инициативе и не связанные с устранением неисправностей, возникших по вине изготовителя в период гарантии, эксплуатационные регулировки вследствие ненадлежащей эксплуатации автомобиля, воздействия внешних и других факторов, в том числе: прочистка топливной системы, регулировка углов установки колес, регулировка двигателя, осмотр и регулировка тормозов, регулировка механизма сцепления. Гарантийные обязательства действительны при своевременном выполнении планового технического обслуживания.

Гарантия на отдельные комплектующие изделия:

36 МЕСЯЦЕВ ИЛИ 50 000 КМ ПРОБЕГА

Наконечники, стойки, втулки рулевых тяг и стабилизаторы поперечной устойчивости, шаровые шарниры, сайлент-блоки, резинометаллические шарниры, опоры и буферы хода сжатия стоек, рычагов подвесок и силовых агрегатов, привода ведущих колес с защитными чехлами, резиновые шланги и патрубки, фары, выключатели, переключатели и приборы управления компонентами (модули управления: светотехникой, стеклоподъемниками, обогревом сидений), тросы ручного привода тормоза, шланги гибкие переднего и заднего тормоза, водяной и электробензонасосы, расширительный бачок и его компоненты.

24 МЕСЯЦА

Аккумуляторные батареи.

12 МЕСЯЦЕВ или 35 000 КМ ПРОБЕГА

Амортизаторы, подшипники качения, элементы системы отработавших газов, в том числе каталитические нейтрализаторы, датчики содержания кислорода.

Гарантия не распространяется на:

— Коррозионные процессы крепежных деталей, деталей подвески, трансмиссии, двигателя, элементов кузова и его отделки, деталей, не являющихся элементами кузова (диски колес, детали выхлопной системы и т. д.), которые могут проявиться в процессе эксплуатации автомобиля.

— Повреждения лакокрасочного покрытия кузова (сколы, царапины, истирания), в т. ч. эрозионный износ других защитных покрытий (сколы, истирание мастики и грунта), истирание лакокрасочного покрытия кузова по местам контакта сопрягаемых деталей, потеря блеска, помутнение, обесцвечивание, возникшие в процессе эксплуатации автомобиля. Коррозионные поражения кузова: стыков деталей, сварных швов, мест установок облицовок боковых стекол и мест креплений резьбовых соединений.

— Нормальные уровни шума и вибрации.

— На неисправности и повреждения, непосредственной или косвенной причиной которых могло стать проведение демонтажа, разборки и ремонта комплектующих изделий, деталей, узлов, агрегатов или автомобиля в целом, а также работ по установке любого дополнительного оборудования, замены или модификации программного обеспечения контроллеров неуполномоченными организациями изготовителя, а также внесение изменений в конструкцию автомобиля.

— На неисправности и повреждения деталей, узлов и агрегатов автомобиля при отсутствии или повреждении идентификационной маркировки изготовителя на них.

— Неисправности, возникшие в результате неустранения или несвоевременного устранения других неисправностей после их обнаружения уполномоченной организацией изготовителя, а также возникшие в результате выполнения работ в неуполномоченных организациях изготовителя.

— Регламентные работы при плановых технических обслуживаниях, включая диагностические и регулировочные работы, а также расходуемые при этом материалы и комплектующие.

— Неисправности, возникшие в результате применения не рекомендованных изготовителем эксплуатационных материалов, масел и топлива.

— Расходные автокомпоненты, в том числе горюче-смазочные материалы и эксплуатационные жидкости всех систем автомобиля, щетки стеклоочистителя, предохранители, фильтры, лампы, свечи зажигания, приводные ремни и соответствующие ролики, шины, тормозные колодки, диски и барабаны, выжимной подшипник и диски сцепления.
В случае проявления дефекта изготовления или брака материала эти детали заменяются по гарантии.

— Неисправности и повреждения в результате механического, химического, термического или иного внешнего воздействия в следующих случаях:

• дорожно-транспортные происшествия, удары, царапины, следы попадания камней и других твердых предметов, град, действия третьих лиц;
• воздействие химически активных веществ, загрязняющих окружающую среду, в том числе применяемых для предотвращения замерзания поверхности дорог, веществ растительного происхождения и продуктов жизнедеятельности животных;
• неисправности и повреждения, в том числе деталей трансмиссии, подвески и рулевого управления, кузова автомобиля, возникшие из-за ошибочных действий при управлении автомобилем, неаккуратного вождения по неровному дорожному покрытию или перевозки грузов с нагрузкой, превышающей допустимые нормы и сопряженных с ударными нагрузками на детали автомобиля;
• применение некачественного топлива;
• обстоятельства непреодолимой силы (молния, пожар, наводнение, землетрясение, военные действия, теракты и т. д.).

Окончательное решение по обнаруженным на автомобиле неисправностям принимает продавец, изготовитель или уполномоченная организация изготовителя.

ГАРАНТИЙНЫЙ СРОК НА НОВЫЙ АВТОМОБИЛЬ Новая LADA Kalina

36 МЕСЯЦЕВ ИЛИ 100 000 КМ ПРОБЕГА (ЧТО НАСТУПИТ РАНЕЕ)

Срок гарантии 6 лет на все детали кузова автомобилей LADA от сквозной коррозии.

При несвоевременном прохождении контрольно-осмотровых работ по состоянию ЛКП и антикоррозийного покрытия кузова, согласно талонам «Сервисной книжки», гарантия изготовителя на кузов утрачивается. В течение первого года эксплуатации автомобиля контрольно-осмотровые работы по состоянию ЛКП и антикоррозийного покрытия кузова проводятся не позднее дня прохождения мероприятий по талону технического обслуживания № 1 на автомобиль.

Гарантийный срок исчисляется со дня передачи автомобиля первому владельцу.

Гарантийные обязательства изготовителя действительны при своевременном и обязательном выполнении потребителем планового технического обслуживания автомобиля в уполномоченных организациях изготовителя. Устранение в автомобиле неисправностей, возникших в период гарантии по вине изготовителя, выполняется за счет изготовителя. Устранение неисправностей эксплуатации и работы, выполняемые по талонам технического обслуживания и контрольно-осмотровых работ по состоянию ЛКП и антикоррозийного покрытия кузова, производятся за счет потребителя. За счет потребителя производятся также диагностические работы, проводимые по его инициативе и не связанные с устранением неисправностей, возникших по вине изготовителя в период гарантии, эксплуатационные регулировки вследствие ненадлежащей эксплуатации автомобиля, воздействия внешних и других факторов, в том числе: прочистка топливной системы, регулировка углов установки колес, регулировка двигателя, осмотр и регулировка тормозов, регулировка механизма сцепления. Гарантийные обязательства действительны при своевременном выполнении планового технического обслуживания.

Гарантия на отдельные комплектующие изделия:

36 МЕСЯЦЕВ ИЛИ 50 000 КМ ПРОБЕГА

Наконечники, стойки, втулки рулевых тяг и стабилизаторы поперечной устойчивости, шаровые шарниры, сайлент-блоки, резинометаллические шарниры, опоры и буферы хода сжатия стоек, рычагов подвесок и силовых агрегатов, привода ведущих колес с защитными чехлами, резиновые шланги и патрубки, фары, выключатели, переключатели и приборы управления компонентами (модули управления: светотехникой, стеклоподъемниками, обогревом сидений), тросы ручного привода тормоза, шланги гибкие переднего и заднего тормоза, водяной и электробензонасосы, расширительный бачок и его компоненты.

24 МЕСЯЦА

Аккумуляторные батареи.

12 МЕСЯЦЕВ или 35 000 КМ ПРОБЕГА

Амортизаторы, подшипники качения, элементы системы отработавших газов, в том числе каталитические нейтрализаторы, датчики содержания кислорода.

Гарантия не распространяется на:

— Коррозионные процессы крепежных деталей, деталей подвески, трансмиссии, двигателя, элементов кузова и его отделки, деталей, не являющихся элементами кузова (диски колес, детали выхлопной системы и т. д.), которые могут проявиться в процессе эксплуатации автомобиля.

— Повреждения лакокрасочного покрытия кузова (сколы, царапины, истирания), в т. ч. эрозионный износ других защитных покрытий (сколы, истирание мастики и грунта), истирание лакокрасочного покрытия кузова по местам контакта сопрягаемых деталей, потеря блеска, помутнение, обесцвечивание, возникшие в процессе эксплуатации автомобиля. Коррозионные поражения кузова: стыков деталей, сварных швов, мест установок облицовок боковых стекол и мест креплений резьбовых соединений.

— Нормальные уровни шума и вибрации.

— На неисправности и повреждения, непосредственной или косвенной причиной которых могло стать проведение демонтажа, разборки и ремонта комплектующих изделий, деталей, узлов, агрегатов или автомобиля в целом, а также работ по установке любого дополнительного оборудования, замены или модификации программного обеспечения контроллеров неуполномоченными организациями изготовителя, а также внесение изменений в конструкцию автомобиля.

— На неисправности и повреждения деталей, узлов и агрегатов автомобиля при отсутствии или повреждении идентификационной маркировки изготовителя на них.

— Неисправности, возникшие в результате неустранения или несвоевременного устранения других неисправностей после их обнаружения уполномоченной организацией изготовителя, а также возникшие в результате выполнения работ в неуполномоченных организациях изготовителя.

— Регламентные работы при плановых технических обслуживаниях, включая диагностические и регулировочные работы, а также расходуемые при этом материалы и комплектующие.

— Неисправности, возникшие в результате применения не рекомендованных изготовителем эксплуатационных материалов, масел и топлива.

— Расходные автокомпоненты, в том числе горюче-смазочные материалы и эксплуатационные жидкости всех систем автомобиля, щетки стеклоочистителя, предохранители, фильтры, лампы, свечи зажигания, приводные ремни и соответствующие ролики, шины, тормозные колодки, диски и барабаны, выжимной подшипник и диски сцепления.
В случае проявления дефекта изготовления или брака материала эти детали заменяются по гарантии.

— Неисправности и повреждения в результате механического, химического, термического или иного внешнего воздействия в следующих случаях:

• дорожно-транспортные происшествия, удары, царапины, следы попадания камней и других твердых предметов, град, действия третьих лиц;
• воздействие химически активных веществ, загрязняющих окружающую среду, в том числе применяемых для предотвращения замерзания поверхности дорог, веществ растительного происхождения и продуктов жизнедеятельности животных;
• неисправности и повреждения, в том числе деталей трансмиссии, подвески и рулевого управления, кузова автомобиля, возникшие из-за ошибочных действий при управлении автомобилем, неаккуратного вождения по неровному дорожному покрытию или перевозки грузов с нагрузкой, превышающей допустимые нормы и сопряженных с ударными нагрузками на детали автомобиля;
• применение некачественного топлива;
• обстоятельства непреодолимой силы (молния, пожар, наводнение, землетрясение, военные действия, теракты и т. д.).

Окончательное решение по обнаруженным на автомобиле неисправностям принимает продавец, изготовитель или уполномоченная организация изготовителя.

ГАРАНТИЙНЫЙ СРОК НА НОВЫЙ АВТОМОБИЛЬ LADA Priora

36 МЕСЯЦЕВ ИЛИ 100 000 КМ ПРОБЕГА (ЧТО НАСТУПИТ РАНЕЕ)

Срок гарантии 6 лет на все детали кузова автомобилей LADA от сквозной коррозии.

При несвоевременном прохождении контрольно-осмотровых работ по состоянию ЛКП и антикоррозийного покрытия кузова, согласно талонам «Сервисной книжки», гарантия изготовителя на кузов утрачивается. В течение первого года эксплуатации автомобиля контрольно-осмотровые работы по состоянию ЛКП и антикоррозийного покрытия кузова проводятся не позднее дня прохождения мероприятий по талону технического обслуживания № 1 на автомобиль.

Гарантийный срок исчисляется со дня передачи автомобиля первому владельцу.

Гарантийные обязательства изготовителя действительны при своевременном и обязательном выполнении потребителем планового технического обслуживания автомобиля в уполномоченных организациях изготовителя. Устранение в автомобиле неисправностей, возникших в период гарантии по вине изготовителя, выполняется за счет изготовителя. Устранение неисправностей эксплуатации и работы, выполняемые по талонам технического обслуживания и контрольно-осмотровых работ по состоянию ЛКП и антикоррозийного покрытия кузова, производятся за счет потребителя. За счет потребителя производятся также диагностические работы, проводимые по его инициативе и не связанные с устранением неисправностей, возникших по вине изготовителя в период гарантии, эксплуатационные регулировки вследствие ненадлежащей эксплуатации автомобиля, воздействия внешних и других факторов, в том числе: прочистка топливной системы, регулировка углов установки колес, регулировка двигателя, осмотр и регулировка тормозов, регулировка механизма сцепления. Гарантийные обязательства действительны при своевременном выполнении планового технического обслуживания.

Гарантия на отдельные комплектующие изделия:

36 МЕСЯЦЕВ ИЛИ 50 000 КМ ПРОБЕГА

Наконечники, стойки, втулки рулевых тяг и стабилизаторы поперечной устойчивости, шаровые шарниры, сайлент-блоки, резинометаллические шарниры, опоры и буферы хода сжатия стоек, рычагов подвесок и силовых агрегатов, привода ведущих колес с защитными чехлами, резиновые шланги и патрубки, фары, выключатели, переключатели и приборы управления компонентами (модули управления: светотехникой, стеклоподъемниками, обогревом сидений), тросы ручного привода тормоза, шланги гибкие переднего и заднего тормоза, водяной и электробензонасосы, расширительный бачок и его компоненты.

24 МЕСЯЦА

Аккумуляторные батареи.

12 МЕСЯЦЕВ или 35 000 КМ ПРОБЕГА

Амортизаторы, подшипники качения, элементы системы отработавших газов, в том числе каталитические нейтрализаторы, датчики содержания кислорода.

Гарантия не распространяется на:

— Коррозионные процессы крепежных деталей, деталей подвески, трансмиссии, двигателя, элементов кузова и его отделки, деталей, не являющихся элементами кузова (диски колес, детали выхлопной системы и т. д.), которые могут проявиться в процессе эксплуатации автомобиля.

— Повреждения лакокрасочного покрытия кузова (сколы, царапины, истирания), в т. ч. эрозионный износ других защитных покрытий (сколы, истирание мастики и грунта), истирание лакокрасочного покрытия кузова по местам контакта сопрягаемых деталей, потеря блеска, помутнение, обесцвечивание, возникшие в процессе эксплуатации автомобиля. Коррозионные поражения кузова: стыков деталей, сварных швов, мест установок облицовок боковых стекол и мест креплений резьбовых соединений.

— Нормальные уровни шума и вибрации.

— На неисправности и повреждения, непосредственной или косвенной причиной которых могло стать проведение демонтажа, разборки и ремонта комплектующих изделий, деталей, узлов, агрегатов или автомобиля в целом, а также работ по установке любого дополнительного оборудования, замены или модификации программного обеспечения контроллеров неуполномоченными организациями изготовителя, а также внесение изменений в конструкцию автомобиля.

— На неисправности и повреждения деталей, узлов и агрегатов автомобиля при отсутствии или повреждении идентификационной маркировки изготовителя на них.

— Неисправности, возникшие в результате неустранения или несвоевременного устранения других неисправностей после их обнаружения уполномоченной организацией изготовителя, а также возникшие в результате выполнения работ в неуполномоченных организациях изготовителя.

— Регламентные работы при плановых технических обслуживаниях, включая диагностические и регулировочные работы, а также расходуемые при этом материалы и комплектующие.

— Неисправности, возникшие в результате применения не рекомендованных изготовителем эксплуатационных материалов, масел и топлива.

— Расходные автокомпоненты, в том числе горюче-смазочные материалы и эксплуатационные жидкости всех систем автомобиля, щетки стеклоочистителя, предохранители, фильтры, лампы, свечи зажигания, приводные ремни и соответствующие ролики, шины, тормозные колодки, диски и барабаны, выжимной подшипник и диски сцепления.
В случае проявления дефекта изготовления или брака материала эти детали заменяются по гарантии.

— Неисправности и повреждения в результате механического, химического, термического или иного внешнего воздействия в следующих случаях:

• дорожно-транспортные происшествия, удары, царапины, следы попадания камней и других твердых предметов, град, действия третьих лиц;
• воздействие химически активных веществ, загрязняющих окружающую среду, в том числе применяемых для предотвращения замерзания поверхности дорог, веществ растительного происхождения и продуктов жизнедеятельности животных;
• неисправности и повреждения, в том числе деталей трансмиссии, подвески и рулевого управления, кузова автомобиля, возникшие из-за ошибочных действий при управлении автомобилем, неаккуратного вождения по неровному дорожному покрытию или перевозки грузов с нагрузкой, превышающей допустимые нормы и сопряженных с ударными нагрузками на детали автомобиля;
• применение некачественного топлива;
• обстоятельства непреодолимой силы (молния, пожар, наводнение, землетрясение, военные действия, теракты и т. д.).

Окончательное решение по обнаруженным на автомобиле неисправностям принимает продавец, изготовитель или уполномоченная организация изготовителя.

ГАРАНТИЙНЫЙ СРОК НА НОВЫЙ АВТОМОБИЛЬ LADA 4х4

24 МЕСЯЦА ИЛИ 50 000 КМ ПРОБЕГА

Срок гарантии 6 лет на все детали кузова автомобилей LADA от сквозной коррозии.

Гарантийный срок исчисляется со дня передачи автомобиля первому владельцу.

В течение гарантийного срока ПАО «АВТОВАЗ» обязуется устранять неисправности, возникшие в процессе эксплуатации автомобиля, при условии соблюдения клиентом правил.

Гарантийные обязательства действительны при своевременном выполнении планового технического обслуживания.

Гарантия на отдельные комплектующие изделия:

24 МЕСЯЦА ИЛИ 35 000 КМ ПРОБЕГА

Раздаточная коробка и промежуточные валы, Наконечники, стойки, втулки рулевых тяг и стабилизаторы поперечной устойчивости, шаровые шарниры, сайлент-блоки, резинометаллические шарниры, опоры и буферы хода сжатия стоек, рычагов подвесок и силовых агрегатов, привода ведущих колес с защитными чехлами, резиновые шланги и патрубки, фары, выключатели, переключатели и приборы управления компонентами (модули управления: светотехникой, стеклоподъемниками, обогревом сидений), тросы ручного привода тормоза, шланги гибкие переднего и заднего тормоза, водяной и электробензонасосы, расширительный бачок и его компоненты.

24 МЕСЯЦА

Аккумуляторные батареи.

12 МЕСЯЦЕВ ИЛИ 35 000 КМ ПРОБЕГА

Амортизаторы, подшипники качения, элементы системы отработавших газов.

Гарантия не распространяется на:

— Неисправности, возникшие в результате применения не рекомендуемых ПАО «АВТОВАЗ» эксплуатационных материалов, масел и топлива.

— Нормальные уровни шума и вибраций.

— Неисправности, возникшие в результате не устранения или несвоевременного устранения других неисправностей после их обнаружения официальным сервисом LADA, а также возникшие в результате выполнения работ в неофициальных сервисах (не уполномоченных ПАО «АВТОВАЗ» организациях).

— Неисправности и повреждения, непосредственной или косвенной причиной которых могло стать проведение демонтажа, разборки и ремонта комплектующих изделий, деталей, узлов, агрегатов или автомобиля в целом, а также работ по установке любого дополнительного оборудования, замена или модификация программного обеспечения контроллеров не официальными сервисами (неуполномоченными ПАО «АВТОВАЗ» организациями), а также изменения в конструкции автомобиля.

— Расходные автокомпоненты, в том числе горюче-смазочные материалы и эксплуатационные жидкости всех систем автомобиля, щетки стеклоочистителя, предохранители, фильтры, лампы, свечи зажигания, приводные ремни и соответствующие ролики, шины, тормозные колодки, диски и барабаны, выжимной подшипник и диски сцепления.

— Коррозионные процессы крепежных деталей, деталей подвески, трансмиссии, двигателя, элементов кузова и его отделки, а также деталей, не являющихся элементами кузова (диски колес, детали выхлопной системы и т.д.), которые могут проявляться в процессе эксплуатации автомобиля.

— На повреждения и неисправности деталей, узлов и агрегатов автомобиля при отсутствии или повреждении идентификационной маркировки на них.

— Повреждения лакокрасочного покрытия кузова (сколы, царапины, истирания), в том числе эрозионный износ других защитных покрытий (сколы, истирание мастики и грунта), истирание лакокрасочного покрытия кузова по местам контакта сопрягаемых деталей, потеря блеска, помутнение, обесцвечивание, возникшее в процессе эксплуатации автомобиля. Коррозионные поражения кузова: стыков деталей, сварных швов, мест установок облицовок боковых стекол и мест крепления резьбовых соединений.

— Неисправности и повреждения в результате механических, химических, термических или иных внешних воздействий в следующих случаях:

• ДТП, удары, царапины, следы попадания камней и других твердых предметов, град, действия третьих лиц;
• воздействие химически активных веществ, загрязняющих окружающую среду, в том числе применяемых для предотвращения замерзания поверхности дорог, веществ растительного происхождения и продуктов жизнедеятельности животных;
• неисправности и повреждения, в том числе деталей трансмиссии, подвески и рулевого управления, кузова автомобиля, возникшие из-за ошибочных действий при управлении автомобилем, неаккуратного вождения по неровному дорожному покрытию или перевозки грузов с нагрузкой, превышающий допустимые нормы и сопряженных с ударными нагрузками на детали автомобиля;
• применение некачественного топлива;
• обстоятельства непреодолимой силы (молния, пожар, наводнение, землетрясение, военные действия, теракты и т.д.).

Окончательное решение по устранению неисправности на автомобиле принимает официальный сервис LADA или ПАО «АВТОВАЗ».

ГАРАНТИЙНЫЙ СРОК НА НОВЫЙ АВТОМОБИЛЬ LADA Largus

36 МЕСЯЦЕВ ИЛИ 100 000 КМ ПРОБЕГА

Гарантийный срок исчисляется со дня передачи автомобиля первому владельцу.

В течение гарантийного срока ПАО «АВТОВАЗ» обязуется устранять неисправности, возникшие в процессе эксплуатации автомобиля, при условии соблюдения клиентом правил.

Гарантийные обязательства действительны при своевременном выполнении планового технического обслуживания.

Гарантия на отдельные комплектующие изделия:

24 МЕСЯЦА ИЛИ 60 000 КМ ПРОБЕГА

Аккумуляторные батареи.

50 000 КМ ПРОБЕГА

Рулевые тяги и наконечники, стойки и втулки стабилизатора поперечной устойчивости, сайлент-блоки, резинометаллические опоры и шаровые шарниры деталей подвески и силовых агрегатов.

24 МЕСЯЦА ИЛИ 30 000 КМ ПРОБЕГА

Амортизаторы и стойки телескопические передней подвески.

30 000 КМ ПРОБЕГА

Выжимной подшипник и диски сцепления, элементы системы отработавших газов, в том числе каталитические нейтрализаторы, датчики концентрации кислорода.

Гарантия не распространяется на:

— Неисправноcти, в результате применения не рекомендованных ПАО «АВТОВАЗ» эксплуатационных материалов, масел и топлива.

— Нормальные уровни шума и вибраций.

— Неисправности, возникшие в результате не устранения или не своевременного устранения других неисправностей после их обнаружения официальным сервисом LADA.

— Неисправности и повреждения, непосредственной или косвенной причиной которых могло стать проведение демонтажа, разборки и ремонта комплектующих изделий, деталей, узлов, агрегатов или автомобиля в целом, а также работ по установке любого дополнительного оборудования в условиях не официального сервиса (не уполномоченной ПАО «АВТОВАЗ» организации), а также внесение изменений в конструкцию автомобиля.

— Расходные автокомпоненты, в том числе горюче-смазочные материалы и эксплуатационные жидкости всех систем автомобиля, щетки стеклоочистителя, предохранители, фильтры, лампы, свечи зажигания, приводные ремни и соответствующие ролики, тормозные колодки, диски и барабаны.

— Коррозионные процессы деталей подвески, трансмиссии, двигателя и кузова, элементы отделки кузова и деталей, не являющихся элементами кузова (диск колес, детали выхлопной системы и т.д.).

— Повреждение лакокрасочного покрытия (сколы, царапины, истирания), в том числе эрозионный износ других защитных покрытий (сколы, истирание мастики и грунта), истирание по местам контакта сопрягаемых деталей, потеря блеска, помутнение, обесцвечивание, возникшие в процессе эксплуатации автомобиля.

— На повреждения и неисправности деталей, узлов и агрегатов автомобиля при отсутствии или повреждении идентификационной маркировки на них.

— Неисправности и повреждения в результате механических, химических, термических или иного внешнего воздействия в следующих случаях:

• ДТП, удары, царапины, следы попадания камней и других твердых предметов, град, действия третьих лиц;
• воздействие химически активных веществ, загрязняющих окружающую среду, в том числе применяемых для предотвращения замерзания поверхности дорог, веществ растительного происхождения и продуктов жизнедеятельности животных;
• неисправности и повреждения, в том числе деталей трансмиссии, подвески и рулевого управления, кузова автомобиля, возникшие из-за ошибочных действий при управлении автомобилем, неаккуратного вождения по неровному дорожному покрытию или перевозки грузов с нагрузкой, превышающий допустимые нормы и сопряженных с ударными нагрузками на детали автомобиля;
• применение некачественного топлива;
• обстоятельства непреодолимой силы (молния, пожар, наводнение, землетрясение, военные действия, теракты и т.д.).

Окончательное решение по устранению неисправности на автомобиле принимает официальный сервис LADA или ПАО «АВТОВАЗ».

Большой тест: Kia Rio X-Line, Renault Sandero Stepway, Lada X-Ray Cross | Тест-драйвы

Способ переделки обычного хетчбека в кросс-хетч довольно прост: пару сантиметров к дорожному просвету, за счет удлиненных пружин и штоков амортизаторов, плюс пластиковый обвес по нижнему периметру кузова. По такому рецепту сделаны Kia Rio X-Line и Renault Sandero Stepway. У Лады X-Ray Cross отличий от донорского Иксрея на два порядка больше. Кроме новых упругих элементов – «по кругу», тут оригинальный передний подрамник в купе с рычагами и поворотными кулаками. А так же новый электроусилитель руля калужского завода «Автоэлектроника».

От обычного Иксрея, Cross отличается не только обвесом и колесами, но и бамперами с продолжением х-образных подштамповок

Передняя колея X-Ray Cross шире на 19 мм, а задняя на все 54 мм. Любопытно, но инициаторами широкой колеи были не инженеры, а главный вазовский художник Стив Маттин. Англичанин настоял на том, что бы колеса кросс-хетча стояли ближе к аркам, так по мнению мэтра, автомобиль выглядит цельно сбитым и основательным. Кто бы спорил! Кроме того Маттин хотел установить на Cross 18-дюймовые колеса, но после обсуждения заводчане сошлись на компромиссной обувке R17. Что для компактной машинки В-класса тоже не мало. К примеру, Kia и Renault укомплектованы колесами на размер меньше.

Угловатый дизайн передней панели Лады – на любителя. Однако в отличии от Renault рулевая колонка регулируется по углу наклона и вылету, что обеспечивает водителю более удобную посадку

Среди участников теста, только у вазовского паркетника есть внедорожный ассистент. Система Lada Ride Select попутно отвечает и за активацию спорт-режима. Кроме того тут новые передние кресла и регулируемая по вылету рулевая колонка. Пусть диапазон перемещения телескопического механизма всего 42 мм, но это именно те миллиметры, которые позволяют распрямить конечности и найти более удобную посадку, чем в соплатфоменном Sandero.

Система Lada Ride Select не заменит механический полный привод, но и считать оную бесполезной безделушкой тоже не стоит. Мы проверили – на бездорожье ассистент реально помогает

Среди мелких изменений интерьера: именные накладки на порогах, комбинация приборов с оранжевой подложкой, а так же обогревы руля и сидений. Причем передние грелки – трехрежимные, с автоматическим снижением интенсивности нагрева. У обычного Иксрея таких нет. Наконец у «Кросса» улучшена шумоизоляция салона. Кроме снижения шума как такового, это положительно повлияло и на звучание штатной аудиосистемы. При тех же компонентах, что и у Renault «музыка» в Ладе играет детальней и глубже.

Недавний рестайлинг освежил внешность Степвея добавив недорогому хетчбеку лоска

У Sandero Stepway, построенного на той же несовершенной платформе В0, что и X-Ray Cross регулируемой по вылету рулевой колонки как не было так и нет. Посадку водителя усугубляет кресло неоптимальной формы: подушка тут уж очень короткая, спинка плохо фиксирует тело, а подголовник не обеспечивает опоры затылку. Нет тут и камеры заднего вида, которая присутствует в дорогих версиях Лады и Kia, а так же обогревов руля и заднего дивана. Зато на втором ряду места чуть больше, чем в соплатформенном Иксрее, а сама «сидушка» с мягким наполнителем более удобна.

В интерьере Stepway не найти отличий от обычного Sandero. Пластик жесткий, но качество материалов вполне приличное

Но комфортней всего пассажирам будет в Kia. По запасу пространства на втором ряду Rio X-Line – рекордсмен. Да и водителю грех жаловаться, под ним отлично спрофилированное кресло. Перед глазами читабельная комбинация приборов с крупными шкалами, эргономика продумана до мелочей: все крутилки-кнопочки на своих местах, искать ничего не приходится. Жаль дисплей мультимедийной системы мелковат и расположен почти вертикально. На солнце экранчик нещадно бликует. Впрочем, за Renault и Ладой водится тот же грешок.

Обычный хетчбек Rio в России не представлен, альтернатива седану предлагается с псевдовнедорожным пакетом X-Line

Еще отметим, что в Kia самая легковая посадка, как в обычном Rio – привыкать и переучиваться не придется. Водители соплатформенных Sandero Stepway и X-Ray Cross восседают над дорогой заметно выше. С одной стороны капитанская посадка обеспечивает лучшую обзорность, с другой – присутствует некое ощущение отстраненности от автомобиля. Со временем к этой особенности привыкаешь, но на первых порах подсознательно тянешься рукой к домкратику регулировки кресла, что бы опуститься пониже.

Эргономика продумана почти до мелочей, но искать мягкий пластик в салоне Rio X-Line бесполезно

Наиболее широкий выбор силовых агрегатов у Renault. Кроме старых моторов К4М (1.6 л., 82 л.с. и 1.6 л., 102 л.с.), в гамме присутствует ниссановский движок того же объема (113 л.с.). И трансмиссии, что называется в ассортименте: «механика», «автомат», вариатор. У Kia два мотора (1.4 л., 100 л.с. и 1.6 л., 123 л.с.) и две шестиступенчатых коробки: «механика» и «автомат». А вот у Лады альтернативы «атмосфернику» 1.8 л. (122 л.с.) агрегатированным с пятиступенчатой механической трансмиссией нет. «Робот» АМТ, как и двигатель 1.6 – в перспективе.

Renault Sandero Stepway

Kia Rio X-Line

Lada X-Ray Cross

С маркетинговой точки зрения отсутствие двухпедальной модификации – серьезный «косяк». Но и физически X-Ray Cross с «механикой» далек от совершенства. Что бы тронуться с места без рывка приходится ювелирно работать совершенно неинформативным акселератором и длинноходным сцеплением. Чуть ошибся и Lada прыгает с места. Легковесная педаль газа усложняет движение в пробках, а также на грунтовке, когда нужно проехать неровный участок черепашьим шагом.

Управляемость с перчинкой. В повороте задняя ось доворачивает кросс-хетч по вертикальной оси. Однако заноса можно не опасаться, благодаря толково настроенной системе стабилизации

Двигатель 1.8 тоже – вещь в себе. На холостом ходу он не только нагружает вибрациями органы управления, но и заполняет салон громким и не слишком приятным уху урчанием. До 2000 об/мин движок с индексом 21179 спит крепким сном, лишая возможности двигаться в натяг. Зато преодолев трехтысячную отметку тахометра, просыпается активным подхватом, который не скисает вплоть до электронной отсечки. В общем, гонять на X-Ray Cross куда проще и интересней, чем двигаться в рамках законопослушных скоростей.

В движении превалирует голос мотора, который перекрывает шум шин и завывания ветра

К механической коробке вопросов считай нет. Ходы невелики, избирательность рычага на твердую «четверку». Жаль передач тут всего пять, причем довольно коротких. Разогнавшись, так и хочется подоткнуть несуществующую, шестую ступень, что бы приглушить навязчивый шум мотора и снизить его аппетит. Все таки девять литров «на сотню» в смешанном цикле, многовато, для столь компактного автомобиля.

На газ Renault реагирует с ощутимыми задержками. Разгонная динамика самая скромная из участников теста

Однако 113-сильный Sandero Stepway при том же темпе движения потребляет еще где-то на 0,3 литра больше. А если на полдня застрять в глухой пробке, на дисплейчике комбинации приборов и вовсе высветится «десятка». При этом какой то выдающейся динамикой Renault не отличается: не густо, но и не пусто, в общем – середнячок.

А вот ниссановский вариатор, который начали ставить на Степвэи после рестайлинга порой заслуживает крепкого словца. Нет, сам агрегат в принципе не плох: умело имитирует смены передач, не размазывает сопли по шкивам при интенсивных разгонах и даже тормозит двигателем при снижении скорости. Однако из-за неудачных настроек электронного софта, реагирует на подачу топлива с неприличной задумчивостью, что бы добиться сколь ни будь заметного ускорения, педаль газа приходится прожимать аж на половину хода. Но и после этого приходится ждать: сначала повышаются обороты мотора и только после этого автомобиль начинает нехотя ускоряться.

Подвеска Renault дает меньше комфорта, нежели Lada и тем более Kia, Но при этом его салон лучше других изолирован от внешних шумов

Rio X-Line жертвоприношений не требует. Переводишь селектор классического «автомата» в драйв, добавляешь тягу точным акселератом и корейский «кроссовок» мягко отчаливает с места. Хочешь ускоряйся плавно, хочешь – жги резину в пробуксовке колес, Kia с легкостью принимает любые правила игры. Причем всегда выполняет команды, так как ожидает водитель. Ну почти всегда.

Связь силового агрегата с ведущими колесами хотелось бы все же покрепче. Ну или хотя бы наличие обостряющего отклики режима Sport, что бы самому влиять на взаимосвязь с мотором. «Автомат» в плавности переключений не упрекнуть – тут все гладко, но вот их частота порой раздражает. Понижающие смены происходят при каждой мало-мальской подаче топлива, то есть коробка не позволяет мотору раскручиваться в пределах одной передачи. Меж тем силенок корейскому «атмосфернику» 1.6 вполне хватает. И зверским аппетитом тот не страдает – 8,6 л на 100 км пути.

В поворотах Rio X-Line демонстрирует завидную стабильность и нейтральные повадки. Обратная связь на руле возрастает равномерно углу поворота рулевого колеса

Управляется Kia надежно. Руль на малых скоростях почти невесом, но с ростом скорости тяжелеет, позволяя вести автомобиль по прямой без вихляний и подруливаний. При отклонениях баранки появляется и обратная связь. Крены кузова в поворотах не пугают, достигнув предела по сцеплению шин Rio X-Line безопасно смещается наружу поворота в сносе передних колес. Одним словом – отличник.

В движении салон Rio X-Line наполняется шинным гулом

Sandero Stepway едет иначе. Руль неоправданно тяжел во всех режимах, вместо обратной связи – густое фоновое усилие. Да и крены в поворотах самые ощутимые из всей троицы. Зажигать на Renault как-то не тянет. А вот X-Ray Cross будто сам подначивает водителя промчать по извилистой дорожке. Пусть руль Лады отличается слишком высоким возвратным усилием, но при этом выдает самую честную информацию о положении управляемых колес. В быстрых поворотах задняя ось немного доворачивает кроссовер, смещая баланс управляемости в сторону избыточности. Но от скольжений ее страхует строгая система стабилизации.

Самый скромный дорожный просвет у Kia – 190 мм. У Renault под днищем всего на 5 мм больше, но по факту Stepway лучше приспособлен для бездорожья. Клиренсу Лады позавидуют иные внедорожники – 215 мм. При этом у «Кросса» самая короткоходная задняя подвеска

А кто самый комфортный в нашей троице? Вновь – Kia! Подвеска чуть жестче, чем у седана Rio, что особенно заметно на неровностях с острыми краями, но с остальным дорожным браком она расправляется вполне уверенно. Правда по энергоемкости упругих элементов Renault и Lada превосходят «корейца», крупные ямы эта парочка утюжит без пробоев и ударов. Особенно преуспевает в этом X-Ray Cross, который отлично расправляется как глубокими рытвинами, так и с лежачими полицейскими. И это на «семнадцатых» колесах!

Kia Rio X-Line

Багажный отсек Kia с простенькой отделкой вмещает 390-1075 л поклажи. Под полом полноразмерное запасное колесо

Renault Sandero Stepway

Багажник Renault объемом 320 л отделан опрятней чем в Kia, но лишен фурнитуры в виде крючков и кармашков. В нише лежит полноразмерное запасное колесо

Lada X-Ray Cross

Только в багажнике Лады есть двухуровневый пол. Но даже если удалить перегородку, объем отсека составит скромные 361 л. Запасное колесо – полноценное

Подвеска Sandero Stepway менее всеядна. При попадании колеса в яму комфорт в салоне почти не страдает, но если на пути бугорок или тот же лежачий полицейский, тряханет так, что можно и язык прикусить. Судя по всему, из-за лифтинга кузова, амортизаторы Renault по разному работают при отбое и сжатии. Но вот, что интересно, стоит выехать на Степвэе на неровный проселок и от рассогласованности не остается и следа. По колдобинам можно мчать на всех парах. X-Ray Cross в тех же условиях ни чуть не хуже, а вот Rio X-Line отстает. Из-за меньшего дорожного просвета и внушительного переднего свеса за рулем Kia приходится тщательнее выбирать маршруты, а иногда и искать пути объезда.

Флуоресцентная микроскопия с резонансным переносом энергии (FRET) — Общие понятия

Вводные понятия

Точное расположение и природа взаимодействий между конкретными молекулярными видами в живых клетках представляет большой интерес во многих областях биологических исследований, но исследованиям часто мешает ограниченное разрешение инструментов, используемых для изучения этих явлений. Обычная широкопольная флуоресцентная микроскопия позволяет локализовать флуоресцентно меченые молекулы в пределах оптического пространственного разрешения, определенного критерием Рэлея, примерно 200 нанометров (0.2 мкм). Однако для понимания физических взаимодействий между белками-партнерами, участвующими в типичном биомолекулярном процессе, относительная близость молекул должна быть определена более точно, чем позволяют традиционные методы оптической визуализации с дифракционным ограничением. Метод резонансного переноса энергии флуоресценции (чаще обозначаемый аббревиатурой FRET ) в применении к оптической микроскопии позволяет определять сближение двух молекул в пределах нескольких нанометров (см. Рисунок 1), расстояние, достаточно близкое для происходить молекулярные взаимодействия.

Типичные методы флуоресцентной микроскопии основаны на поглощении флуорофором света на одной длине волны (возбуждение) с последующим испусканием вторичной флуоресценции на более длинной длине волны. Длины волн возбуждения и излучения часто отделены друг от друга на десятки и сотни нанометров. Маркировка клеточных компонентов, таких как ядра, митохондрии, цитоскелет, аппарат Гольджи и мембраны, специфическими флуорофорами позволяет их локализовать в фиксированных и живых препаратах.Путем одновременного мечения нескольких субклеточных структур отдельными флуорофорами, имеющими отдельные спектры возбуждения и испускания, можно использовать специальные комбинации флуоресцентных фильтров для изучения близости меченых молекул в пределах одной клетки или участка ткани. С помощью этого метода молекулы, которые расположены ближе друг к другу, чем предел оптического разрешения, кажутся совпадающими, и эта очевидная пространственная близость подразумевает, что молекулярная ассоциация возможна. В большинстве случаев, однако, нормального разрешения флуоресцентного микроскопа с ограничением дифракции недостаточно, чтобы определить, действительно ли имеет место взаимодействие между биомолекулами.Флуоресцентный резонансный перенос энергии — это процесс, при котором происходит безызлучательная передача энергии от флуорофора в возбужденном состоянии ко второму хромофору в непосредственной близости. Поскольку диапазон, в котором может происходить передача энергии, ограничен примерно 10 нанометрами (100 ангстрем), а эффективность передачи чрезвычайно чувствительна к расстоянию между флуорофорами, измерения резонансной передачи энергии могут быть ценным инструментом для исследования молекулярных взаимодействий. .

Механизм резонансной передачи энергии флуоресценции включает в себя флуорофор донора в возбужденном электронном состоянии, который может передавать свою энергию возбуждения соседнему хромофору акцептора без излучения посредством диполь-дипольных взаимодействий на большие расстояния. Теория, поддерживающая передачу энергии, основана на концепции рассмотрения возбужденного флуорофора как колеблющегося диполя, который может подвергаться обмену энергией со вторым диполем, имеющим аналогичную резонансную частоту.В этом отношении резонансная передача энергии аналогична поведению связанных осцилляторов, таких как пара камертонов, колеблющихся на одной и той же частоте. Напротив, радиационная передача энергии требует испускания и повторного поглощения фотона и зависит от физических размеров и оптических свойств образца, а также от геометрии контейнера и путей волнового фронта. В отличие от радиационных механизмов, резонансный перенос энергии может дать значительный объем структурной информации о донорно-акцепторной паре.

Резонансная передача энергии нечувствительна к окружающей оболочке растворителя флуорофора и, таким образом, дает молекулярную информацию, уникальную по сравнению с той, которая выявляется с помощью зависящих от растворителя событий, таких как гашение флуоресценции, реакции возбужденного состояния, релаксация растворителя или измерения анизотропии. Основное влияние растворителя на флуорофоры, участвующие в резонансном переносе энергии, — это влияние на спектральные свойства донора и акцептора. Безызлучательный перенос энергии происходит на гораздо больших расстояниях, чем краткосрочные эффекты растворителя, и диэлектрическая природа компонентов (растворителя и макромолекулы хозяина), расположенных между задействованными флуорофорами, очень мало влияет на эффективность резонансной передачи энергии, которая зависит в первую очередь от расстояние между донорным и акцепторным флуорофором.

Явление резонансной передачи энергии флуоресценции не опосредовано испусканием фотонов и, более того, даже не требует, чтобы акцепторный хромофор был флуоресцентным. Однако в большинстве приложений и донор, и акцептор являются флуоресцентными, и возникновение переноса энергии проявляется в тушении донорной флуоресценции и сокращении времени жизни флуоресценции, сопровождаемом также увеличением эмиссии флуоресценции акцептора. Эффективность процесса передачи энергии изменяется пропорционально обратной шестой степени расстояния, разделяющего молекулы донора и акцептора.Следовательно, измерения FRET могут использоваться в качестве эффективной молекулярной линейки для определения расстояний между биомолекулами, помеченными соответствующим донорным и акцепторным флуорохромом, когда они находятся в пределах 10 нанометров друг от друга.

Гипотетический пример резонансного переноса энергии флуоресценции между двумя флуорохромами, прикрепленными к противоположным концам одного и того же макромолекулярного белка, представлен на рисунке 1. В нативной конформации (рисунок 1 (а)) два флуорофора разделены расстоянием приблизительно 12 нанометров, слишком далеко для передачи энергии внутримолекулярного резонанса между флуорохромами.Однако, когда белок подвергается конформационному изменению (рис. 1 (b)), два флуорохрома сближаются гораздо ближе и теперь могут участвовать в молекулярных взаимодействиях FRET. На рисунке возбуждение донорного флуорохрома показано синим свечением вокруг желтой трехъядерной ароматической молекулы, в то время как соответствующая акцепторная эмиссия (рисунок 1 (b)) представлена ​​зеленым свечением, окружающим второй гетероциклический флуорохром справа. -ручная сторона белка.Измерения передачи энергии часто используются для оценки расстояний между участками макромолекулы и влияния конформационных изменений на эти расстояния. В этом типе экспериментов степень передачи энергии используется для расчета расстояния между донором и акцептором и получения структурной информации о макромолекуле.

Хотя флуоресцентный резонансный перенос энергии часто использовался для исследования межмолекулярных и внутримолекулярных структурных и функциональных модификаций белков и липидов, основным препятствием для реализации методов FRET-микроскопии в живых клетках было отсутствие подходящих методов мечения конкретных внутриклеточных белки с соответствующими флуорофорами.Клонирование зеленого флуоресцентного белка медузы ( GFP ) и его экспрессия в самых разных типах клеток стали критическим ключом к разработке маркеров как для экспрессии генов, так и для структурной локализации белка в живых клетках. Было разработано несколько вариантов мутации этого белка, различающихся по спектру, включая флуоресцентный белок, излучающий синий свет ( синий флуоресцентный белок , BFP ). Спектры возбуждения и излучения для нативных мутантов GFP и BFP достаточно разделены по длинам волн, чтобы быть совместимыми с подходом FRET.Рисунок 2 иллюстрирует стратегию обнаружения белок-белковых взаимодействий с использованием флуоресцентного резонансного переноса энергии и мутантных флуоресцентных белков. Если два белка, один из которых мечен BFP (донор), а другой — GFP (акцептор), физически взаимодействуют, то при возбуждении комплекса на длине волны максимального поглощения будет наблюдаться повышенная интенсивность в максимуме эмиссии акцептора (510 нанометров). (380 нм) донора. Неспособность белков образовать комплекс не приводит к эмиссии акцептора (GFP) флуоресценции.

В сочетании с достижениями в области импульсных лазеров, микроскопической оптики и компьютерных технологий визуализации разработка методов маркировки, в которых донорные и акцепторные флуорофоры фактически являются частью самих биомолекул, позволила визуализировать динамические взаимодействия белков в живых клетках. В дополнение к изучению взаимодействий белковых партнеров, недавние применения флуоресцентного резонансного переноса энергии включают исследования активности протеаз, изменений потенциалов мембранного напряжения, метаболизма кальция и проведение высокопроизводительных скрининговых анализов, таких как количественная оценка экспрессии генов в одиночные живые клетки.

Принципы передачи энергии резонанса флуоресценции

Процесс резонансной передачи энергии ( RET ) может иметь место, когда донорный флуорофор в электронно возбужденном состоянии передает свою энергию возбуждения соседнему хромофору, акцептору. В принципе, если спектр излучения флуоресценции молекулы-донора перекрывает спектр поглощения молекулы-акцептора и они находятся в пределах минимального пространственного радиуса, донор может напрямую передавать свою энергию возбуждения акцептору через диполь-дипольные межмолекулярные соединения на большие расстояния. связь.Теория, предложенная Теодором Фёрстером в конце 1940-х годов, первоначально описывала молекулярные взаимодействия, участвующие в резонансной передаче энергии, и Фёрстер также разработал формальное уравнение, определяющее взаимосвязь между скоростью передачи, межхромофорным расстоянием и спектральными свойствами задействованных хромофоров.

Резонансная передача энергии — это безызлучательный квантово-механический процесс, который не требует столкновения и не требует выделения тепла. Когда происходит передача энергии, молекула-акцептор гасит флуоресценцию молекулы-донора, и если акцептор сам является флуорохромом, наблюдается повышенное или сенсибилизированное излучение флуоресценции (см. Рисунок 3).Это явление можно наблюдать, возбуждая образец, содержащий как донорные, так и акцепторные молекулы, светом с длинами волн, соответствующими максимуму поглощения донорного флуорофора, и детектируя свет, излучаемый с длинами волн с центром вблизи максимума излучения акцептора. Альтернативный метод обнаружения, быстро набирающий популярность, заключается в измерении времени жизни флуоресценции донорного флуорофора в присутствии и в отсутствие акцептора.

На рисунке 3 представлена ​​диаграмма Яблонского, иллюстрирующая связанные переходы между испусканием донора и поглощением акцептора при резонансном переносе энергии флуоресценции.Абсорбционные и эмиссионные переходы представлены прямыми вертикальными стрелками (зелеными и красными соответственно), а колебательная релаксация — волнистыми желтыми стрелками. Связанные переходы показаны пунктирными линиями, что указывает на их правильное расположение на диаграмме Яблонского, если они возникли в результате опосредованных фотонами электронных переходов. В присутствии подходящего акцептора донорный флуорофор может передавать энергию возбужденного состояния непосредственно акцептору, не испуская фотон (показано синей стрелкой на рисунке 3).Получающееся в результате сенсибилизированное флуоресцентное излучение имеет характеристики, аналогичные спектру излучения акцептора.

Чтобы произошла резонансная передача энергии, необходимо выполнить несколько критериев. В дополнение к перекрывающимся спектрам излучения и поглощения донорных и акцепторных молекул, два задействованных флуорофора должны располагаться на расстоянии от 1 до 10 нанометров друг от друга. Как описано в уравнениях, выведенных Фёрстером (и обсуждаемых ниже), эффективность передачи энергии между донорными и акцепторными молекулами уменьшается в шестой степени расстояния, разделяющего их.Следовательно, способность донорного флуорофора передавать свою энергию возбуждения акцептору за счет безызлучательного взаимодействия резко снижается с увеличением расстояния между молекулами, ограничивая явление FRET максимальным радиусом разделения донор-акцептор приблизительно 10 нанометров. На расстояниях менее 1 нанометра возможны несколько других режимов передачи энергии и / или электронов. Зависимость процесса резонансной передачи энергии от расстояния является основной основой его полезности при исследовании молекулярных взаимодействий.В исследованиях живых клеток с участием молекул, меченных донорными и акцепторными флуорофорами, резонансная передача энергии будет происходить только между молекулами, которые находятся достаточно близко, чтобы биологически взаимодействовать друг с другом.

Дополнительным требованием для резонансной передачи энергии является то, что время жизни флуоресценции донорной молекулы должно быть достаточным для того, чтобы событие могло произойти. Как скорость ( K (T) ), так и эффективность ( E (T) ) передачи энергии напрямую связаны со временем жизни донорного флуорофора в присутствии и в отсутствие акцептора.Согласно теории Фёрстера и подтвержденной экспериментально, скорость передачи энергии определяется уравнением:

KT = (1 / τD) • [R0 / r] 6

, где R (0) — критическое значение Фёрстера. расстояние , τ (D) — время жизни донора в отсутствие акцептора, а r — расстояние, разделяющее донорные и акцепторные хромофоры. Критическое расстояние Фёрстера ( R (0) ) определяется как радиус разделения акцептор-донор, для которого скорость передачи равна скорости распада донора (снятия возбуждения) в отсутствие акцептора.Другими словами, когда радиус донора и акцептора ( r ) равен расстоянию Ферстера, то эффективность переноса составляет 50 процентов. На этом радиусе разделения половина энергии возбуждения донора передается акцептору за счет резонансной передачи энергии, а другая половина рассеивается за счет комбинации всех других доступных процессов, включая излучение флуоресценции.

Концептуально критическое расстояние Фёрстера — это максимальная длина разделения между донорными и акцепторными молекулами, при которой все еще будет происходить резонансная передача энергии.Значение критического расстояния обычно находится в диапазоне от 2 до 6 нанометров, что, к счастью, порядка многих размеров молекул белка. Кроме того, диапазон критических расстояний также соответствует нескольким другим биологически значимым параметрам, таким как толщина клеточной мембраны и расстояние, разделяющее сайты на белках, имеющих несколько субъединиц. Значение R (0) (в нанометрах) можно рассчитать из следующего выражения:

R0 = 2,11 × 10-2 • [

κ

2 • J (λ) • η-4 • QD] 1/6

, в котором κ -квадрат — коэффициент, описывающий относительную ориентацию в пространстве между переходными диполями донора и акцептора, Дж (λ) — интеграл перекрытия в области излучения донора. и спектры поглощения акцептора (с длиной волны, выраженной в нанометрах), η представляет показатель преломления среды, а Q (D) представляет собой квантовый выход донора.

Эффективность передачи энергии, E (T) , является мерой доли фотонов, поглощенных донором, которые передаются акцептору, и связана с расстоянием разделения донора и акцептора, r , соотношением уравнение:

r = R0 • [(1 / ET) — 1] 1/6

и E (T) вычисляется как:

ET = 1 — (τDA / τD)

, где τ (DA) — время жизни донора в присутствии акцептора, а τ (D) — время жизни донора в отсутствие акцептора.Следовательно, измеряя время жизни донорной флуоресценции в присутствии и в отсутствие акцептора (что указывает на степень тушения донора из-за акцептора), можно определить расстояние, разделяющее молекулы донора и акцептора. Во многих обычно применяемых методах эффективность передачи энергии определяется путем измерения в установившемся режиме относительной средней интенсивности флуоресценции донора в присутствии и в отсутствие акцептора (а не путем измерения времени жизни).

Таким образом, скорость передачи энергии зависит от степени перекрытия спектров между спектрами излучения донора и поглощения акцептора (см. Рисунок 4), квантового выхода донора, относительной ориентации дипольных моментов перехода донора и акцептора, и расстояние, разделяющее молекулы донора и акцептора. Любое событие или процесс, которые влияют на расстояние между донором и акцептором, будут влиять на скорость резонансной передачи энергии, что позволяет количественно оценить явление при условии, что артефакты можно контролировать или устранять.

На рисунке 4 представлены спектры поглощения и излучения голубого флуоресцентного белка ( CFP , донор) и красного флуоресцентного белка ( RFP или DsRed , акцептор) в сравнении с их потенциальным применением в качестве пара резонансного переноса энергии флуоресценции. Спектры поглощения обоих биологических пептидов показаны красными кривыми, а спектры испускания представлены синими кривыми. Область перекрытия спектров излучения донора и поглощения акцептора представлена ​​серой областью у основания кривых.Всякий раз, когда спектральное перекрытие молекул слишком сильно увеличивается, возникает явление, известное как спектральное просачивание или кроссовер , в котором сигнал от возбужденного акцептора (возникающий из возбуждающего освещения донора) и излучение донора обнаруживаются в акцепторный канал излучения. Результатом является высокий фоновый сигнал, который необходимо выделить из излучения слабой флуоресценции акцептора.

Основная теория безызлучательного переноса энергии напрямую применима к паре донор-акцептор, разделенной фиксированным расстоянием, и в этом случае скорость передачи энергии является функцией расстояния Ферстера, R (0) , которое в свою очередь зависит от κ -квадрат, Дж (λ) , η и Q (D) .Если эти факторы известны, можно рассчитать расстояние между донором и акцептором. Для описания таких ситуаций, как множественные акцепторные хромофоры и распределения расстояний, требуются более сложные формулировки. В таблице 1 представлена ​​серия экспериментально измеренных критических расстояний Фёрстера, которые были установлены из спектрального перекрытия нескольких популярных пар донорно-акцепторных флуорофоров. Поскольку переменная включает выход донорного кванта и степень спектрального перекрытия, оба из которых зависят от локализованных условий окружающей среды, значения расстояния Ферстера должны определяться в тех же экспериментальных условиях, что и те, которые используются для исследования резонансного переноса энергии.

Показатель преломления среды передачи энергии обычно известен из состава растворителя или может быть оценен для конкретной макромолекулы и обычно принимается равным 1,4 в водном растворе. Квантовый выход донора определяется путем сравнения со стандартными флуорофорами с известным квантовым выходом. Поскольку Q (D) появляется как шестой корень при вычислении R (0) , небольшие ошибки или неточности в значении Q (D) не имеют большого влияния на расчет расстояния Ферстера.Также из-за зависимости корня шестой степени, R (0) не сильно зависит от вариаций J (λ) , но интеграл перекрытия все равно должен оцениваться для каждой пары донор-акцептор. В общем, более высокая степень перекрытия между спектром излучения донора и спектром поглощения акцептора дает более высокие значения критического расстояния Ферстера.

Критическое расстояние Фёрстера для обычных пар донор-акцептор RET

Донор	Акцептор	Расстояние Ферстера (нанометры)
Триптофан	Дансил	2.1
ИАЭДАНЫ (1)	ДДПМ (2)	2,5 — 2,9
BFP	DsRFP	3,1 — 3,3
Дансил	FITC	3,3 — 4,1
Дансил	Октадецилродамин	4.3
CFP	GFP	4.7 — 4,9
CF (3)	Техасский красный	5.1
Флуоресцеин	Тетраметилродамин	4,9 — 5,5
Cy3	Cy5	> 5,0
GFP	YFP	5,5 — 5,7
BODIPY FL (4)	BODIPY FL (4)	5.7
Родамин 6G	Малахитовый зеленый	6.1
FITC	Эозин тиосемикарбазид	6,1 — 6,4
B-фикоэритрин	Cy5	7.2
Cy5	Cy5.5	> 8,0

(1) 5- (2-иодацетиламиноэтил) аминонафталин-1-сульфоновая кислота
(2) N- (4-диметиламино-3,5-динитрофенил) малеимид
(3) карбоксифлуоресцеинсукцинимидиловый эфир
(4) 4,4-дифтор-4-бора-3a, 4a-диаза-s-индацен

Таблица 1

Неопределенность в оценке фактора ориентации ( κ -квадрат) широко обсуждалась в литературе, и, несмотря на экспериментальные доказательства того, что теория Фёрстера действительна и применима к измерению расстояний, эта переменная продолжала оставаться в силе. несколько спорно.Важно понимать, что расстояния Ферстера обычно приводятся для предполагаемого значения κ в квадрате, обычно это динамически усредненное значение 2/3 (0,67). Это предполагаемое значение является результатом рандомизации ориентации донора и акцептора за счет вращательной диффузии до передачи энергии. Фактор ориентации зависит от относительной ориентации в пространстве диполя излучения донора и диполя поглощения акцептора и может варьироваться от нуля до 4. Значение 1 соответствует параллельным диполям перехода, а значение 4 соответствует диполям, которые оба являются параллельные и коллинеарные.

Из-за отношения корня шестой степени к расстоянию Ферстера, изменение коэффициента ориентации от 1 до 4 приводит только к 26-процентному изменению рассчитанного расстояния, а максимальная погрешность в 35 процентов возможна, когда обычно принимаемое значение 0,67 применяется. Наиболее серьезная потенциальная ошибка возникает, если диполи ориентированы точно перпендикулярно друг другу и соответствующее значение в квадрате κ становится равным нулю. Было использовано несколько методов работы с неопределенностью, включая предположение, что существует ряд статических ориентаций, которые не изменяются в течение времени жизни флуорофора в возбужденном состоянии.Измерения анизотропии флуоресценции для донора и акцептора могут позволить определить пределы для вариации κ в квадрате. Кроме того, использование флуорофоров с низкой поляризацией флуоресценции (из-за излучения нескольких перекрывающихся переходов) снижает неопределенность фактора ориентации. Ограничение возможных значений κ в квадрате таким образом снижает потенциальную ошибку вычисления расстояния до 10 процентов.

Во многих случаях фактор ориентации трудно, а то и невозможно определить, а точное значение переменной часто рассматривается как непреодолимая проблема.Однако некоторые свидетельства указывают на ограничение важности фактора в расчетах резонансного переноса энергии. Сравнение донорных и акцепторных расстояний с использованием методов резонансной спектроскопии переноса энергии и дифракции рентгеновских лучей в значительной степени подтверждает обоснованность принятия значения 0,67 для фактора (как предложено теорией Фёрстера), по крайней мере, для небольших пептидов и белков. Больше неопределенности существует для более крупных белков. Использование этого значения для фактора ориентации допустимо при предположении, что зонды донора и акцептора могут свободно совершать неограниченное изотропное движение.Дальнейшее обоснование получено из экспериментальных доказательств того, что для флуорофоров, прикрепленных одинарной или двойной связью к макромолекулам, сегментарные движения донора и акцептора имеют тенденцию приводить к динамически рандомизированным ориентациям.

Для слабосвязанных флуорохромов свободное вращательное движение вокруг одинарных связей должно позволить использовать среднее значение ориентации, но неограниченное движение молекул, связанных через несколько сайтов связывания, вероятно, не происходит. С другой стороны, крайние значения нуля и 4 для κ -квадрат требуют полной флуоресцентной поляризации донора и акцептора, а это условие маловероятно.Статистические расчеты были представлены некоторыми исследователями, которые утверждают, что расстояния распределения донор-акцептор и их ориентация определяют наблюдаемое среднее расстояние. При условии, что наблюдается некоторое распределение наблюдаемого расстояния (и это не ограничивается слишком близкими расстояниями донора и акцептора относительно R (0) ), можно надежно получить среднее расстояние между флуорофорами и оценить погрешность из-за фактора ориентации .

Зависимость фактора ориентации ( κ в квадрате) от относительной ориентации диполя излучения донора и диполя поглощения акцептора (показано на рисунке 5) дается уравнением:

κ

2 = (cos θT — 3cos θDcos θA) 2 = (sin θD sin θAcos Φ — 2cos θDcos θA) 2

, где θ (T) — угол между диполем эмиссионного перехода донора и диполем перехода поглощения акцептор, θ (D) и θ (A) — это углы между этими диполями и вектором, соединяющим донор и акцептор, а Φ — угол между плоскостями, содержащими два переходных диполя.

Эффективность передачи энергии наиболее чувствительна к изменениям расстояния, когда расстояние между донорами и акцепторами приближается к расстоянию Ферстера ( R (0) ) для двух молекул. Рисунок 6 иллюстрирует экспоненциальную зависимость между эффективностью переноса и расстоянием, разделяющим донор и акцептор. Эффективность быстро увеличивается до 100 процентов, когда расстояние разделения уменьшается ниже R (0) , и, наоборот, уменьшается до нуля, когда r больше, чем R (0) .Из-за сильной (шестой степени) зависимости эффективности переноса от расстояния измерения расстояния разделения донора и акцептора надежны только в том случае, если радиус донора и акцептора находится в пределах расстояния Ферстера в два раза. Когда r составляет приблизительно 50 процентов от R (0) , эффективность резонансной передачи энергии близка к максимальной, и более короткие расстояния не могут быть надежно определены. Когда расстояние донор-акцептор превышает значение R (0) на 50 процентов, наклон кривой настолько пологий, что более длинные разделительные расстояния не разрешаются.

Практическое значение критического расстояния Ферстера состоит в том, что это значение дает представление о диапазоне расстояний разделения, которые могут быть определены FRET для данной пары датчиков (см. Таблицу 1). Поскольку измерение передачи энергии очень чувствительно к изменению расстояния, когда расстояния донор-акцептор близки к расстоянию Ферстера, приблизительные размеры целевого молекулярного взаимодействия являются наиболее важным фактором при выборе пары флуоресцентных красителей.Другие факторы, которые следует учитывать, в зависимости от того, проводятся ли измерения в установившемся режиме или с временным разрешением, включают химическую стабильность, квантовый выход и время жизни флуорофора. Поскольку для обычных методов флуоресцентного резонансного переноса энергии не существует внутреннего эталона расстояния, расстояния, рассчитанные путем измерения эффективности переноса, относятся к расстоянию Ферстера, которое выводится из спектроскопических данных, измеренных на парах донор-акцептор.

Явление резонансной передачи энергии по механизму Ферстера сложно в некоторых аспектах, но простое и надежное по своему результирующему эффекту.Расстояния Ферстера точно предсказываются из спектральных свойств донора и акцептора, и, поскольку никаких исключений из теории еще не выявлено, можно предположить, что резонансная передача энергии происходит при любых условиях, при которых пара молекулы донор-акцептор находится в непосредственной близости. Сложность теории, описывающей перенос диполя, возникает не из-за самого механизма передачи, а из-за наличия распределений расстояний (включая неслучайные распределения) и диффузии молекул донора и акцептора.Когда предпринимаются шаги для усреднения зависимости передачи энергии от расстояния по диапазону геометрий и временных рамок, FRET представляет собой надежный метод исследования пространственного распределения между взаимодействующими молекулами.

Применение методов FRET в оптической микроскопии

Параметры конфигурации микроскопа для исследований флуоресцентного резонансного переноса энергии меняются в зависимости от требований флуорофоров, образца и режима (-ов) визуализации, но практически любой вертикальный или инвертированный микроскоп можно модернизировать для FRET-микроскопия (см. Рисунок 7).В общем, микроскоп должен быть оборудован охлаждаемой и усиленной системой CCD-камеры с высоким разрешением (12 бит), соединенной с качественными интерференционными фильтрами, имеющими низкие уровни перекрестных помех (минимальный уровень блокировки) и полосы пропускания, соответствующие спектрам флуорофора. Чувствительность детектора определяет, насколько узкой может быть полоса пропускания фильтра, при этом сбор данных может продолжаться с приемлемой скоростью с минимальным спектральным сквозным шумом. В большинстве случаев для получения изображений следует использовать одно дихроматическое зеркало, соединенное с колесами или ползунками фильтров возбуждения и излучения, чтобы минимизировать или исключить сдвиги изображения.

В широкоугольной флуоресцентной микроскопии наблюдается испускание флуорофора над и под фокальной плоскостью, что приводит к получению изображений со значительным расфокусированным сигналом, что снижает контраст и приводит к ухудшению качества изображения. Эта проблема усугубляется в микроскопии FRET из-за изначально низких уровней сигнала, возникающих в результате резонансной передачи энергии. Методы цифровой деконволюции могут быть связаны с оптическим секционированием, чтобы уменьшить или исключить сигналы вдали от фокальной плоскости, но этот процесс требует больших вычислительных ресурсов и может быть недостаточно быстрым для многих экспериментов по динамической визуализации FRET.Конфокальные методы лазерного сканирования могут применяться к FRET-микроскопии для значительного улучшения латерального разрешения, позволяя собирать последовательные оптические срезы с интервалами, близкими к реальному времени. Основным недостатком конфокальной микроскопии является ограничение длин волн возбуждения стандартными лазерными линиями, доступными для конкретной системы, что ограничивает выбор пар доноров и акцепторов флуорофора в экспериментах по резонансному переносу энергии. Многофотонное возбуждение также может использоваться в сочетании с методами FRET и меньше повреждает клетки из-за более длинных волн возбуждения.Кроме того, артефакты автофлуоресценции и фотообесцвечивание образца с меньшей вероятностью возникают в ограниченном объеме возбуждения, характерном для многофотонного возбуждения.

Типичная конфигурация микроскопа, способная наблюдать живые клетки в культуре с несколькими мотивами изображения флуоресцентного резонансного переноса энергии, представлена ​​на рисунке 7. Инвертированный микроскоп для культуры тканей оснащен стандартной вольфрам-галогеновой лампой на столбе для исследования и записи. Ячейки используют стандартное светлое поле, фазово-контрастное или дифференциально-интерференционное ( DIC ) освещение.Обратите внимание, что последние два метода усиления контраста можно использовать в сочетании с флуоресценцией, чтобы выявить пространственное расположение флуорофоров в клеточной архитектуре. К тринокулярной головке микроскопа прикреплена стандартная система CCD-камеры с охлаждением Пельтье для получения широкоугольной флуоресценции и получения изображений в светлом поле.

Эксперименты по резонансной передаче энергии проводятся с использованием мультиспектрального освещения с использованием либо широкопольного освещения (дуговая разрядная лампа), либо конфокальной сканирующей приставки в реальном времени, оснащенной высокоскоростной дисковой системой Нипкова.Луч аргонно-криптонового лазера сначала фильтруется через акустооптическое устройство с перестраиваемой длиной волны для выбора конкретных длин волн возбуждения перед прохождением к конфокальной сканирующей головке. Изображения собираются с помощью двух охлаждаемых CCD-камер высокого разрешения Gen III с усиленным охлаждением, считывающих отдельные каналы, и передаются в буфер на главный компьютер. Сканирование образца в боковой ( x и y ) и осевой ( z ) плоскостях позволяет собирать оптические срезы для восстановления трехмерного изображения.Различные программы обработки изображений совместимы с проиллюстрированной конфигурацией микроскопа.

Основываясь на фундаментальных принципах этого явления, при проведении измерений резонансного переноса энергии флуоресценции с помощью оптического микроскопа следует учитывать ряд важных практических моментов:

• Необходимо тщательно контролировать концентрации донорных и акцепторных флуорофоров. Статистически самая высокая вероятность достижения резонансного переноса энергии флуоресценции происходит, когда несколько акцепторных молекул окружают одну донорную молекулу.
• Фотообесцвечивание необходимо устранить, поскольку артефакт может изменить молекулярное соотношение донора и акцептора и, следовательно, измеренное значение процесса резонансной передачи энергии.
• Спектр излучения донорной флуоресценции и спектр поглощения акцептора должны иметь значительную область перекрытия.
• Прямое возбуждение акцептора в диапазоне длин волн, используемом для возбуждения донора, должно быть минимальным. Распространенным источником ошибок в измерениях с помощью FRET-микроскопии в установившемся режиме является обнаружение донорной эмиссии с помощью наборов акцепторных фильтров.
• Длины волн излучения как донора, так и акцептора должны совпадать с максимальным диапазоном чувствительности детектора.
• Спектры поглощения и излучения донора должны иметь минимальное перекрытие, чтобы уменьшить возможность самопереноса от донора к донору.
• Донорная молекула должна быть флуоресцентной и иметь достаточно длительное время жизни, чтобы произошла резонансная передача энергии.
• Донор должен обладать низкой поляризационной анизотропией, чтобы минимизировать неопределенности в значении фактора ориентации (-квадрат).Этому требованию удовлетворяют доноры, испускание которых происходит в результате нескольких перекрывающихся переходов возбуждения.
• При использовании методов маркировки антител биологическая активность реагентов, конъюгированных с донорными и акцепторными флуорохромами, не должна изменяться. Любое снижение активности серьезно повлияет на достоверность результирующих измерений резонансного переноса энергии.
• Поскольку флуоресцентный резонансный перенос энергии требует, чтобы молекулы донора и акцептора имели соответствующее дипольное выравнивание и располагались в пределах 10 нанометров друг от друга, необходимо учитывать третичную структуру реагентов, к которым присоединены молекулы.Например, когда донорно-акцепторные молекулы могут быть прикреплены к различным структурным местоположениям (таким как карбокси или аминоконце) на белке, возможно, что FRET не будет наблюдаться, даже если белки действительно взаимодействуют, потому что молекулы донора и акцептора расположены на противоположных концах взаимодействующих молекул.
• Живые клетки, помеченные зелеными флуоресцентными мутантами белка для исследований FRET, должны быть проанализированы с использованием традиционных иммуногистохимических методов, чтобы убедиться, что меченый белок принимает ту же внутриклеточную среду обитания и свойства, что и нативный аналог.

Для того, чтобы явление флуоресцентного резонансного переноса энергии предоставило значимые данные в качестве инструмента в оптической микроскопии, необходимо оптимизировать как подготовку образца, так и параметры визуализации. Выбор подходящих донорных и акцепторных зондов и способа их использования в качестве молекулярных меток является серьезной проблемой. Кроме того, как только стратегия маркировки, которая разрешает передачу энергии, была разъяснена, для выполнения самого измерения можно использовать широкий спектр методов.Большинство количественных исследований флуоресцентной микроскопии проводится путем измерения интенсивности флуоресцентного излучения. Обнаружение FRET на основе интенсивности флуоресценции обычно достигается путем отслеживания изменений относительных величин интенсивности излучения на двух длинах волн, соответствующих донорному и акцепторному хромофорам. Когда условия подходят для возникновения резонансного переноса энергии флуоресценции, увеличение эмиссии акцептора ( I (A) ) сопровождается одновременным уменьшением интенсивности эмиссии донора ( I (D) ).

Хотя изменение относительной интенсивности излучения донора или акцептора можно рассматривать как показатель резонансного переноса энергии, обычно используется отношение двух величин, I (A) / I (D) , как мера FRET. Величина отношения зависит от среднего расстояния между парами донор-акцептор и нечувствительна к различиям в длине пути и объеме, доступном для возбуждающего светового луча. Любое состояние образца, которое вызывает изменение относительного расстояния между парами молекул, приводит к изменению соотношения испускания донора и акцептора.Следовательно, FRET можно наблюдать в микроскоп путем преимущественного возбуждения донорного флуорофора и обнаружения повышенного излучения взаимодействующего акцепторного флуорофора, сопровождаемого уменьшением флуоресценции донора, вызванной тушением из-за передачи энергии. Измерение FRET с использованием подхода мониторинга интенсивности называется стационарным, флуоресцентным резонансным переносом энергии.

Соответствующие донорные и акцепторные зонды выбираются на основе их спектральных характеристик поглощения и излучения.Для максимальной резонансной передачи энергии спектр излучения донора должен существенно перекрывать спектр поглощения акцептора. Кроме того, должно быть минимальное прямое возбуждение акцепторного флуорофора в максимуме возбуждения донора, и не должно быть значительного перекрытия излучения между донором и акцептором в области длин волн, в которой происходит излучение акцептора. На практике может быть сложно идентифицировать пары донор-акцептор, удовлетворяющие этим требованиям.Ситуация часто осложняется тем фактом, что имеющиеся в продаже наборы флуоресцентных фильтров не полностью эффективны при пропускании только желаемых длин волн, и может передаваться небольшой процент света за пределами проектной полосы пропускания. Если не используются очень хорошо охарактеризованные и контролируемые системы экспрессии, может быть трудно определить точную концентрацию донорных и акцепторных флуорофоров. Дополнительные корректировки могут также потребоваться для автофлуоресценции, фотообесцвечивания и фоновой флуоресценции.

Типичное исследование внутриклеточной белковой ассоциации в живой культуре клеток проиллюстрировано на рисунке 8 для событий, связанных с апоптозом, физическим процессом гибели клеток, возникающим в результате сложного каскада последовательных взаимодействий. Генные продукты, непосредственно участвующие в цепи событий, могут быть помечены слиянием с соответствующими членами семейства флуоресцентных белков (в данном случае BFP и GFP) для совместной экспрессии в одной и той же клетке, чтобы исследовать специфические ассоциации с помощью FRET.Белки, участвующие в апоптозе, взаимодействуют внутри митохондрий и демонстрируют постепенное уменьшение связывания по мере того, как происходит запрограммированная гибель клеток. Таким образом, изображение излучения донора (рис. 8 (a)) содержит только флуоресценцию от белков, меченных BFP, в то время как соответствующий профиль излучения акцептора (рис. 9 (b)) иллюстрирует сигналы, обусловленные белками, меченными GFP (и некоторый вклад от белков, меченных GFP). донорская эмиссия). Фильтр FRET (рис. 8 (c)), как описано ниже, выявляет флуоресценцию, полученную в результате резонансного переноса энергии между двумя белками

Среди факторов, которые потенциально могут повлиять на точность измерений резонансного переноса энергии флуоресценции в целом, некоторые из них очень специфичны. к оптическому микроскопу.Основной целью микроскопических исследований является получение изображений с высоким разрешением, и это требует особого внимания к качеству и характеристикам оптических фильтров, используемых для спектрального различения длин волн поглощения и излучения донора и акцептора. Чтобы максимизировать отношение сигнал / шум (без вредного воздействия на образец или исследуемый процесс), необходимо тщательно сбалансировать интенсивность и время воздействия возбуждающего света с концентрацией донорных и акцепторных флуорофоров и детектора. эффективность.Если концентрация донорно-акцепторных флуорофоров чрезмерна, может произойти самотушение, влияющее на точность измерений FRET. Фотообесцвечивание является проблемой всех флуорофоров и может влиять на соотношение донор-акцептор, изменяя измерения флуоресценции. Избыточная интенсивность освещения также может повредить образцы, особенно содержащие живые клетки или ткани.

Метод, известный как донорский фотообесцвечивающий резонансный перенос энергии флуоресценции ( pbFRET ), который использует процесс фотообесцвечивания для измерения FRET, часто применяется при исследовании фиксированных образцов.Основанный на попиксельном анализе, этот метод был применен для измерения отношений близости между белками клеточной поверхности, меченными моноклональными антителами, конъюгированными с флуорофором. Фотообесцвечивание FRET основано на теории, согласно которой флуорофор чувствителен к фотоповреждению только тогда, когда он находится в возбужденном состоянии. Статистически только небольшая часть молекул находится в возбужденном состоянии в любой момент времени, и поэтому флуорофоры с более длительным временем жизни флуоресценции имеют более высокую вероятность фотоповреждения и демонстрируют более высокую скорость фотообесцвечивания.

Экспериментальные данные, подтверждающие эту концепцию, продемонстрировали, что время фотообесцвечивания флуорофора обратно пропорционально времени его жизни в возбужденном состоянии. Возникновение резонансной передачи энергии снижает время жизни флуоресценции молекулы донора, эффективно защищая ее от фотообесцвечивания. Расчеты pbFRET основаны на уменьшении скорости фотообесцвечивания донора по сравнению с измеренной для донора в отсутствие резонансной передачи энергии. Измерение фотообесцвечивания в исследованиях FRET требует относительно длительного периода времени и поэтому наиболее применимо к образцам фиксированных клеток, в которых временные данные не важны, а влияние фотообесцвечивания на функцию клеток не является проблемой.В некоторых отношениях методика фотообесцвечивания доноров менее сложна, чем измерение сенсибилизированного излучения, хотя подгонка постоянных времени к кривым фотообесцвечивания, включающим несколько компонентов, представляет некоторые дополнительные трудности.

Эффективность передачи энергии также может быть определена с помощью методов фотообесцвечивания акцептора , в которых изменение тушения донорной эмиссии измеряется путем сравнения значения до и после селективного фотообесцвечивания акцепторной молекулы.Анализ изменения интенсивности флуоресценции донора в одних и тех же областях образца до и после удаления акцептора имеет то преимущество, что требует подготовки только одного образца, и напрямую связывает эффективность передачи энергии с флуоресценцией как донора, так и акцептора.

Точное измерение резонансного переноса энергии флуоресценции в микроскопе требует компенсации всех потенциальных источников ошибок. Был разработан простой метод корректировки обнаружения донорной флуоресценции с помощью фильтра эмиссии акцептора и флуоресценции акцептора с фильтром эмиссии донора (из-за кроссовера или спектрального просвечивания).Метод также корректирует зависимость FRET от концентраций донорных и акцепторных флуорофоров. Стратегия измерения, которая требует минимум спектральной информации, использует комбинацию из трех наборов фильтров и может быть легко реализована. Наборы фильтров донора, FRET и акцептора предназначены для выделения и максимизации трех конкретных сигналов: флуоресценции донора, флуоресценции акцептора, относящейся к FRET, и флуоресценции непосредственно возбужденного акцептора, соответственно. На практике три разных образца, содержащие только донор, только акцептор, и донор, и акцептор, исследуются с каждым из трех наборов фильтров, и полученные данные обрабатываются арифметически для корректировки кроссовера и неконтролируемых изменений концентраций донор-акцептор.

На рисунке 9 представлены схематические иллюстрации кроссовера (спектральное просачивание) и перекрестных помех фильтра, двух существенных проблем, которые необходимо преодолеть, чтобы получить количественные результаты в экспериментах по флуоресцентному резонансному переносу энергии. Кроссовер или просачивание проявляется в перекрытии спектра излучения донорной флуоресценции с полосой пропускания интерференционного фильтра излучения акцептора на рисунке 9, в результате чего сигнал излучения донора (нежелательные длины волн) проходит через фильтр излучения.Напротив, перекрестные помехи фильтра описывают минимальный уровень затухания (блокировки) в определенном диапазоне двух фильтров, установленных вместе последовательно, и вызывают беспокойство при согласовании фильтров возбуждения и излучения для наборов флуоресценции. Дихроматические зеркала часто включают в оценку перекрестных помех комбинаций флуоресцентных фильтров. Хотя два эмиссионных фильтра редко устанавливаются на световом пути одновременно, спектры объединены на рисунке 9, чтобы одновременно проиллюстрировать обе концепции.Обратите внимание, что два спектра фильтра (синяя и красная кривые) представляют коэффициент пропускания света интерференционными фильтрами, тогда как кривая излучения донора (зеленый) представляет собой график зависимости интенсивности от длины волны.

Дополнительные факторы, которые потенциально могут привести к значительным ошибкам, также требуют исправления при использовании методов измерения FRET в установившемся режиме. Кроме того, желателен тщательный контроль концентрации донорного и акцепторного флуорофора. Определения концентрации флуорофора можно частично избежать за счет применения измерений флуоресценции с временным разрешением , которые обеспечивают метод получения среднего времени жизни без точного знания концентраций доноров.Метод позволяет количественно определять расстояние разделения донор-акцептор и основан на измерениях времени жизни донора в присутствии и в отсутствие акцептора. Измерение спада интенсивности флуоресценции как функции времени проясняет динамику излучения молекулы в возбужденном состоянии, и, следовательно, может быть получена более подробная информация о природе донорно-акцепторного взаимодействия. Графические графики спада интенсивности иллюстрируют усредненные по времени детали процесса затухания флуоресценции (см. Рисунок 10 (а)), которые не разрешаются при использовании методов устойчивого состояния.Измерения, показывающие одно и то же значение для среднего времени жизни, когда регистрируются как интенсивность в установившемся состоянии, нормированная на поглощение, могут соответствовать существенно разным формам кривой затухания на графиках данных с временным разрешением, указывая на различия в участвующих межмолекулярных процессах.

Время жизни флуоресценции ( τ ) флуорофора — это характерное время, в течение которого молекула находится в возбужденном состоянии перед возвращением в основное состояние. Представляя затухание флуоресценции в упрощенной единственной экспоненциальной форме после короткого импульса возбуждающего света, интенсивность флуоресценции как функция времени ( t ) определяется уравнением:

I (t) = I0 exp (-t / τ )

, где I (0) — начальная интенсивность излучения флуоресценции сразу после импульса возбуждающего света, а I (t) — интенсивность флуоресценции, измеренная в момент времени t .Время жизни флуоресценции ( τ ) определяется как время, необходимое для уменьшения интенсивности до 1 / e от ее начального значения (приблизительно 37 процентов от I (0) ; рисунок 10 (a)), и составляет величина, обратная константе скорости затухания флуоресценции из возбужденного состояния в основное.

Основным общим преимуществом измерений FRET с временным разрешением по сравнению с установившимся режимом является то, что расстояние разделения донор-акцептор может быть нанесено на карту с большей количественной точностью.Частично это происходит из-за того, что время жизни флуоресценции не зависит от локальной интенсивности или концентрации и в значительной степени не зависит от фотообесцвечивания флуорофоров. Однако времена жизни флуоресценции очень чувствительны к среде флуорофора, и даже молекулы со сходными спектрами могут проявлять разные времена жизни в разных условиях окружающей среды. Поскольку рассеяние не влияет на время жизни флуорофора, измерения изменения времени жизни могут предоставить информацию, которая конкретно связана с локальными молекулярными процессами.

Срок службы флуорофора может быть изменен множеством переменных в локальном микроокружении, включая такие факторы, как гидрофобность, концентрация кислорода, ионная сила других компонентов среды, связывание с макромолекулами и близость к молекулам акцептора, которые могут истощать возбужденное состояние. состояние за счет резонансной передачи энергии. Значительным практическим преимуществом является то, что измерения времени жизни могут служить абсолютными индикаторами молекулярных взаимодействий и не зависят от концентрации флуорофора.

Два общих метода, обычно используемых для измерения времени жизни флуоресценции, классифицируются как во временной области ( в импульсном режиме , см. Рисунок 10 (a)) и в частотной области (также называемый с фазовым разрешением ; рисунок 10 (б)) методы. При измерении срока службы во временной области используются источники света с импульсным возбуждением, а время жизни флуоресценции определяется путем прямого измерения сигнала излучения или регистрации с помощью счета фотонов. Подход с частотной областью использует синусоидальную модуляцию источника возбуждающего света (полученную из импульсных или модулированных лазерных систем), а время жизни определяется по фазовому сдвигу и глубине демодуляции сигнала флуоресцентного излучения.Каждый из этих подходов к визуализации времени жизни флуоресценции имеет определенные преимущества и недостатки, и оба широко применяются в традиционной широкопольной, конфокальной и многофотонной микроскопии.

На рисунке 10 показаны схематические диаграммы, представляющие методы временной и частотной области для определения времени жизни флуоресценции. В подходе во временной области (рис. 10 (а)) образец возбуждается коротким импульсом лазерного света, длительность которого намного короче, чем время жизни возбужденных частиц, и измеряется экспоненциальный профиль затухания как функция времени.Затухание флуоресценции обычно является моноэкспоненциальной функцией для одного флуорофора, но может иметь гораздо более сложный характер, если возбужденное состояние имеет многочисленные пути релаксации, доступные в окружающей среде. Синусоидально модулированный свет от лазера непрерывного действия, соединенного с акустооптическим модулятором, используется для возбуждения флуорофора в экспериментах в частотной области (рис. 10 (b)). Результирующее флуоресцентное излучение модулируется синусоидально на той же частоте, что и возбуждение, но сопровождается фазовым сдвигом и уменьшением глубины модуляции.В случае однократного экспоненциального затухания время жизни флуоресценции можно рассчитать, определив либо степень фазового сдвига ( φ ), либо коэффициент модуляции ( M ), используя уравнения, представленные на рисунке 10 (b). Если два значения идентичны, затухание флуоресценции действительно состоит из одной экспоненциальной функции. Когда присутствует более одного флуоресцентного вещества (или один флуорофор находится в сложной среде), фазовый сдвиг и время жизни модуляции следует оценивать в широком диапазоне частот.

Метод измерения времени жизни флуоресценции во временной области в основном основан на подсчете одиночных фотонов и требует системы детектирования с достаточным временным разрешением для сбора почти 100 процентов фотонов, генерируемых каждым импульсом возбуждения. Хотя методы с фазовым разрешением относительно менее требовательны в исполнении, они, как правило, не так чувствительны, как метод подсчета фотонов. Когда фазовая модуляция используется для разрешения сложных времен жизни мультифлуорофоров, длительное время воздействия повреждающего возбуждающего освещения может оказаться чрезмерным для некоторых образцов, а также может не обеспечить достаточного временного разрешения для процессов с живыми клетками.Предпочтительный метод зависит как от информации, необходимой для исследования, так и от типа исследуемого образца.

Измерения времени жизни флуоресценции оказались чувствительным индикатором FRET и имеют особые преимущества при исследованиях живых клеток из-за независимости измерений времени жизни от таких факторов, как концентрация и длина светового пути, которые трудно контролировать в живых образцах. Основное преимущество выполнения FRET-исследований путем измерения времени жизни флуоресценции заключается в том, что можно различать перенос энергии даже между донорно-акцепторными парами с аналогичными спектрами излучения.Когда время жизни флуоресценции измеряется напрямую (в отличие от использования значений в установившемся состоянии), определение FRET возможно без фотодеструкции донорных или акцепторных флуорофоров. Поскольку FRET уменьшает время жизни флуоресценции донорной молекулы за счет передачи энергии акцептору, прямое сравнение времени жизни донора в присутствии акцептора ( τ (DA) ) с временем жизни в отсутствие акцептора ( τ ( D) ), позволяет вычислять значение эффективности FRET ( E (T) ) для каждого пикселя изображения.

В зависимости от метода измерения времени жизни флуоресценции требуют, чтобы образец подвергался воздействию либо высокочастотных повторяющихся импульсов возбуждающего света, либо непрерывного синусоидально модулированного света. В исследованиях с живыми клетками всегда необходимо оценивать эффект интенсивного освещения. Независимо от метода, эталонное время жизни донора без акцептора должно быть определено в экспериментальных условиях, идентичных условиям измерения донор-акцептор.Одним из способов достижения этого с одним образцом является измерение времени жизни только донора после фотообесцвечивания акцептора после эксперимента по передаче энергии.

Выводы

В биологических исследованиях наиболее распространенным применением флуоресцентного резонансного переноса энергии является измерение расстояний между двумя участками макромолекулы (обычно белка или нуклеиновой кислоты) или исследование взаимодействия in vivo между биомолекулярными объектами.Белки могут быть помечены синтетическими флуорохромами или иммунофлуоресцентными флуорофорами, которые служат донором и акцептором, но достижения в генетике флуоресцентных белков теперь позволяют исследователям маркировать определенные целевые белки множеством биологических флуорофоров, имеющих разные спектральные характеристики. Во многих случаях аминокислота триптофан используется в качестве внутреннего донорного флуорофора, который может быть связан с любым количеством внешних зондов, выступающих в качестве акцептора.

Если макромолекулы помечены одним донором и акцептором, а расстояние между двумя флуорохромами не изменяется в течение времени жизни возбужденного состояния донора, то расстояние между зондами можно определить по эффективности передачи энергии в установившемся состоянии. измерения, как описано выше.В случаях, когда расстояние между донором и акцептором колеблется вокруг кривой распределения, например, белковые сборки, мембраны, одноцепочечные нуклеиновые кислоты или развернутые белки (см. Сценарии, представленные на рисунке 11), FRET все еще можно использовать для изучения явлений, но предпочтительны измерения срока службы с временным разрешением. Некоторые биологические применения, которые попадают в оба случая, показаны на рисунке 11, включая конформационные изменения, диссоциацию или гидролиз, слияние мембраноподобных липидных везикул и взаимодействия лиганд-рецептор.

Хотя для измерения резонансного переноса энергии флуоресценции в оптическом микроскопе доступны различные методы, ни один из них не лишен недостатков. Некоторые методы требуют более сложных и дорогостоящих инструментов, в то время как другие основаны на предположениях, которые необходимо тщательно проверять. Некоторые подходы подходят для фиксированных образцов, но не могут применяться к системам живых клеток, в то время как другие методы должны включать значительные корректирующие вычисления или алгоритмы анализа данных.Однако несомненно, что FRET-анализ показывает большие перспективы для дальнейшего развития полезности и объема биологических приложений. В последние годы произошли драматические улучшения в инструментарии, особенно в отношении методов с временным разрешением.

Измерения времени жизни флуоресценции, которые раньше выполнялись крайне сложно, теперь поддерживаются зрелыми пикосекундными и наносекундными технологиями. Успехи в разработке флуоресцентных зондов позволили получить более мелкие и более стабильные молекулы с новыми механизмами прикрепления к биологическим мишеням.Были также разработаны флуорофоры с широким диапазоном времени жизни в собственном возбужденном состоянии, и значительные усилия прилагаются к развитию большего разнообразия генетических вариаций флуоресцентных белков. Совершенно новые классы флуоресцентных материалов, многие из которых меньше, чем предыдущие флуорофоры, и позволяют оценивать молекулярные взаимодействия на меньших расстояниях разделения, обещают улучшить универсальность мечения и привести к новым применениям метода FRET.

Соавторы

Брайан Херман и Виктория Э.Centonze Frohlich — Департамент клеточной и структурной биологии, Научный центр здравоохранения Техасского университета, 7703 Floyd Curl Drive, San Antonio, Texas 78229.

Joseph R. Lakowicz — Центр флуоресцентной спектроскопии, Департамент биохимии и молекулярной биологии, Университет Мэриленда и Институт биотехнологии Университета Мэриленда (UMBI), 725 West Lombard Street, Baltimore, Maryland 21201.

Thomas J. Fellers и Michael W.Davidson — Национальная лаборатория сильного магнитного поля, 1800 г. Ист. Пол Дирак, доктор, Университет штата Флорида, Таллахасси, Флорида, 32310.

Произошла ошибка при настройке пользовательского файла cookie

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности. Если ваш браузер не принимает файлы cookie, вы не можете просматривать этот сайт.

---

Настройка вашего браузера для приема файлов cookie

Существует множество причин, по которым cookie не может быть установлен правильно. Ниже приведены наиболее частые причины:

• В вашем браузере отключены файлы cookie.Вам необходимо сбросить настройки своего браузера, чтобы он принимал файлы cookie, или чтобы спросить вас, хотите ли вы принимать файлы cookie.
• Ваш браузер спрашивает вас, хотите ли вы принимать файлы cookie, и вы отказались. Чтобы принять файлы cookie с этого сайта, нажмите кнопку «Назад» и примите файлы cookie.
• Ваш браузер не поддерживает файлы cookie. Если вы подозреваете это, попробуйте другой браузер.
• Дата на вашем компьютере в прошлом. Если часы вашего компьютера показывают дату до 1 января 1970 г., браузер автоматически забудет файл cookie.Чтобы исправить это, установите правильное время и дату на своем компьютере.
• Вы установили приложение, которое отслеживает или блокирует установку файлов cookie. Вы должны отключить приложение при входе в систему или проконсультироваться с системным администратором.

---

Почему этому сайту требуются файлы cookie?

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности, запоминая, что вы вошли в систему, когда переходите со страницы на страницу. Чтобы предоставить доступ без файлов cookie потребует, чтобы сайт создавал новый сеанс для каждой посещаемой страницы, что замедляет работу системы до неприемлемого уровня.

---

Что сохраняется в файле cookie?

Этот сайт не хранит ничего, кроме автоматически сгенерированного идентификатора сеанса в cookie; никакая другая информация не фиксируется.

Как правило, в файлах cookie может храниться только информация, которую вы предоставляете, или выбор, который вы делаете при посещении веб-сайта. Например, сайт не может определить ваше имя электронной почты, пока вы не введете его. Разрешение веб-сайту создавать файлы cookie не дает этому или любому другому сайту доступа к остальной части вашего компьютера, и только сайт, который создал файл cookie, может его прочитать.

Анализ флуоресцентного резонансного переноса энергии (FRET)

Анализ флуоресцентного резонансного переноса энергии (FRET)

Мембранные белки составляют 1 / 4–1 / 3 от общего числа 30000 белков, кодируемых геномом человека. Мембранные белки играют важную роль в различных сложных и уникальных клеточных процессах, включая транспортировку материалов, распознавание клеток, иммунный ответ, передачу и регуляцию сигналов, а также передачу энергии, et.al . Почти 70% известных или исследуемых мишеней для лекарств — это мембранные белки. По-прежнему остается сложной задачей определение структур и выполнение функциональных анализов мембранных белков.

Creative Biostructure создал отличную сервисную платформу для преобразования генов мембранных белков в структуру, созданную группой опытных профессионалов. Наши услуги полного набора мембранных белков, включая экспрессию и очистку, кристаллизацию и определение, а также различные функциональные анализы как in vivo, и in vitro, , позволяют проводить ваши научные исследования в ускоряющемся и динамичном темпе. Creative Biostructure может разработать и предоставить индивидуальный анализ Mempro ™ флуоресцентного резонансного переноса энергии (FRET) или анализ FRET для функционального исследования взаимодействий мембранных белков.

Белковые взаимодействия имеют решающее значение для сигнальных сетей мембранных белков. Однако резонансный перенос энергии флуоресценции может иметь место только в том случае, если расстояние донор-акцептор не превышает 10 нм, что делает его очень мощным инструментом для обнаружения и определения взаимодействий с мембранными белками.

Анализ флуоресцентного резонансного переноса энергии ( FRET ), один из наиболее передовых и желаемых методов с широким диапазоном применения, выполняет анализы для прямого определения состояния олигомеризации и степени олигомеризации мембранных белков в их естественной среде. FRET — это зависящее от расстояния взаимодействие между флуоресцентными донорно-акцепторными парами в непосредственной близости, при котором энергия флуоресценции передается от возбужденного донора к подходящей молекуле акцептора без излучения.Эффективность FRET сильно зависит от расстояния донор-акцептор и от спектров перекрытия донорного излучения и возбуждения акцептора.

Рисунок 1. Схематический график фотофизического процесса FRET (Molecules, 2012)

FRET может иметь место только в том случае, если расстояние донор-акцептор не превышает 10 нм, что делает его очень мощным инструментом для обнаружения и определения взаимодействий с мембранными белками. Creative Biostructure может предоставить платформу Mempro ™ FRET для выполнения специального структурного и функционального анализа мембранных белков.

• Mempro ™ FRET с индивидуальной парой донор-акцептор

Принимая во внимание большое влияние расстояния Форстера на FRET, Creative Biostructure может помочь вам выбрать оптимальную флуоресцентную пару донор-акцептор в соответствии с вашими особенностями требование исследования мембранного белка.

Таблица 1. Популярные донорно-акцепторные пары FRET и их фотофизические свойства.

Оптимальные условия для FRET:
1.Донорно-акцепторная пара должна находиться на близком расстоянии (обычно 1–10 нм).
2. Перекрытие между спектром поглощения акцептора и спектром излучения донора.
3. Ориентация донора и акцептора должна быть примерно параллельна.

• Mempro ™ FRET для индивидуальных целей

FRET может обеспечить не только качественные измерения, но и количественные данные в исследованиях функции мембраны. Creative Biostructure разработала полный набор методов FRET , таких как 1) Upconversion FRET , 2) Photochromic FRET , 3) Single-Molecule-FRET , и 4) FRET Frustration et.al . Creative Biostructure — ваш компетентный и профессиональный научно-исследовательский партнер для выполнения всех видов FRET-приложений мембранных белков, включая
1. Структура и конформация мембранных белков,
2. Пространственное распределение мембранных белков,
3. Олигомеризация мембраны белковые комплексы,
4. Мембранный белок участвует во взаимодействиях рецептор / лиганд,
5. Взаимодействие между мембранными липидами и мембранными белками.

Рисунок 2.Внутримолекулярный и межмолекулярный FRET (Current Opinion in Structural Biology, 2001)

Рисунок 3. Применение сигломолекулярного FRET (J. Am. Chem. Soc., 2013)

Рисунок 4. Измерение взаимодействия между мембранными белками и липидами и лиганды от FRET (PNAS, 2013)

• Mempro ™ FRET с индивидуальными подходами к визуализации

Компания Creative Biostructure разработала ряд методов для определения FRET. Обычно мы предлагаем три индивидуальных подхода, которые оказались особенно полезными с практической точки зрения:
1. Фотообесцвечивание донора и акцептора
FRET можно создать, получив доступ к скорости отбеливания донора с присутствием акцептора и без него. Основными двумя преимуществами этого подхода являются: относительно простота и простота реализации. Требуются соответствующие комплекты фильтров и мощный источник света, позволяющий отбеливать акцептор.
2. Сенсибилизированная эмиссия
Сенсибилизированная эмиссия — это самый простой метод обнаружения FRET, и наиболее идеальным условием для этого метода является полное разделение каналов донора и акцептора и отсутствие перекрестных помех между ними.
3. Флуоресцентная микроскопия для визуализации времени жизни
Флуоресцентная микроскопия для визуализации времени жизни, также называемая FLIM, может использоваться для картирования пространственного распределения времен жизни флуорохромов как в микроскопических изображениях, так и в живых клетках. Creative Biostructure может определять точное пространственное расположение или распределение мембранных белков с высоким разрешением и специфичностью в живых клетках.

Creative Biostructure также предоставляет ряд услуг по функциональному анализу Mempro ™.Пожалуйста, свяжитесь с нами для получения подробного предложения.

Ссылки:
H. C. Ishikawa-Ankerhold, et al . (2012). Передовые методы флуоресцентной микроскопии — FRAP, FLIP, FLAP, FRET и FLIM. Молекулы , 1 7 (3): 4047-4132.
К. Чыонг и М. Икура. (2001). Использование микроскопии изображений FRET для обнаружения белок-белковых взаимодействий и изменений конформации белков in vivo. Текущее мнение в структурной биологии , 11 : 573-578.
W. Bae, и др. . (2013). Наблюдение в реальном времени за образованием множественных белков с помощью одномолекулярного FRET. J. Am. Chem. Soc ., 135 (28): 10254-10257.
C. Matsushita, et al. . (2013). Ориентация трансмембранной спирали влияет на связывание с мембраной внутриклеточного юкстамембранного домена в пептидах рецептора Neu. Proc. Natl. Акад. Sci. США, 110 (5): 1646–1651.

Только для исследовательского использования.Не для использования в диагностических или терапевтических процедурах.

Структура раствора комплекса ESCRT-I с помощью малоуглового рентгеновского рассеяния, ЭПР и FRET-спектроскопии

Реферат

ESCRT-I необходим для сортировки интегральных мембранных белков в лизосому или вакуоль в дрожжах, для цитокинез в клетках животных и отпочкование ВИЧ-1 из человеческих макрофагов и Т-лимфоцитов. ESCRT-I представляет собой гетеротетрамер Vps23, Vps28, Vps37 и Mvb12.Кристаллические структуры основного комплекса и варианта убиквитина E2 и С-концевых доменов Vps28 были определены, но внутренняя гибкость предотвратила кристаллизацию интактного ESCRT-I. Здесь мы охарактеризовали структуру ESCRT-I в растворе путем одновременного уточнения структуры по сравнению с малоугловым рентгеновским рассеянием и спектроскопией двойного электронно-электронного резонанса спин-меченых комплексов. Ансамбль, по крайней мере, из шести структур, включающий в себя одинаково населенную смесь закрытых и открытых конформаций, был необходим для соответствия всем данным.Этот структурный ансамбль был перекрестно подтвержден с помощью FRET-спектроскопии одиночных молекул, которая предположила наличие континуума открытых состояний. Таким образом, ESCRT-I в растворе, по-видимому, состоит приблизительно из 50% популяции одной или нескольких связанных закрытых конформаций, а остальные 50% составляют континуум открытых конформаций. Эти конформации обеспечивают ориентиры для структурного пути, с помощью которого ESCRT-I индуцирует мембранные зачатки.

Эндосомный сортировочный комплекс, необходимый для транспорта (ESCRT), комплексы необходимы для подавления убиквитин-зависимых рецепторов, биогенеза мультивезикулярных тел (MVB), почкования ВИЧ-1 и большинства других вирусов в оболочке, а также цитокинеза (1, 2) .От дрожжей до людей, ESCRT отрывают мембранные зачатки от цитозоля и отщепляют узкие шейки от их внутренней поверхности (3). ESCRT-I напрямую связывается с убиквитином через свой домен убиквитина E2 варианта (UEV) (4) и функционирует вместе с ESCRT-II в зачатках мембран вдали от цитозоля (5) по неизвестному механизму. Основной путь выхода ВИЧ-1 из инфицированных клеток — через ESCRT-I (6–9). Цитокинез требует рекрутирования ESCRT-I в среднее тело (10, 11), которое является конечной связью между дочерними клетками.Эти роли сделали ESCRT-I мишенью для структурного анализа и разработки противовирусных препаратов (12, 13).

ESCRT-I состоит из одной копии каждого из Vps23, Vps28, Vps37 и Mvb12 в дрожжах (рис. 1 A ). Его структура была охарактеризована по частям. Определены структуры дрожжевых (рис. 1 B ) и человеческих доменов UEV, связанных с убиквитином (14, 15), и домена UEV человека, связанного с пептидами из ВИЧ-1 и ESCRT-0 (13, 16). ESCRT-I дрожжей связывается с ESCRT-II через C-концевой домен (CTD) Vps28 (17), структура которого была определена (18, 19) (рис.1 С ). Vps23, Vps28 и Vps37 собираются через тримерный субкомплекс, известный как «головной убор» (17, 20) (Fig. 1 D ). Vps23, Vps37 и Mvb12 образуют удлиненную ножку (21) (рис. 1 D ). Стебель и головной убор вместе составляют ядро. Четыре другие области отсутствуют в решенных структурах. Линкер, содержащий 60 остатков, соединяет UEV и стеблевую часть Vps23 и включает последовательность локализации в среднем теле (22). Гибкий линкер с 30 остатками соединяет головную часть и CTD Vps28.Предсказанная на N-конце спираль (NTH; Fig. 1 E ) Vps37 является основной, предполагается, что она в основном спиральная, и вносит вклад в связывание с мембраной (21). Гибкие гидрофобные остатки на С-конце Mvb12 могут быть убиквитин-связывающим доменом (23). Фундаментальным для понимания механизма ESCRT-I-обеспечиваемого зачатка мембран является лучшее понимание расположения функциональных доменов в трех измерениях.

Рис. 1.

Структурные домены и сайты маркировки. ( A ) Схема домена четырех субъединиц ESCRT-I, окрашенных в синий (Vps23), красный (Vps28), серый (Vps37) и оранжевый (Mvb12), показывающий спекулятивную модель их ориентации относительно шейки мембранный бутон, адаптированный из исх.3. ( B ) UEV-домен Vps23. ( C ) CTD Vps28. ( D ) Сердечник в сборе. ( E ) NTH из Vps37. Сконструированные остатки Cys показаны в модели заполненных сфер.

ESCRT-I является представителем класса сигнальных, транспортных и регуляторных белков в этом диапазоне размеров, которые содержат внутренне неупорядоченные области. Этот класс представляет собой фундаментальную нерешенную проблему для структурных биологов. Наличие гибких областей препятствовало кристаллизации интактного ESCRT-I, тогда как низкая молекулярная масса комплекса (108 кДа) препятствовала ЭМ-анализу отдельных частиц.

Здесь мы сообщаем об усилиях по построению окончательной структуры раствора интактного ESCRT-I и разработке подхода к структурному анализу белковых комплексов среднего размера с областями внутреннего нарушения. Малоугловое рассеяние рентгеновских лучей (SAXS) и ЯМР в растворе представляют собой мощную комбинацию (24), поскольку информация о глобальной форме из SAXS дополняет ограничения ЯМР на малых расстояниях. Естественным аналогом этого подхода для более крупных комплексов является комбинирование SAXS со спектроскопическими методами, которые приводят к ограничениям более длинного диапазона за счет использования сайт-специфичного или селективного мечения.Эти методы включают двойной электронно-электронный резонанс (DEER) (25) и FRET-спектроскопию (26). Данные SAXS, DEER и FRET были собраны для ESCRT-I в растворе. Структура молекулярного моделирования была разработана для совместного уточнения структур белковых комплексов по сравнению с SAXS и спектроскопическими данными, что привело к улучшенной модели полной структуры ESCRT-I. Мы показываем, что ESCRT-I в растворе находится в равновесии между примерно равными популяциями открытых и закрытых конформаций. Мы описываем эти популяции в терминах набора из шести структур, которые служат снимками большего континуума состояний.

Результаты

SAXS ESCRT-I.

Структура раствора полноразмерного дрожжевого ESCRT-I, не содержащего Cys, была проанализирована методом SAXS. Кривая I ( q ) в сравнении с q показала особенности до q = 0,5 Å ^-1 (рис. 2 A ). Максимальный размер белка D _max был определен как 225 Å (фиг. 2 C ). Данные SAXS были первоначально проанализированы с помощью ab initio генерации огибающей (27). Полученный таким образом конверт (рис.2 D ) был удлиненным с большим лепестком на одном конце и меньшим лепестком на другом. Конверт позволил нам сделать визуально удовлетворительную посадку сердечника ESCRT-I, поместив стержень в вытянутый центр конверта, а головной убор — в одну лопасть (рис. 2 E ). Однако в конверте не хватало деталей, чтобы расположить области UEV, CTD и NTH. Действительно, график Кратки (рис. 2 B ) характерен для частично развернутого или иным образом некомпактного белка (28).Принимая во внимание доказательства внутренней гибкости в соединяющих регионах ESCRT-I, целесообразность моделирования этих регионов в ab initio оболочке в уникальной конформации не ясна априори.

Рис. 2.

SAXS ESCRT-I. ( A ) Подгонка смоделированных кривых рассеяния [ I ( q )] к наблюдаемому рассеянию ESCRT-I. ( B ) График Кратки тех же экспериментальных данных и смоделированного рассеяния, показанных в A . Экспериментальные точки данных I ( q ) в A и B представляют собой среднее значение 10 последовательных измерений одного и того же образца, а полосы ошибок представляют стандартную ошибку среднего.( C ) Функция распределения пар [ P ( r )] для ESCRT-I. ( D ) Неэмпирическая молекулярная оболочка для ESCRT-I. ( E ) Суперпозиция двух уточненных EROS структур ESCRT-I. ( F ) Подгонка экспериментальных данных SAXS для A к значениям, вычисленным на основе структур, соответствующих как данным SAXS, так и DEER.

Уточнение ансамбля ESCRT-I SAXS.

Для выборки физических конфигураций ESCRT-I мы использовали крупнозернистую модель связывания с белками (29).Ядро, Vps23-UEV, Vps28-CTD и Vps37-NTH считались жесткими доменами. Взаимодействия между доменами обрабатывали на уровне остатков с помощью зависимых от аминокислот парных потенциалов и электростатических взаимодействий типа Дебая-Хюккеля. Гибкие линкерные пептиды, соединяющие четыре жестких домена, представлены в виде аминокислотных шариков на полимере с соответствующими потенциалами растяжения, изгиба и торсионного угла. Моделирование ESCRT-I методом Монте-Карло проводилось с использованием исходной модели, основанной на кристаллических структурах дрожжевого Vps23 UEV [Protein Data Bank (PDB) ID code 1UZX], дрожжевого Vps28 CTD (PDB ID code 2J9U), дрожжевого ESCRT-I core (код PDB ID 2P22), модель NTH в спиральной конформации и линкеры, созданные в стерически разрешенных, но в остальном произвольных конформациях.Полученные 10 000 конформаций были сгруппированы и подогнаны под экспериментальную кривую I ( q ) с использованием уточнения ансамбля программы SAXS (EROS) (30). Приемлемая подгонка может быть получена как минимум с двумя конформациями, имеющими одинаковый вес (рис. 2 A ). Однако ни одна единственная конформация не соответствовала данным I ( q ). Одна из двух конформаций более закрытая (черная, рис.2 E ), а другая более открытая (желтая, рис.2 E ). В более закрытой структуре оба домена UEV и CTD подходят близко к ножке в «цис», так что они оба находятся на одной стороне ножки. UEV и CTD не соприкасаются друг с другом даже в более закрытой конформации.

В более открытом строении CTD находится дальше от стебля, но все еще на грани cis , тогда как UEV отклонился от стебля, чтобы выступить за кончик стебля. В более открытой конформации нет прямых контактов между UEV или CTD и ядром.Без взаимодействий, чтобы эти домены прочно удерживались на месте, открытая конформация, вероятно, представляет ансамбль структур, которые заполняют аналогичный объем рассеяния в растворе. Этот анализ привел нас к выводу, что по крайней мере половина популяции комплексов ESCRT-I в растворе принимает динамическую структуру, в которой UEV и CTD являются мобильными по отношению к ядру.

DEER EPR Анализ ESCRT-I.

Четыре набора уникальных пар Cys были сконструированы в конструкцию ESCRT-I дрожжей без Cys и помечены спиновым зондом (1-оксил-2,2,5,5-тетраметил-∆3-пирролин-3-метил) метантиосульфонат (MTSL).Пары Cys были отобраны с использованием уточненных структур EROS, чтобы ограничить самые неоднозначные междоменные расстояния. Остатки, подверженные действию растворителя, в кристаллизованных областях были выбраны, чтобы избежать вмешательства в сборку комплекса. Пара Vps28 Cys27-Vps37 Cys173 была выбрана в кристаллизованной области головной части для использования в качестве контроля. Остальные три пары были разработаны для измерения положения одного из основных функциональных доменов относительно ядра. Vps23 Cys108 — Vps23 Cys256 позволил измерить разделение UEV-ядра.Vps28 Cys65 — Vps28 Cys 151 и Vps23 Cys223 – Vps37 Cys12 были использованы для измерения разделения CTD-ядра и NTH-ядра, соответственно.

Каждый меченый образец ESCRT-I давал интерпретируемые спектры DEER (рис. 3). При гауссовой аппроксимации контрольная пара Vps28 Cys27-Vps37 Cys173 давала резко пиковое распределение P ( r ) с центром при 52 Å (таблица S1). Положения меток MTSL моделировались на структурах с использованием соответствующего распределения конформеров MTSL (31).Для контрольной пары распределение P ( r ), рассчитанное на основе смоделированных координат MTSL, отлично согласуется с экспериментом (рис. 3, Top ). Таким образом, эта метка MTSL достоверно сообщает известное внутрикомплексное расстояние в ESCRT-I. Образцы Vps23 Cys108 — Vps23 Cys256 и Vps23 Cys223– Vps37 Cys12 дали распределения P ( r ) по гауссову аппроксимации, которые были примерно в два раза шире, чем внутрикорпусный P ( r ), описанный выше (Таблица S1).Из широкого распределения P ( r ) для пар UEV-, CTD- и NTH-core мы делаем вывод, что все эти домены являются мобильными по отношению к ядру.

Рис. 3.

ОЛЕН ESCRT-I. ( Left ) Экспериментально наблюдаемая (сплошная) модуляция V ( t ) вместе с точками, рассчитанными из шести структурных кластеров. ( Right ) Гистограммы расстояний MTSL, вычисленных по моделям. Зеленые кривые на верхних панелях показывают результаты гауссовой регуляризации.

Комбинированная обработка SAXS и DEER.

Во избежание внесения зависящих от регуляризации артефактов в структурное уточнение, структуры были уточнены непосредственно по измеренным данным DEER V ( t ). Процедура EROS (30) была модифицирована, чтобы позволить одновременную подгонку данных SAXS и DEER с минимальным ансамблем структур. При уточнении ансамбля веса структуры w _k были изменены для улучшения согласования между вычисленными, усредненными по ансамблю величинами I ( q ), V _{( i , j )} ( t ) и измеренный I ^obs ( q ), сигналы.Чтобы найти минимальный набор структур, которые совместно учитывают данные SAXS и DEER, функция была минимизирована численно с использованием алгоритма поиска Монте-Карло, в котором веса структуры варьировались между w _k = 0 и w _k = 1 при ограничении. В приведенной выше формуле параметр μ управляет количеством n структур с ненулевым весом w _k > 0, что позволяет нам идентифицировать минимальный набор репрезентативных структур.При малых параметрах μ ≪ 1 мы получили очень хорошее совпадение с экспериментальными данными ( χ ² <1) со многими структурами в уточненном ансамбле ( n À1). При больших параметрах μ > 1 в ансамбле было очень мало структур с ненулевыми весами, но согласие с экспериментальными данными было неудовлетворительным ( χ ² было значительно больше единицы). Баланс был достигнут при μ = 0,2, когда мы получили хорошее соответствие всем экспериментальным наборам данных ( χ ² ≈ 1) только с n = 6 структурами (рис.2 F и 3).

Качественно ансамбль из шести структур (рис. 4) напоминает открытые и закрытые конформации, используемые для соответствия данным SAXS, и заполняет одну и ту же общую область пространства. Самая закрытая из шести конформаций SAXS-EPR напоминает закрытую конформацию SAXS (рис. 2 E ). В другой структуре UEV, CTD и NTH смещены из ядра в сильно растянутом состоянии. Остальные четыре имеют один или два домена в более закрытых состояниях. UEV сворачивается к цис-стороне стебля.В каждой из трех структур с закрытой конформацией UEV, UEV заполняет аналогичную область пространства, но разные поверхности UEV взаимодействуют с немного разными частями ядра. В одной из структур сайт связывания убиквитина (14) закрыт. NTH загибается вдоль стебля, так что аналогичные области пространства заполняются. Опять же, в каждом случае точный угол между NTH и ножкой меняется, как и детали молекулярных контактов. Два из трех закрытых состояний CTD включают уплотнение у дистального конца головки, которое образовано N-концевой половиной субъединицы Vps28.Эти закрытые конформеры заполняют одну и ту же область пространства и контактируют с одной и той же частью головного убора, но четырехспиральный пучок CTD повернут на 120 ° друг от друга в двух состояниях. В третьем состоянии CTD также контактирует с N-концевой половиной Vps28, но в этом случае заполняется немного другая область пространства, и CTD направлен обратно в сторону цис-стороны сердечника. Точные конформации закрытого состояния каждого из трех доменов достаточно различаются, поэтому нельзя сделать надежные выводы о детальной природе закрытого состояния или даже о том, существует ли единственная закрытая конформация.Примечательно, что даже в самых открытых конформациях избегается пространство на «транс» стороне стебля. Таким образом, даже в контексте очень гибкой и динамичной структуры существуют определенные предпочтения для доменов, занимающих одни области пространства над другими.

Рис. 4.

Структура решения ESCRT-I. Конструкции показаны с их относительными весами, полученными при подгонке, в процентах. Субъединицы окрашены, как показано на рис. 1.

Объемные измерения FRET.

Мы попытались проверить уточненную структуру ESCRT-I с независимыми данными, исключенными из уточнения.Массовые данные о времени жизни FRET были получены на образце, помеченном Atto488 и Atto594 на Cys137 и Cys223 Vps23, которые находятся в домене UEV и на ножке, соответственно. Эта пара обеспечивает независимую проверку разделения ядра UEV, в отличие от пары Cys108-Cys256, помеченной MTSL, используемой в уточнении. Время жизни донора оказалось равным τ _D = 3,7 нс, которое уменьшилось в присутствии акцептора до τ _DA = 3,4 нс (рис.S1). Эффективность FRET, рассчитанная на основе структур (см. SI Методы ), составила E = 0,11, что хорошо согласуется со средней эффективностью E = 0,09, измеренной в эксперименте с объемным FRET.

Одномолекулярный FRET.

Чтобы обеспечить независимую проверку пары Vps28 Cys65 – Cys151, пара была помечена как Alexa488 и Alexa594. Рис. 5 A и B сравнивает измеренные гистограммы эффективности FRET (светло-коричневые широкие полосы) с гистограммой, предсказанной на основе структур модели (черные узкие полосы).Чтобы проверить сборку ESCRT-I при концентрации 40 пМ, использованной для этих экспериментов, FRET также измеряли между межсубъединичной парой Vps28 Cys27-Vps37 Cys173 (фиг. S2). Экспериментальные значения эффективности FRET, 〈 E _app 〉 = n _A / ( n _A + n _D мс), рассчитанные из 2-битных бинов более 50 фотонов (рис. 5 A ) или более 110 фотонов (рис.5 B ), были преобразованы в истинную эффективность FRET, 〈 E 〉, после корректировки фоновой и донорской утечки в акцепторный канал с использованием γ -фактора для корректировки различий в эффективности обнаружения донорные и акцепторные каналы и различия в квантовых выходах донорных и акцепторных красителей как 〈 E 〉 = n _A / ( n _A + γn _{D ), с γ = 2, определенным из измерений времени жизни донора (32).}

Рис. 5.

Одномолекулярный FRET. Сравнение экспериментальных (светло-коричневые широкие полосы) и расчетных (черные узкие полосы) гистограмм эффективности FRET с использованием расстояний между красителями для модельных структур для порогового числа фотонов ( n _T ) из ( A ) 50 и ( B ) 110 с интервалом времени ( T _bin ) 2 мс. На экспериментальной гистограмме эффективность FRET для каждого бина составила γ , скорректированная после вычитания средних фоновых фотонов (донор: 0.6 мс ^-1 ; акцептор: 1,1 мс ^-1 ) и поправку на утечку флуоресценции донора в акцепторный канал (6%). Всплески флуоресценции от меченных только донорами молекул ( E <0,18) были исключены, и данные были предварительно отфильтрованы для удаления всплесков фотонов, в которых происходило мигание или обесцвечивание. ( C ) Предполагаемая модель для открытого состояния ESCRT-I ( Top ), состоящего из континуума конформаций, в равновесии с закрытым состоянием ( Bottom ), состоящим из одной или нескольких связанных конформаций.

Проверка модели по результатам измерений FRET.

Эффективность

FRET была рассчитана для двойного мутанта Vps28 Cys65 / Cys151 и в целом хорошо согласуется с экспериментом (фиг. 5 A и B ). Низкая эффективность хвоста измеренного распределения не наблюдается на предсказанной гистограмме. Что еще более важно, предсказанная гистограмма содержит два отдельных пика при E ∼ 0,60 и E ∼ 0,85, которые окружены одним широким пиком экспериментальной гистограммы.Эта разница более выражена в распределении, полученном из бинов с более высоким порогом фотонов ( n _T ) из 110 фотонов, где ширина дробового шума уже (рис. 5 B ). Возможные причины этой разницы в измеренных и предсказанных гистограммах — это ( i ) взаимное преобразование между кластерами конформаций в течение 2-миллисекундного интервала времени, что приводит к получению интервалов с эффективностью FRET, промежуточной между закрытыми и открытыми конформациями, ( ii ) Ориентационное движение красителей сравнимо или медленнее, чем время бина, из-за прилипания красителей к белку для получения диапазона значений фактора ориентации κ ² и ( iii ) предсказанные структуры не включают конформации с промежуточной эффективностью FRET.

Первая возможность была оценена с использованием простой кинетической модели обратимых конформационных изменений между двумя состояниями, при этом каждый из трех кластеров в пределах открытого или закрытого набора конформаций рассматривается как одно состояние. Эта модель сравнивалась с гистограммами эффективности FRET, построенными с различными временными интервалами, как описано в SI Анализ , из чего мы пришли к выводу, что динамика, скорее всего, не отвечает за расширение экспериментальной гистограммы. Вторая возможность была рассмотрена путем измерения значений поляризационной анизотропии для донорных и акцепторных красителей.Значение анизотропии донора ( r _a ) выше, чем ожидалось, исходя из срока службы донора ( τ _D ) и времени реориентационной корреляции ( τ _c ) приблизительно 0,74 нс для свободно переориентирующихся красителей, определенных на основе измерений анизотропии с временным разрешением (33) (см. Таблицу S2). Время переориентационной корреляции красителей ( τ _c ), рассчитанное из и θ = 0 (угол между диполями поглощения и излучения), составляет 1-2 нс, что указывает на то, что динамика красителя не увеличивает ширину на гистограмму эффективности FRET сверх вклада дробового шума ( SI Анализ ), но может, поскольку κ ² 2/3, вызвать небольшой сдвиг пиков эффективности FRET по сравнению с пиками, соответствующими свободному переориентации красители.Вывод из приведенного выше анализа состоит в том, что единственный широкий пик измеренной гистограммы, вероятно, отражает присутствие дополнительных конформаций, еще не учтенных при моделировании.

Обсуждение

Здесь мы применили комбинацию методов — SAXS, DEER и FRET — которые проверяют общую форму вместе с расстояниями между конкретными парами остатков в ESCRT-I.

Наблюдения здесь подтверждают ожидание того, что каждый дополнительный метод добавляет к общему информационному содержанию и более четко определяет структуру решения.Набор из трех значений R _H для конструкций ESCRT-I ранее можно было интерпретировать в терминах одной открытой структуры (21). Данные SAXS могут соответствовать как минимум двум структурам, одной открытой и одной закрытой. Данные SAXS и DEER вместе могут соответствовать минимум шести, охватывая спектр более открытых и закрытых конформаций UEV, CTD и NTH относительно ядра. В более ранней гидродинамической модели ESCRT-I находился полностью в открытом состоянии. Действительно, информационного содержания предыдущего гидродинамического исследования, содержащего только три точки данных, было недостаточно для определения более чем одного состояния для трех областей.Главный вывод, который следует из настоящего анализа, — это неожиданное существование примерно 50% популяции закрытых конформаций.

Одним из самых неожиданных аспектов анализа было ограничение, накладываемое информацией о распределении в спектрах DEER. Для трех пар домен-ядро каждый из этих спектров привел к широкому распределению P ( r ) в гауссовой аппроксимации. Хотя эти распределения не использовались при уточнении, широкий набор из шести структур, возникающих в результате уточнения, отражает ту же основную конформационную гетерогенность.Гистограммы FRET одиночных молекул обеспечивают прямое измерение отобранного конформационного пространства. Пара меток ядро-CTD показала один очень широкий пик на гистограмме, который отлично перекрывался с рассчитанной гистограммой, что дает нам уверенность в модели, полученной из SAXS и DEER. Широкий и относительно безликий характер эффективности FRET подчеркивает вероятное присутствие промежуточных конформаций между шестью структурами, используемыми для соответствия данным SAXS и DEER. Важно отметить, что нет никаких доказательств того, что существует ровно шесть (или какое-то другое конкретное число) дискретных конформаций.Мы рассматриваем эти шесть структур как моментальные снимки, которые охватывают и представляют большее конформационное пространство, выбранное ESCRT-I (рис. 5 C ), концепция, поддерживаемая гистограммами FRET и широким распределением P ( r ) из ОЛЕНЬ.

В текущей модели ESCRT-управляемого зачатка мембраны множественные копии ESCRT-I и -II собираются, чтобы сформировать кольцо на шейке зачатка (3). Локализация ESCRT-I в шейках почек in vitro наблюдалась непосредственно (5), но природа и структура предполагаемой мембраносвязанной сборки ESCRT-I-II неизвестны.У дрожжей внутрипросветные пузырьки (ILV) в MVBs имеют диаметр 22-26 нм (34). Если предположить, что шейка почки имеет такие же размеры, что и сама почка, подразумевается, что окружность шейки почки составляет приблизительно 75 нм. С максимальным размером 22 нм, видимым здесь, по крайней мере четыре комплекса ESCRT-I, выровненных от конца до конца, будут необходимы, чтобы охватить шейку зачатка. Внутренняя гибкость, наблюдаемая для приблизительно 50% комплексов ESCRT-I в растворе (Fig. 5 C , Top ), позволила бы комплексу регулировать свою структуру на пути биогенеза почек.После включения с ESCRT-II в мембраносвязанный узел предсказывается единственная конформация, возможно, соответствующая закрытому состоянию, наблюдаемому в другом примерно 50% популяции раствора (фиг. 5 C , Bottom ). Структура раствора будет полезна в качестве ориентира для структурного пути сборки ESCRT-I-II, ответственной за индукцию шейки почки. Хотя SAXS неосуществим в настройке мембраны из-за рассеяния от липосом, методы DEER и FRET могут быть перенесены.Таким образом, сравнение спектров в растворе и в мембраносвязанных условиях может предоставить первый шаг к пониманию конформационных изменений, участвующих в формировании сборки шейки почки. Роль конформационных изменений в ESCRT-I-обеспечиваемом почковании ВИЧ-1 является еще более актуальным вопросом. Эти спектроскопические методы также должны быть переносимы в настройку ВИЧ-1, как только реакция почкования ВИЧ может быть восстановлена ​​in vitro.

Успехи и ограничения этого анализа предлагают уроки для интеграции глобальных и конкретных структурных данных на частично гибких комплексах.EROS-анализ данных SAXS выявил ансамбль структур, способных согласовать данные, но не имел информации о различном поведении отдельных доменов. Маркировка, привязанная к конкретному участку, дает важную дополнительную информацию. Сайт-специфичное спин-мечение и DEER-спектроскопия предоставили прямые доказательства того, что каждый отдельный домен был конформационно гетерогенным по отношению к ядру, вывод, который мы не могли сделать только на основе анализа SAXS. Мы использовали другой сайт-специфический структурный зонд, FRET-спектроскопию, чтобы подтвердить выводы, сделанные из двух других методов, и выявить присутствие конформационных промежуточных продуктов, которые не были обнаружены другими методами.Мультисубъединичные комплексы представляют собой серьезную проблему в структурной биологии, и интеграция ограничений от множества методов, вероятно, будет иметь решающее значение для развития молекулярного понимания функции.

Материалы и методы

При уточнении ансамбля число N и вес w _k структур k в ансамбле были получены путем одновременной подгонки к данным SAXS и DEER. Интенсивность рассеяния I _k ( q ) структуры k рассчитывалась, как в ссылке.30 и усреднены по ансамблю. Отклонения от измеренной интенсивности SAXS I ^obs ( q ) были определены количественно путем суммирования по N _q q точкам на кривой интенсивности, с c константа, определяемая условием. Чтобы уточнить данные DEER, возможные конформации шести меток MTSL на доменах ESCRT-I были созданы с помощью многомасштабного моделирования модуля Matlab макромолекулярной системы (31). Путем соответствующего переноса и поворота координат MTSL ротамеры были размещены на жестких доменах всех структур ESCRT-I в ансамбле.Для каждой пары меток MTSL ( i , j ) и конфигурации k комплекса ESCRT-I в ансамбле функция диполярной эволюции была рассчитана с D _dip = 52,04 МГц, нм ³ . Среднее значение для всех конформаций меток MTSL, с r _αβ расстояние между спиновыми метками α и β, прикрепленными к остаткам i и j , соответственно. Для проверки модели DEER метки MTSL были прикреплены к остаткам 27 и 173 в одном и том же жестком домене.Вычисленная функция диполярной эволюции V _(27,173) ( t ), таким образом, одинакова для каждой структуры k и, как было обнаружено, хорошо согласуется с измеренным сигналом DEER (см. Рис. 3, Top ). ). Для остальных трех пар меток ( i , j ) = (108,256), (12, 223) и (65, 151) функция дипольной эволюции была усреднена по ансамблю, Отклонения от измеренных сигналов DEER были определены количественно, суммируя N _t точек на кривой, с глубиной модуляции λ , полученной из.Статистическая ошибка оценивалась по уровню шума экспериментальных данных.

Благодарности

Мы благодарим B. Beach и M. Kostelansky за подготовку конструкции ESCRT-I без Cys, а также A. Bax за обсуждения. Данные SAXS были собраны в Стэнфордской лаборатории синхротронного излучения (SSRL), национальном пользовательском объекте, управляемом Стэнфордским университетом от имени Управления фундаментальных энергетических наук Министерства энергетики США. Программа SSRL по структурной молекулярной биологии поддерживается Министерством энергетики, Управлением биологических и экологических исследований, а также Национальными институтами здравоохранения, Национальным центром исследовательских ресурсов, Программой биомедицинских технологий.Б. была поддержана Международной стипендией Марии Кюри в рамках 7-й Рамочной программы Европейского сообщества. Эта работа была поддержана Внутренней программой Национальных институтов здравоохранения (NIH), Национальным институтом диабета, болезней пищеварительной системы и почек (WAE, GH и JHH), Целевой антивирусной программой по борьбе со СПИДом в больнице. Директор, NIH (JHH), NIH Grant GM072694 (DSC) и грант Министерства образования, молодежи и спорта Чешской Республики MSM0021620835 (J.В.).

Сноски

• Вклад авторов: E.B., W.A.E., D.S.C., G.H. и J.H.H. спланированное исследование; E.B., B.R., D.Z.H., H.S.C., J.V. и G.H. проведенное исследование; Э. Б., Б. Р., Г. Х. внесены новые реагенты / аналитические инструменты; E.B., B.R., D.Z.H., H.S.C., J.V., W.A.E., D.S.C., G.H. и J.H.H. проанализированные данные; и W.A.E., G.H. и J.H.H. написал газету.

• Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

• Эта статья представляет собой прямое представление PNAS.

• Эта статья содержит вспомогательную информацию на сайте www.pnas.org/lookup/suppl/doi:10.1073/pnas.1101763108/-/DCSupplemental.

Обычно используемые флуорофоры FRET способствуют коллапсу неупорядоченного белка

Значимость

Белки принимают неупорядоченные ансамбли до сворачивания, а иногда и как часть своей функции. Моделирование и исследования FRET часто описывают неупорядоченные конформации как более компактные, чем состояния случайных клубков, наблюдаемые при высоком денатуранте, тогда как малоугловое рассеяние рентгеновских лучей (SAXS) указывает, что эти конформации остаются расширенными.Устранение этого несоответствия улучшает наше понимание свойств белков, например, является ли вода достаточно плохим растворителем, чтобы вызвать неспецифический коллапс. Мы достигаем согласования, показывая, что добавление флуорофоров FRET уменьшает размеры неупорядоченного белка. Подробный анализ FRET и SAXS, наряду с учетом сокращения, индуцированного флуорофором, демонстрирует, что неупорядоченные и развернутые белки часто остаются сольватированными и расширенными без денатуранта, свойства, которые минимизируют неправильную укладку и агрегацию.

Abstract

Размеры, которые развернутые белки, включая внутренне неупорядоченные белки (IDP), принимают в отсутствие денатуранта, остаются спорными. Мы разработали процедуру анализа профилей малоуглового рассеяния рентгеновских лучей (SAXS) и использовали ее, чтобы продемонстрировать, что даже относительно гидрофобные IDP остаются почти такими же расширенными в воде, как и при высоких концентрациях денатуранта. Напротив, как показано здесь, большинство измерений резонансного переноса энергии флуоресценции (FRET) показали, что относительно гидрофобные IDP значительно сокращаются в отсутствие денатуранта.Мы используем два независимых подхода для дальнейшего изучения этого противоречия. Во-первых, с помощью SAXS мы показываем, что флуорофоры, используемые в FRET, могут вносить вклад в наблюдаемое несоответствие. В частности, мы обнаружили, что добавление Alexa-488 к нормально расширенному IDP вызывает сокращение еще на 15%, что вполне соответствует сокращению, о котором сообщалось в исследованиях на основе FRET. Во-вторых, используя нашу процедуру моделирования и анализа для точного извлечения радиуса инерции (R _g ) и расстояния от конца до конца (R _ee ) из профилей SAXS, мы проверили недавнее предположение, что результаты FRET и SAXS могут быть согласованным, если R _g и R _ee «разъединены» (т.е.е., больше не просто пропорциональны), в отличие от случая гомополимеров случайного блуждания. Однако мы обнаружили, что даже для развернутых белков эти две меры измерений развернутого состояния остаются пропорциональными. Вместе эти результаты предполагают, что улучшенные процедуры анализа и коррекция значительных взаимодействий, управляемых флуорофором, достаточны для согласования предыдущих исследований SAXS и FRET, обеспечивая тем самым единую картину природы развернутых полипептидных цепей в отсутствие денатурирующего агента.

Белковые нарушения являются важным компонентом разнообразных клеточных процессов (1-4). В отличие от хорошо свернутых белков, которые населяют четко определенное функциональное состояние, развернутые и внутренне неупорядоченные белки (IDP) образуют широкий набор быстро взаимопревращающихся конформаций (3⇓⇓⇓⇓ – 8) с ошибками, которые плохо изучены и трудно измерить. . Особый интерес представляет степень, в которой ВПЛ заключают контракты в физиологических условиях (т. Е. При отсутствии денатурирующих агентов). Такое сокращение будет иметь широкое значение для нашего понимания сворачивания белков, взаимодействий и стабильности, а также действия денатурирующих средств.Более того, понимание степени сжатия неупорядоченных ансамблей имеет большое значение для разработки реалистичных симуляций складчатости и интерпретации измерений малоуглового рассеяния рентгеновских лучей (SAXS) и FRET (9, 10).

Наше понимание физико-химических принципов, лежащих в основе того, будет ли полипептидная цепь складываться, принимать неупорядоченный, но, тем не менее, относительно компактный ансамбль или вести себя как расширенное, полностью сольватированное, самоизбегающее случайное блуждание (SARW), недостаточно для объяснения существующих данных.Большая часть этого понимания получена из исследований белков, разворачиваемых высокими концентрациями денатурирующих веществ, таких как мочевина и гидрохлорид гуанидина (Gdn). В этих условиях консенсус состоит в том, что белки ведут себя как SARW с показателем Флори (ν) 0,60 в соотношении R _g ∝ N ^ν (N = длина цепи). Напротив, нет единого мнения относительно поведения ВПЛ при более низком уровне денатуранта или его отсутствии. В частности, в то время как многочисленные FRET (11⇓⇓⇓⇓⇓⇓⇓⇓⇓⇓⇓⇓⇓ – 25) и вычислительные исследования (11, 14, 18, 23, 26⇓⇓ – 29) утверждали, что расширенный неупорядоченный ансамбль обнаруживает при высоком уровне денатуранта сжимается значительно [обычно на 25-50% при переходе на низкий денатурант или без него (ν <0.5)] (11, 14, 18, 23, 26⇓ – 28, 30⇓⇓⇓⇓ – 35), аналогичное количество исследований SAXS сообщает о небольшом сокращении или его отсутствии в тех же условиях (10, 36–35). 41).

Разнообразные недавние исследования пытались примирить это несоответствие (Fig. 1 A ), которое имеет глубокие последствия для физики сворачивания белков. Применение более реалистичных симуляций и аналитических моделей привело к полученным FRET расстояниям, имеющим меньшую денатурирующую зависимость (Рис. 1 A , Bottom ) (40, 42⇓ – 44).Параллельно улучшены данные и анализ SAXS, включая использование безразмерного графика Кратки, чтобы подчеркнуть изменения ν, а не R _г (что важно, так как добавление флуорофоров на концах цепи увеличит R _г из-за их массы), также предоставили доказательства незначительного сжатия ниже 2 M Gdn (Рис. 1 A , Bottom ) (45, 46). Тем не менее, значительные расхождения сохраняются в отсутствие денатуранта, даже когда для анализа одного и того же белка в идентичных условиях используются одни и те же подходы (рис.1, SI Приложение , рис. S1 и S2 и Movie S1). Недавние исследования показали, что это несоответствие может быть устранено с помощью целостного анализа (42, 43), подчеркивая разделение между обычно фиксированной, пропорциональной зависимостью между R _g (определено из измерений SAXS) и R _ee (определено из Измерения FRET) без необходимости вызывать возмущение из-за присутствия флуорофоров (42).

Рис. 1.

Улучшенные процедуры анализа не устраняют расхождения между измерениями IDP, полученными с помощью SAXS и FRET.( A ) Данные R17 SAXS и FRET (из ссылки 43). ( A , Top ) Сравнение результатов, полученных при подборе данных FRET, предполагая, что гауссова цепь, и данные SAXS соответствуют с использованием приближения Гинье. ( A , Bottom ) Данные SAXS и FRET подходят с использованием нашего метода анализа MFF и аналогичного подхода (45). Черная линия лучше всего подходит гиперболической линии тренда; серые линии — 95% доверительные интервалы. ( B ) Профили SAXS для R17 ( Левый , данные из Ref.43) и N98 ( Правый , данные из ссылки 42), согласованные с MFF, значительно отличаются от ожидаемого поведения с использованием значений ν, взятых из аналогичного анализа данных FRET. Сплошные линии обозначают область, используемую в процедуре подгонки; пунктирные линии представляют экстраполяцию к более высоким значениям q. Хотя подходило ~ 500 точек на кривую рассеяния (серый цвет), большинство показанных данных были объединены в интервалы только для целей презентации (черные точки). Повороты или перегибы данных при более высоких значениях qR _g , скорее всего, связаны с ошибками при вычитании буфера, что является более сложным при высоком q, низкой концентрации образца и / или пониженном контрасте рассеяния (например.g., при высоком денатуранте, см. Материалы и методы ). ( C ) Тенденции гидрофобности (Кайт-Дулиттл) в зависимости от ν в отсутствие денатуранта, полученного из SAXS, путем применения MFF к опубликованным данным, собранным из последовательностей складываемых белков (42, 45, 67⇓⇓⇓⇓⇓⇓⇓⇓⇓). № – 82). Также показаны результаты исследований FRET, рассчитанные как в исх. 20 для опубликованных данных (20, 42). Красная линия тренда для данных FRET из исх. 20. Черная линия тренда лучше всего соответствует показанным результатам SAXS. ( C , Top ) Гистограмма гидрофобности репрезентативных белков в PDB (набор данных из исх.45). ( D ) Кумулятивные распределения ν для репрезентативных белков из PDB, выведенные из линий тренда, показанных в C .

Чтобы всесторонне сравнить результаты исследований SAXS и FRET, мы собрали опубликованные наборы данных для различных ВПЛ (Рис. 1 C и D и SI Приложение , Таблица S3). При анализе с использованием нашего моделирования и молекулярного форм-фактора (MFF) исследования SAXS неизменно находят ν> 0,53 (среднее значение = 0,55), тогда как ν, полученное из исследований FRET, обычно падает ниже 0.50 (среднее значение = 0,46). Это расхождение 0,09 является существенным по отношению ко всему диапазону ν, который варьируется только от 0,6 (для SARW) до 0,5 (где внутрицепочечные взаимодействия одинаково благоприятны для взаимодействий растворитель-цепь) до 0,33 (для уплотнения в сферу; это несколько выше для несферических компактных состояний). В целом, результаты SAXS предполагают, что конформационные ансамбли большинства развернутых белков и IDP с белковоподобным составом последовательностей сильно расширены (ν> 0.5) и вода является хорошим растворителем, тогда как FRET предполагает иное (рис. 1 D ).

Приведенные выше и другие результаты привели нас и других к поиску факторов, которые могут способствовать стойкому несоответствию между представлениями измерений IDP на основе SAXS и FRET (9, 29, 39, 42, 43, 47⇓⇓ – 50 ). Одна альтернатива, обозначаемая здесь как «гипотеза разделения гетерополимера», утверждает, что гетерополимерная природа белков приводит к изменению во взаимосвязи между R _g и R _ee , взаимосвязи, которая является фиксированной (т.е.е., независимо от длины цепи) в соотношении 6,3 для гомополимера SARW. Недавнее моделирование показывает, что это соотношение не может быть зафиксировано для развернутых белков, которые более сложны, чем гомополимеры (29, 39, 42, 43). Эта «развязка» предлагает возможное объяснение несоответствия между SAXS (который чувствителен к R _g ) и FRET (который чувствителен к R _ee ). Напротив, вторая гипотеза, обозначенная здесь «гипотеза взаимодействия флуорофоров», предполагает, что в отсутствие денатуранта флуорофоры FRET взаимодействуют друг с другом и / или с полипептидной цепью, вызывая конформационный ансамбль конструкций, модифицированных флуорофором, к сокращаются больше, чем в отсутствие этих флуорофоров (9, 45, 47, 50, 51).

Здесь мы обращаемся как к гипотезе разделения, так и к гипотезе взаимодействия флуорофора. Мы использовали SAXS, чтобы охарактеризовать радиус вращения IDP до и после добавления обычно используемого флуорофора. Мы обнаружили, что такая модификация флуорофора изменяет конформационный ансамбль в отсутствие денатуранта, уменьшая его размеры, измеренные методом SAXS, на 10–20%. В сочетании с улучшенными процедурами анализа с использованием реалистичных смоделированных ансамблей как для SAXS, так и для FRET, этого индуцированного флуорофором коллапса достаточно для согласования результатов исследований SAXS и FRET.Параллельно мы представляем измерения SAXS на полиэтиленгликоле (PEG), подтверждающие предыдущие сообщения о том, что добавление флуорофоров также вызывает сжатие этого полимера SARW (9), открытие, которое недавно было подвергнуто сомнению (42). Более того, мы показываем, что SAXS может извлекать R _g , ν и R _ee с точностью выше 97% при анализе с использованием нового MFF, разработанного для гетерополимеров. Эти модели достаточно точны для воспроизведения данных рассеяния без необходимости выбора только подансамбля конформаций, как это обычно используется в других процедурах подбора данных.Наконец, мы демонстрируем степень, в которой можно использовать небольшие отклонения от идеальности в данных SAXS, чтобы сделать вывод о смещениях внутри гетерополимерного конформационного ансамбля.

Результаты

Флуорофорная маркировка вызывает коллапс.

Чтобы напрямую проверить гипотезу взаимодействия флуорофора, мы измерили профили SAXS немодифицированного IDP и того же самого IDP, сайт-специфически модифицированного одной или двумя копиями обычно используемого флуорофора FRET Alexa-488. Мы выбрали этот флуорофор, потому что он относительно небольшой и гидрофильный, что снижает вероятность образования взаимодействий, которые могут изменить развернутый ансамбль, по сравнению с большинством других флуорофоров FRET (43).В качестве тестового белка мы использовали PNt, IDP с хорошим поведением, содержащий 334 аминоконцевых остатка пертактина (52). Для получения PNt, модифицированного моно- и двойным флуорофором, мы использовали тиол-реактивный Alexa-488 для модификации остатков цистеина в положении 117 (PNtC-Alexa488) или положениях 29 и 117 (PNtCC-Alexa488). В качестве контроля мы использовали немодифицированный родительский белок (PNt) и алкилирование для получения конструкций без флуорофоров (PNtC-Alkd и PNtCC-Alkd).

Добавление Alexa-488 снижает размеры PNt, измеренные методом SAXS, как в отсутствие Gdm, так и при промежуточных концентрациях (рис.2 A и SI Приложение , Таблица S1). В частности, при переходе от 4 к 0 M Gdn, R _{, g} и ν уменьшаются почти в два раза для модифицированного флуорофором PNtCC-Alexa488, чем для PNtCC-Alkd или PNt (рис. 2 B и SI Приложение ). , Таблица S1). Эти данные указывают на то, что присутствие Alexa-488 приводит к сокращению конформационного ансамбля PNt. Следует отметить, что в то время как 2 M Gdn является хорошим растворителем (ν> 0,50) для немеченого белка, мечение флуорофором приводит к измеримым внутримолекулярным взаимодействиям даже при этой относительно высокой концентрации денатуранта (рис.2 B , Правый ). В соответствии с общим происхождением эффекта, величина этого зависящего от денатуранта расширения качественно аналогична наблюдаемой FRET для множества других белков (Fig. 1 B ) (42, 43). Мы также наблюдали зависимое от флуорофора снижение среднего R _g и ν для конструкции с одной меткой PNtC-Alexa488 (рис. 2), что указывает на то, что, помимо предполагаемых взаимодействий флуорофор-флуорофор, взаимодействия флуорофор-белок также вносят вклад в наблюдаемое сокращение.

Рис. 2.

Добавление Alexa-488 изменяет рассеяние PNt. ( A ) Безразмерные графики Кратки для PNt дикого типа (серый), PNtCC-алкилированного (черный), PNtC-Alexa488 (одиночная метка, синий) и PNtCC-Alexa488 (двойная метка, красный) в 0,15 M KCl, 2 M Gdn и 4 M Gdn. Планки погрешностей представляют собой распространенную ошибку из SD, рассчитанного с учетом статистики подсчета (Пуассона), где σ = √counts. Данные были подогнаны и отображены в соответствии с процедурой, описанной на рис. 1 (см. Также Материалы и методы ).Результаты для алкилированного PNt неотличимы от PNt дикого типа, но существуют значительные различия для PNt, меченного флуорофором Alexa-488. ( B ) R _g и ν как функция концентрации Gdn. Данные серых кривых из исх. 45.

Следует отметить, что это сокращение происходит, несмотря на установившиеся значения анизотропии флуоресценции для PNtCC-Alexa488, равные 0,11 и 0,08 в 0 и 2 М денатуранте, соответственно ( SI Приложение , Таблица S2), ниже порогового значения, которое обычно рассматривается в качестве доказательства. свободного вращения прикрепленных к белкам флуорофоров (42, 53).Из этих результатов мы заключаем, что добавление даже одного из более мелких, более гидрофильных флуорофоров, обычно используемых для измерений FRET, может значительно уменьшить размеры неупорядоченной полипептидной цепи (42, 43, 53), наблюдение, которое помогает согласовать SAXS – FRET несоответствие.

Размеры ПЭГ, полученные методом SAXS, не зависят от концентрации полимера.

В более раннем исследовании мы сообщили, что добавление Alexa-488/594 к PEG приводило к денатурант-зависимому изменению FRET (9), аналогичному тому, которое наблюдается в развернутых белках.Однако сжатия не наблюдалось, когда эквивалентный немеченый полимер исследовали с помощью малоуглового рассеяния нейтронов. Было высказано предположение, что высокие (3 мМ) концентрации ПЭГ, использованные в этом исследовании рассеяния, маскируют то, что в противном случае было бы зависимым от денатуранта изменением в R _g (42). Чтобы проверить это, мы измерили профили SAXS в диапазоне концентраций ПЭГ и денатуранта и не нашли доказательств значительного изменения размеров этого высокогидрофильного полимера (рис.3). Аналогичным образом, во всех условиях мы наблюдали показатель Флори, равный 0,60, что дополнительно подтверждает, что ПЭГ ведет себя как SARW независимо от концентрации денатуранта. Эффекты флуорофора, а не сокращение цепи, таким образом, остаются простейшей интерпретацией денатурант-зависимых изменений FRET, ранее наблюдавшихся для меченных флуорофором вариантов этого полимера (9).

Рис. 3. Профили

SAXS ПЭГ не зависят от денатуранта. ( A ) Безразмерные графики Кратки 24 кДа ПЭГ при 0.5 мМ и 0,05 мМ в 0,15 M KCl, 2 M Gdn и 4 M Gdn. Нормализованный профиль рассеяния PEG 24 кДа не изменяется от 0 до 4 M Gdn в широком диапазоне концентраций PEG. Для ясности профили рассеяния смещены по вертикали. Данные были подогнаны и отображены с использованием процедуры, описанной на фиг. 1. ( B ) R _g и ν как функции концентрации Gdn для 0,5 мМ и 0,05 мМ PEG. Открытые и закрытые точки смещены по горизонтали для ясности.

Проверка гипотезы о разделении гетерополимеров.

Взятые вместе, вышеупомянутые наблюдения показывают, что флуорофоры, добавленные к IDP, приводят к значительному сокращению, что способствует различным выводам, сделанным из предыдущих исследований SAXS и FRET. Эти наблюдения, однако, не исключают возможность того, что, как утверждалось ранее (42), развязка гетерополимера (т. Е. Взаимосвязь между R _ee и R _g , отклоняющаяся от фиксированной пропорциональности, наблюдаемой для гомополимеров) также может вносить свой вклад. к расхождению SAXS – FRET.

Чтобы исследовать, приводит ли конформационный ансамбль реалистичного гетерополимера к значительной непропорциональности между R _ee и R _g , мы использовали Upside, наши модели Cβ-уровня (54, 55), чтобы смоделировать рассеяние для развернутых ансамблей. 50 белков из 250–650 остатков, случайно выбранных из банка данных по белкам (PDB). В своей простейшей версии Upside представляет собой каркас полипептида с шестью атомами на остаток (N, Cα, C, H, O и Cβ) и использует зависимые от соседей карты Рамачандрана, полученные из библиотеки катушек (56).Такие модели способны воспроизводить R _g и NH остаточные диполярные связи (RDC), наблюдаемые в развернутых белках; эти два параметра чувствительны к глобальным и локальным свойствам магистрали соответственно (57, 58). Для создания ансамблей гетерополимеров мы отнесли каждый Cβ как гидрофобный, так и полярный (H / P). Благоприятные профили взаимодействия (форма, показанная в ссылке 45, SI, приложение , рис. S3 A ) вводятся только между атомами Cβ гидрофобных остатков, а самопереключение накладывается на все атомы.Для каждой из 50 последовательностей мы использовали 30 различных сил взаимодействия Cβ. После создания этих 1500 ансамблей H / P конформаций скелета мы добавили явные боковые цепи (59), а затем рассчитали профили рассеяния гидратированных версий белков (60).

Для этих 1500 ансамблей мы сравнили истинные значения R _g , ν и R _ee , рассчитанные непосредственно из атомных координат, со значениями, полученными путем аппроксимации имитационного рассеяния (с добавлением реалистичных случайных ошибок) с использованием нашего оригинального MFF, разработанного для гомополимеров (45).Как и в случае гомополимеров, мы находим, что значения R _ee и R _g , наблюдаемые в этих симуляциях, пропорциональны (т. Е. Остаются связанными) с коэффициентом корреляции R ² = 0,99 (рис. 4 А ). Затем мы подбираем моделируемые профили рассеяния, чтобы определить: R _g ^{соответствует} , ν ^{соответствует} и R _ee ^{соответствует} , причем последнее получено с использованием соотношения (R _ee / R _g ) ² = G (ν), где G (ν) была откалибрована с использованием нашего исходного моделирования гомополимеров ( SI Приложение , рис.S1 D ). Мы обнаружили среднее абсолютное отклонение всего 1,3 Å, 0,011 и 4,2 Å соответственно, что представляет собой среднюю абсолютную ошибку 3%, 2% и 4% для R _g , ν и R _ee ( SI Приложение , рис. S3). Наибольшие отклонения наблюдаются для более компактных конструкций; для более протяженных конформаций (ν> 0,54) ошибка составляет ∼2%. Корреляция R _g ^{соответствует} и R _ee ^{соответствует} осталась высокой, R ² > 0.99.

Рис. 4. Моделирование

обнаруживает сильную связь между R _g и R _ee , а профили SAXS являются надежным показателем R _g , ν и R _ee , а также информируют о степени неоднородности. ( A ) Связывание между R _g и R _ee , полученное из смоделированных ансамблей с использованием модели H / P (черный) или нашего потенциала, используемого для сворачивания белков (красный). ( B — D ) Сравнение R _g , ν и R _ee , рассчитанных на основе координат смоделированных ансамблей, со значениями, полученными при подгонке с нашим MFF _het (R _g , ν) с SAXS профили ансамблей со случайно добавленными экспериментальными ошибками.( E ) Отклонения в ν _концов наблюдаются для гетерополимеров с менее хорошо смешанными H / P-образцами (полученными путем подгонки к наклону зависимости внутрицепочечного расстояния R _{| i — j |} от разделение последовательностей, | i — j |, где | i — j |> N / 2). ( F ) Влияние Δν _end при различных значениях ν. ( G ) Экспериментальные данные, соответствующие MFF (R _g , ν, Δν _конец ), демонстрируют, что мечение флуорофора и образование петли через дисульфидные связи в PNt вызывает значительные и измеримые отклонения.

Чтобы еще больше уменьшить небольшую ошибку, связанную с применением нашего MFF, полученного из гомополимеров, к рассеянию гетерополимеров, мы создали новый молекулярный форм-фактор, MFF _het , используя моделирование H / P, описанное выше, и ту же общую процедуру. как описано в исх. 45. Применение этого слегка модифицированного MFF _het снижает ошибки в подогнанных R _g , ν и R _ee до 0,5, 0,005 и 2,7 Å, соответственно, что составляет 1%, 1% и 2% среднего значения. абсолютная погрешность (рис.4 B — D ). Эти результаты демонстрируют, что наша процедура анализа на основе MFF возвращает точные значения для R _g и R _ee , которые остаются пропорциональными (то есть связанными) даже для гетерополимеров.

Далее мы рассмотрели вопрос о том, чувствительны ли наши выводы к деталям нашей модели или энергетической функции. Чтобы проверить это, мы провели дополнительное моделирование, используя более подробную версию алгоритма Upside, который способен сворачивать de novo белки с <100 остатками (54, 55).В этой версии каждая из 20 боковых цепей представлена ​​многопозиционным эксцентрическим буртиком, который позволяет детально упаковать сердечник. Энергетическая функция включает водородные связи, взаимодействия боковая цепь-боковая цепь и боковая цепь-основная цепь, аминокислотно-зависимые потенциалы двугранного угла и член десольватации. Используя эту модель, мы сгенерировали 30 ансамблей для каждого из шести белков (PNt и пять других белков, случайно выбранных из 50, описанных выше), используя короткие симуляции, которые выбирают только развернутое состояние.Мы получили ансамбли, запустив моделирование обмена репликами в диапазоне температур от 280 до 320 К, как описано ранее (54, 55). Значения ν, полученные из этих ансамблей, находились в диапазоне от 0,4 до 0,6 в зависимости от температуры моделирования. Примечательно, что значения R _ee , R _g и ν, полученные непосредственно из этих более реалистичных ансамблей, находятся в хорошем согласии со значениями, определенными после подгонки с нашим MFF _het , с почти такой же точностью, что и для более простого H / P-ансамбли (рис.4 A — C , красные точки). Кроме того, непосредственно вычисленные значения для R _g и R _ee для ансамблей остаются пропорциональными с коэффициентом корреляции R ² = 0,99. Следовательно, наш вывод, что R _g и R _ee остаются связанными даже для гетерополимеров, устойчив к деталям нашего моделирования.

Измерение отклонений от идеальности в гетерополимерах.

MFF _het точно отражает общие размеры неупорядоченных гетерополимеров для белковоподобных последовательностей H / P и может использоваться в большинстве случаев.Тем не менее, небольшие, но измеримые отклонения наблюдаются для белков в нашем тестовом наборе с менее хорошо смешанными паттернами H / P ( SI Приложение , рис. S4). Эти различия можно увидеть на графике распределения внутримолекулярных расстояний, где наклон на расстояниях разделения | i — j | > N / 2 может отличаться от среднего наклона, который определяет глобальное значение ν (рис. 4 D ). Определим изменение наклона как Δν _конец (рис. 4 D ). Отрицательные значения Δν _конец коррелируют с преобладанием гидрофобных остатков на концах полипептидной последовательности (рис.4 D и SI Приложение , Рис. S4 C ) и с отклонениями в G (ν) ( SI Приложение , Рис. S4 A ) ( R ² ∼ 0,84). Профиль SAXS наиболее чувствителен к Δν _end при низком qR _g (рис. 4 E ).

Чтобы количественно оценить неидеальность гетерополимеров на основе данных SAXS, мы создали более общий трехпараметрический форм-фактор, MFF _general (R _g , ν, Δν _end ) (рис.4 E и F и Movie S2). Чтобы продемонстрировать его способность давать полезную информацию, мы подобрали данные из PNt, PNtCC-Alexa488 и циркулярного (с дисульфидными связями) PNtCC при 2 M Gdn (рис. 4 F ). Δν _конец уменьшается с ∼0 для PNt примерно до -0,1 для PNtCC-Alexa488 и примерно до -0,2 для кольцевого PNtCC, что согласуется с увеличением взаимодействий на аминоконце цепи. Менее резкие возмущения, такие как менее хорошо смешанные паттерны H / P и более короткие аминокислотные последовательности с более низким полезным диапазоном qR _g , могут потребовать более высокого отношения сигнал / шум для измерения Δν _end .Тем не менее, эти данные демонстрируют потенциал SAXS для выявления для неупорядоченных полимеров зависимых от последовательности отклонений от поведения гомополимера (рис.4 E и F ), при этом точно измеряя R _g и ν (рис. А — С ).

В пределе бесконечной длины цепи масштабный показатель Флори ν имеет значения 0,33, 0,50 и 0,60, соответствующие глобулам, случайным блужданиям и SARW, соответственно. Тем не менее, мы и другие придерживаемся прагматического подхода и позволяем ν принимать промежуточные значения; е.g., как получено из наклона графиков масштабирования R _g в зависимости от длины цепи или R _ij в зависимости от | i — j | ( SI Приложение , рис. S6). В поддержку этого подхода можно наблюдать при увеличении силы внутрицепочечного взаимодействия уменьшение как I (q) при высоком q, так и наклона графиков масштабирования для белков из 100-1000 остатков (Fig. 4). Соответственно, мы считаем, что использование значений ν, выходящих за рамки трех канонических значений, обеспечивает законный и практичный подход для сравнения качества растворителей для систем разного размера и классификации, является ли вода хорошим или плохим растворителем для полимеров конечной длины.

Обсуждение

В то время как измерения SAXS указывают на то, что вода является хорошим растворителем (ν> 0,5) для развернутых полипептидов, исследования на основе FRET обычно сообщают об обратном (ν <0,5). Однако мы обнаруживаем, что сочетание улучшенных процедур анализа и более тщательного рассмотрения взаимодействий флуорофор-флуорофор и / или флуорофор-цепь достаточно для объяснения этого несоответствия. Эти находки приводят к единой картине, в которой развернутое состояние белков представляет собой SARW при высоком денатуранте и сжимается лишь незначительно (намного меньше, чем ранее сообщалось в литературе FRET) в отсутствие денатуранта.В частности, мы обнаружили, что мечение Alexa-488, обычно используемого флуорофора FRET, может изменить конформационный ансамбль IDP, уменьшая R _g и ν даже при низкой анизотропии флуоресценции относительно принятых пределов для свободного вращения флуорофора ( 42, 53). В сочетании с предыдущими исследованиями (9) аналогичные выводы можно сделать для PEG, известного SARW. Эти результаты, наряду с нашим предыдущим результатом о том, что неупорядоченные цепи претерпевают умеренное расширение денатуранта (45), и улучшенными методами извлечения значений R _g из данных FRET (40, 42–44), теперь обеспечивают достаточную основу для устранения несоответствий. между SAXS и FRET по размерам неупорядоченных белков.Фундаментальный и важный вывод полученной единой картины состоит в том, что даже в отсутствие денатурирующего агента вода остается хорошим растворителем для большинства развернутых белков.

Наши данные об эффектах, индуцированных флуорофором, согласуются с предыдущими выводами о том, что молекулярные размеры, выведенные из FRET, могут зависеть от используемой пары флуорофоров, при этом более гидрофобные флуорофоры приводят к большему сокращению (43). МД-моделирование с парой флуорофоров Alexa-488/594, например, привело к 10% сокращению IDP даже в 1 М мочевины (61).Аналогичным образом, недавнее исследование показало, что сигналы одномолекулярного FRET (smFRET) как от ДНК, так и от PEG зависят от условий растворителя, при которых размеры цепей, как ожидается, будут инвариантными (51). Однако, явно не согласившись с нашими данными, Fuertes et al. (42) провели измерения SAXS на пяти IDP с и без Alexa-488/594 и пришли к выводу, что в среднем изменения, наблюдаемые при добавлении флуорофоров, были минимальными. Однако при рассмотрении каждого белка в отдельности различия кажутся значительными по сравнению с узким диапазоном возможных значений.В частности, для пяти белков, охарактеризованных в этом исследовании, ν _{без метки} — ν _{с меткой} = 0,08, 0,03, 0,03, -0,02 и -0,04 (или 0,09, 0,06, 0,03, -0,02 и -0,08 при анализе с использованием наши процедуры; SI Приложение , рис. S5). Хотя Fuertes et al. (49) утверждают, что только один белок (NLS) демонстрирует индуцированное флуорофором сокращение, на самом деле четыре из пяти протестированных белков имели статистически значимые индуцированные флуорофором изменения в ν, причем более половины из них демонстрировали сокращение, индуцированное флуорофором (42). величины, аналогичной сокращению, которое мы наблюдали для меченного флуорофором PNt в воде (45) ( SI Приложение , рис.S5). Вместе эти данные подтверждают согласованную картину возмущений, вызванных флуорофором, которые вносят свой вклад в различия в величине и денатурирующей зависимости R _g , полученные с помощью SAXS и FRET.

Другой фактор, который, как предполагалось, способствовал расхождению между результатами SAXS и FRET, — это отклонения от пропорционального отношения между R _g и R _ee , которое может возникнуть при анализе гетерополимеров по сравнению с гомополимерами (42). В основе этой точки зрения лежит наблюдение, что если переоценить ансамбль (т.е., вычисляет R _g с использованием только подмножества конформаций), многие возможные значения R _ee согласуются с любым заданным R _g (и наоборот). Вместо того, чтобы выбирать подансамбль конформаций для соответствия паре параметров, мы выбрали альтернативный подход (45). С самого начала мы создаем физически правдоподобные ансамбли, создаем MFF, используя все эти ансамбли, и проверяем, соответствует ли он данным в целом. Мы обнаружили, что наша MFF точно соответствует всему профилю рассеяния (а не только R _g ), что обеспечивает надежную поддержку нашей процедуры.Поскольку мы можем вычислить значения R _g и R _ee непосредственно из базовых ансамблей, у нас есть процедура для получения этих двух параметров путем подгонки данных SAXS с нашим MFF. Мы обнаружили, что для реалистичных денатурированных ансамблей складываемых последовательностей смоделированные пары R _g и R _ee , а также их аналоги, определенные из профилей рассеяния, пропорциональны ( R ² > 0,99). Это оставляет красители как источник остающегося несоответствия между SAXS и FRET.

Используемый нами MFF несовершенен в том смысле, что несколько разные ансамбли могут быть подобраны с использованием одних и тех же параметров R _g и ν. Но погрешность этих двух параметров очень мала относительно их истинных значений (рис. 4 A — C ). Учет эффектов гетерополимера не меняет этого вывода. Из этих результатов мы заключаем, что SAXS хорошо подходит для извлечения как R _g , так и R _ee для неупорядоченных гетерополимеров, избегая при этом потенциальных артефактов из-за взаимодействий флуорофора с полипептидными цепями.Этот вывод не отрицает возможности FRET для измерения динамики, связывания и конформационных изменений; Однако в нем подчеркивается, что следует проявлять осторожность при использовании FRET для определения количественных расстояний в исходной немеченой биомолекуле.

Почти дюжина наборов данных IDP SAXS, представленных здесь, и ранее (45), как было показано, хорошо подходят для нашего общего MFF ( SI Приложение , Таблицы S1 и S3). Это открытие предполагает, что взаимодействия, приводящие к сокращению цепи, распространяются по белковым последовательностям.Водорастворимые, хорошо уложенные белковые последовательности обычно представляют собой хорошо перемешанные гетерополимеры с относительно небольшими участками последовательных гидрофобных остатков (62). Эти хорошо перемешанные последовательности имеют тенденцию вести себя как гомополимеры при измерении глобальными методами с низким разрешением, такими как SAXS. Действительно, мы продемонстрировали, что при достаточном качестве данных плохо смешанные последовательности можно идентифицировать по их отклонению от нашего MFF (рис. 4 D — F ). Большие отклонения могут возникать у некоторых IDP, особенно с частичным сворачиванием, необычным формированием паттерна последовательности (например.g., блок-сополимеры) и / или в условиях тесноты, которые могут выполнять определенные функции (63, 64).

Унифицированная картина, представленная здесь относительно исследований SAXS и FRET развернутого состояния в отсутствие денатуранта, укрепляет мнение о том, что вода является хорошим растворителем для большинства развернутых полипептидов, свойство, которое должно уменьшать неправильную укладку и агрегацию, одновременно облегчая синтез и транспорт. То, что большинство белков, тем не менее, легко сворачивается в воде, предполагает, что взаимодействия, управляющие сворачиванием, более стабилизирующие, т.е.е. преодолеть способность воды сольватировать развернутое состояние — чем те, которые способствуют неспецифическому коллапсу. Действительно, наблюдение, что, несмотря на минимальные доказательства значительного сокращения развернутого состояния даже при полном отсутствии денатуранта, некоторые белки остаются стабильно свернутыми до 6 M Gdn (41, 65), предполагает, что нативные взаимодействия гораздо более благоприятны, чем любые неспецифические взаимодействия, связанные с коллапсом. Однако, учитывая высокоспецифический характер взаимодействий, образующихся в нативных белках, их способность преодолевать сольватацию развернутой цепи, возможно, не удивительна.

Материалы и методы

PNtCC и PNtC были экспрессированы в Escherichia coli BL21 (DE3) pLysS и очищены от телец включения, как описано ранее (45, 52, 66), со следующими модификациями. После солюбилизации телец включения конструкции PNt повторно укладывали в 50 мМ Tris pH 7,2 с 50 мМ β-меркаптоэтанола (βME). Перед заключительной стадией эксклюзионной хроматографии к исходному белковому раствору добавляли 20 мМ βМЕ.

Дополнительную информацию об алкилировании белков и маркировке Alexa-488, а также об измерениях стационарной анизотропии, анализе данных SAXS и моделировании можно найти в приложении SI .

Примечание добавлено в пробу.

Во время обзора было опубликовано исследование, в котором флуорофоры участвовали в усилении аффинности связывания между двумя IDP (83).

Благодарности

Мы благодарим Шриниваса Чакраварти и М. Чемпиона за их помощь в области SAXS и масс-спектрометрии, соответственно; и О. Бильзель, Х. С. Чан, С. Такахаши, Р. Бест, Р. Паппу, Д. Тирумалай, Ю. Бай, А. Холхаус, Э. Мартин и Б. Шулер за полезные обсуждения. Эта работа была поддержана грантом NIH GM055694 (Т.R.S.) и GM130122 (для T.R.S. и P.L.C.), Фонд W. M. Keck Foundation (P.L.C.) и Национальный научный фонд гранты GRF DGE-1144082 (для J.A.R.) и MCB 1516959 (для C.R. Matthews, который финансировал периодические встречи между нашими лабораториями). Использование Усовершенствованного источника фотонов, пользовательского объекта Управления науки, находящегося в ведении Управления науки Министерства энергетики (DOE) Аргоннской национальной лабораторией, поддерживалось Министерством энергетики в рамках контракта DEAC02-06Ch21357. Этот проект поддержали NIH 2P41RR008630-18 и 9 P41 GM103622-18.

Сноски

• Вклад авторов: J.A.R., M.A.B., K.W.P., P.L.C. и T.R.S. спланированное исследование; J.A.R., M.A.B., A.M.Z., P.L.C. и T.R.S. проведенное исследование; J.A.R., M.A.B., P.L.C. и T.R.S. внесены новые реагенты / аналитические инструменты; J.A.R., M.A.B., P.L.C. и T.R.S. проанализированные данные; и J.A.R., M.A.B., K.W.P., P.L.C. и T.R.S. написал газету.

• Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

• Эта статья представляет собой прямое представление PNAS.

• Эта статья содержит вспомогательную информацию на сайте www.pnas.org/lookup/suppl/doi:10.1073/pnas.1813038116/-/DCSupplemental.

Обычно используемые флуорофоры FRET способствуют коллапсу неупорядоченного белка

РЕФЕРАТ

Размеры, которые развернутые белки, включая внутренне неупорядоченные белки (IDP), принимают при низком уровне денатуранта или без него, остаются спорными. Недавно мы разработали инновационную процедуру анализа профилей малоуглового рассеяния рентгеновских лучей (SAXS) и обнаружили, что даже относительно гидрофобные IDP остаются почти такими же расширенными, как и химически денатурированный ансамбль, что делает их значительно более расширенными, чем обычно предполагается с использованием резонансной передачи энергии флуоресценции ( FRET) измерения.Мы показываем здесь, что флуорофоры, типичные для используемых в FRET, могут вносить вклад в это несоответствие. В частности, мы обнаружили, что добавление Alexa488 к обычно расширенному IDP вызывает сокращение его ансамбля. Параллельно мы также проверили недавнее предположение о том, что результаты FRET и SAXS могут быть согласованы, если, в отличие от гомополимеров, радиус инерции (R _g ) развернутой белковой цепи может варьироваться независимо от ее сквозного расстояния (R _ee ). Для этого мы разработали процедуру анализа, которая может точно извлечь как R _g , так и R _ee из профилей SAXS, даже если они разделены.Используя эту процедуру, мы обнаружили, что R _g и R _ee остаются прочно связанными даже для гетерополимерных IDP. Таким образом, мы пришли к выводу, что в сочетании с улучшенными процедурами анализа как для SAXS, так и для FRET взаимодействий, управляемых флуорофором, достаточно, чтобы объяснить преобладание существующих данных относительно природы полипептидных цепей, развернутых в отсутствие денатуранта.

Белковые нарушения являются важным компонентом разнообразных клеточных процессов (1-4). В отличие от хорошо свернутых белков, которые населяют четко определенное функциональное состояние, внутренне неупорядоченные белки (IDP) и области (IDR) образуют широкий набор быстро взаимопревращающихся конформаций (3-9) с ошибками, которые плохо изучены и трудно измерить.Особый интерес представляет степень, в которой ВПЛ подвергаются уплотнению в физиологических условиях (т. Е. В отсутствие денатурирующих агентов). Такое уплотнение будет иметь широкое значение для нашего понимания сворачивания белков, взаимодействий и стабильности, а также действия денатурирующих веществ. Более того, понимание степени коллапса в неупорядоченных ансамблях имеет глубокие последствия для разработки реалистичного моделирования сворачивания белков и интерпретации измерений SAXS и FRET (10, 11).

Наше текущее понимание физико-химических принципов, лежащих в основе того, будет ли данная полипептидная цепь складываться, принимать неупорядоченный, но, тем не менее, компактный ансамбль, или вести себя как расширенное, полностью сольватированное случайное блуждание с самоизбеганием (SARW), недостаточно для объяснения существующих данных. . Большая часть этого понимания получена из исследований белков, разворачиваемых высокими концентрациями химических денатурантов, таких как мочевина и гидрохлорид гуанидина (Gdn). В этих условиях все согласны с тем, что белки ведут себя как SARW, что соответствует показателю Флори ( против ), равному 0.60 в соотношении R _g N ^v (где R _g = радиус инерции и N = длина полипептидной цепи). Напротив, отсутствует консенсус относительно поведения неупорядоченных полипептидных цепей при более низком денатуранте или без него. В частности, в то время как многочисленные FRET (12-26) и вычислительные исследования (12, 15, 19, 24, 27-30) утверждали, что расширенный, неупорядоченный ансамбль, обнаруженный при высоком денатуранте, разрушается при переходе на низкий денатурант или без него (v <0,5 ) (12, 15, 19, 24, 27-29, 31-36), почти такое же количество исследований SAXS сообщает об отсутствии или лишь незначительном сокращении при тех же условиях (11, 37-42).

Разнообразные недавние исследования пытались устранить это критическое несоответствие ( Рис. 1A ). Применение более реалистичных симуляций и аналитических моделей, например, приводит к полученным FRET расстояниям, имеющим меньшую денатурантную зависимость ( Рис. 1A, внизу ) (41, 43-45). Параллельно улучшен сбор и анализ данных SAXS, включая использование безразмерного графика Кратки, чтобы подчеркнуть изменения v, а не R _g (который будет увеличиваться при добавлении непертурбативных флуорофоров около концов цепи из-за дополнительная масса), аналогичным образом свидетельствует о незначительном сокращении при концентрациях гидрохлорида гуанидина (Gdn) ниже 2 M ( рис.1А, нижний ) (46, 47). Тем не менее, значительные расхождения сохраняются в отсутствие денатуранта, даже когда те же подходы используются для анализа одного и того же белка в идентичных условиях ( Фиг.1A-B , S1-S2 ; Movie S1 ). Были предприняты попытки уменьшить проявление несоответствия с помощью процедуры целостного анализа (43, 44), но эти анализы игнорируют его фундаментальное происхождение.

Рис. 1. Улучшенные процедуры анализа не устраняют расхождения между измерениями размеров IDP, полученными с помощью SAXS и FRET.

(A) Данные SAXS и FRET R17 (из (44)). Вверху, сравнение результатов, полученных при подборе данных FRET в предположении гауссовой цепи и данных SAXS с использованием приближения Гинье. Дно, данные SAXS и FRET подходят с использованием нашего метода анализа MFF и аналогичного подхода (46). Черная линия лучше всего подходит гиперболической линии тренда; серые линии — 95% доверительные интервалы. (B) Профили SAXS для R17 (слева, из (44)) и N98 (справа, из (43)), соответствующих MFF, значительно отличаются от ожидаемого поведения с использованием значений n, взятых из аналогичного анализа данных FRET.Сплошные линии обозначают область, используемую в процедуре подгонки; пунктирные линии представляют экстраполяцию к более высоким значениям q. Хотя было подобрано ~ 500 точек на кривую рассеяния, показанные данные были объединены только для целей презентации. Повороты или изгибы данных при более высоких значениях qR _g , скорее всего, связаны с ошибками при вычитании буфера, что является более сложным при высоком q, низкой концентрации образца и / или пониженном контрасте рассеяния (например, при высоком денатуранте, см. Методы). (C) Тенденции гидрофобности (Kyte-Doolittle) по сравнению с n в отсутствие денатуранта, полученного из SAXS, путем применения MFF к опубликованным данным, собранным из складываемых последовательностей белков (43, 46, 53-68).Также показаны результаты исследований FRET, рассчитанные как в (21) для опубликованных данных (21, 43). Красная линия тренда для результатов FRET взята из (21). Черная линия тренда лучше всего соответствует показанным результатам SAXS. Вверху, гистограмма гидрофобности репрезентативных белков в PDB (набор данных из (46)). (D) Кумулятивные распределения n для репрезентативных белков из PDB, выведенные из линий тренда, показанных на (C).

Чтобы всесторонне сравнить результаты SAXS и FRET, мы собрали опубликованные наборы данных для различных ВПЛ ( Рис.1С-Д ; Таблица S3 ). При анализе с использованием нашего моделирования и молекулярного форм-фактора (MFF) исследования SAXS неизменно находят v> 0,53 (среднее значение = 0,55), тогда как n, полученное из исследований FRET, обычно падает ниже 0,50 (среднее значение = 0,46). Это расхождение 0,09 является существенным по отношению ко всему диапазону n, который варьируется только от 0,6 (для SARW) до 0,5 (где внутрицепочечные взаимодействия одинаково благоприятны для взаимодействий растворитель-цепь) до 0,33 (для идеальной сферы; несколько выше для компактных несферических состояний).В общем, результаты SAXS предполагают, что конформационные ансамбли большинства развернутых белков и IDP с белковоподобным составом последовательностей расширяются, тогда как FRET предполагает иное ( Fig 1D ).

Вышеупомянутые и другие аналогичные результаты привели нас и других к поиску факторов, которые могут способствовать постоянному несоответствию между представлениями измерений IDP на основе SAXS и FRET (10, 30, 40, 43, 44, 48-51 ). Одна альтернатива, обозначаемая здесь «гипотеза разделения гетерополимера», утверждает, что гетерополимерная природа белков приводит к вариациям во взаимосвязи между R _g и расстоянием от конца до конца полипептидной цепи (R _ee ), соотношением это фиксированное отношение 6.3 для гомополимера, использующего SARW, независимо от длины цепи. Однако недавнее моделирование показывает, что это соотношение может значительно варьироваться для гетерополимеров (30, 40, 43, 44), причем это «разделение» предлагает возможное объяснение расхождения между SAXS (который чувствителен к R _g ) и FRET. (который чувствителен к R _ee ). Напротив, вторая гипотеза, обозначенная здесь «гипотеза взаимодействия флуорофоров», предполагает, что в отсутствие денатуранта флуорофоры FRET взаимодействуют друг с другом и / или с полипептидной цепью, вызывая конформационный ансамбль конструкций, модифицированных флуорофором, к сокращаются больше, чем в отсутствие этих флуорофоров (10, 46, 48, 51, 52).

Здесь мы обращаемся к гипотезам разделения и взаимодействия флуорофоров. Для достижения последнего мы использовали SAXS для характеристики радиуса инерции IDPs в присутствии и отсутствии модификаций флуорофора. Мы обнаружили, что мечение флуорофором, обычно используемым для исследований FRET, изменяет конформационный ансамбль, заселенный в отсутствие денатуранта, уменьшая его размеры, измеренные методом SAXS, на 10-20%. В сочетании с улучшенными процедурами анализа с использованием реалистичных смоделированных ансамблей как для SAXS, так и для FRET, этого индуцированного флуорофором коллапса достаточно для согласования результатов исследований SAXS и FRET.Параллельно с этим мы представляем измерения SAXS на полиэтиленгликоле (PEG), подтверждающие предыдущие сообщения о том, что добавление флуорофоров также вызывает сокращение этого, в противном случае, полимера SARW (10), открытие, которое недавно было подвергнуто сомнению (43). Более того, мы показываем, что SAXS может извлекать R _g , v и R _ee с точностью выше 97% при анализе с использованием нового MFF, разработанного для гетерополимеров. Эти симуляции достаточно точны для воспроизведения данных рассеяния без необходимости выбора только подгруппы конформаций, как это обычно используется в других процедурах подбора данных.Наконец, мы демонстрируем степень, в которой можно использовать небольшие отклонения от идеальности в данных SAXS, чтобы сделать вывод о смещениях внутри гетерополимерного конформационного ансамбля.

Результаты

Мечение флуорофором вызывает коллапс сильно расширенного ансамбля

Чтобы напрямую проверить гипотезу взаимодействия фтор-фора, мы измерили профили SAXS немодифицированного IDP и того же IDP, сайт-специфически модифицированного одной или двумя копиями обычно используемый флуорофор FRET Alexa488.Мы выбрали этот флуорофор, потому что он относительно небольшой и гидрофильный, и поэтому маловероятно, что он образует взаимодействия, которые могут изменить конформационный ансамбль (44). В качестве тестового белка мы использовали PNt, IDP с хорошим поведением, содержащий 334 аминоконцевых остатка пертактина (69). Для получения PNt, модифицированного моно- и двойным флуорофором, мы использовали реагирующий с тиолом Alexa488 для модификации остатков цистеина в положении 117 (PNtC-Alexa488) или положениях 29 и 117 (PNtCC-Alexa488). В качестве контроля мы использовали немодифицированный родительский белок (PNt) и алкилирование для получения конструкций без флуорофоров (PNtC-Alkd и PNtCC-Alkd).

Добавление Alexa488 уменьшает измеренные SAXS размеры PNt как в неденатурантных, так и в промежуточных денатурантных условиях ( Рис. 2A, Таблица S1 ). В частности, R _{, g} и v уменьшаются почти в два раза для модифицированного флуорофором PNtCC-Alexa488, чем для PNtCC-Alkd или PNt ( рис. 2B; таблица S1 ). Эти данные указывают на то, что присутствие Alexa488 приводит к коллапсу конформационного ансамбля PNt. Следует отметить, что в то время как 2 M Gdn является хорошим растворителем (v> 0.50) для немеченого белка мечение флуорофором приводит к измеримым внутримолекулярным взаимодействиям даже при этой относительно высокой концентрации денатуранта ( Рис. 2B, справа ). Величина этого зависящего от денатуранта расширения цепи качественно подобна наблюдаемой FRET для множества других белков, что согласуется с общим происхождением ( Fig. 1B ) (43, 44). Мы также наблюдали флуорофор-зависимое снижение средних значений R _{, g,} и v для конструкции с одной меткой PNtC-Alexa488 ( рис.2 ), что указывает на значимость взаимодействия флуорофор-белок. Следует отметить, что этот коллапс происходит, несмотря на установившиеся значения анизотропии флуоресценции для PNtCC-Alexa488, равные 0,11 и 0,08 в 0 и 2 М денатуранте, соответственно (, таблица S2 ), ниже порога, который обычно рассматривается как свидетельство свободного вращения белка. прикрепленные флуорофоры (43, 70). Из этого мы заключаем, что добавление даже относительно небольшого гидрофильного флуорофора, обычно используемого для измерений FRET, может значительно изменить размеры неупорядоченной полипептидной цепи (43, 44, 70).

Рис. 2. Добавление Alexa488 изменяет рассеяние PNt.

(A) Безразмерные графики Кратки для PNt дикого типа (серый), PNtCC-Alkylated (черный), PNtC-Alexa488 (одиночная метка, синий) и PNtCC-Alexa488 (двойная метка, красный) в 0,15 M KC1, 2 M Gdn , и 4 млн Gdn. Планки погрешностей представляют собой распространенную ошибку из стандартного отклонения, рассчитанного с учетом статистики подсчета (Пуассона), где σ = √counts. Данные были подогнаны и отображены в соответствии с процедурой, описанной на Рисунке 1 (см. Также Методы). Результаты для алкилированного PNt неотличимы от PNt дикого типа, но существуют значительные различия для PNt, меченного флуорофором Alexa488.(B) R _g и v как функция концентрации Gdn. Серые кривые воспроизводятся из предыдущего анализа PNt дикого типа (46).

Размеры ПЭГ, полученные с помощью SAXS, не зависят от концентрации полимера

В более раннем исследовании мы сообщали, что добавление Alexa488 / 594 к ПЭГ приводило к денатурант-зависимому изменению FRET (10), аналогичному тому, что наблюдается при измерениях FRET. развернутых белков. Однако сжатия не наблюдалось, когда эквивалентный немеченый полимер исследовали с помощью малоуглового рассеяния нейтронов.Было высказано предположение, что высокие (3 мМ) концентрации ПЭГ, использованные в этом исследовании рассеяния, замаскировали то, что в противном случае было бы зависимым от денатуранта изменением в R _g (43). Чтобы проверить это, мы измерили профили SAXS в диапазоне концентраций ПЭГ и денатуранта и не обнаружили никаких доказательств значительного изменения размеров полимера (, рис. 3, ). Аналогичным образом, при всех условиях мы наблюдаем показатель Флори, равный 0,60, что дополнительно подтверждает, что ПЭГ ведет себя как SARW независимо от концентрации денатуранта.Таким образом, гипотеза взаимодействия флуорофора остается простейшей интерпретацией денатурант-зависимых изменений FRET, наблюдаемых для PEG, меченного флуорофором (10).

Рис. 3. Профили SAXS ПЭГ не зависят от денатуранта.

(A) Безразмерные графики Кратки для PEG 24 кДа при 0,5 мМ и 0,05 мМ в 0,15 M KC1, 2 M Gdn и 4 M Gdn. Нормализованный профиль рассеяния PEG 24 кДа не изменяется от 0-4 M Gdn в широком диапазоне концентраций PEG. Для ясности профили рассеяния смещены по вертикали.Данные были подогнаны и отображены с использованием процедуры, описанной на фиг. 1. (B) R _g и v как функции концентрации Gdn для 0,5 мМ и 0,05 мМ PEG. Открытые и закрытые точки смещены по горизонтали для ясности.

Проверка гипотезы о разделении гетерополимера

В совокупности вышеприведенные наблюдения показывают, что флуорофоры, добавленные к IDP, приводят к значительному сокращению его конформационного ансамбля, что способствует различным выводам, сделанным из предыдущих исследований SAXS и FRET.Эти наблюдения, однако, не исключают возможность того, что разделение гетерополимера также вносит вклад в расхождение SAXS-FRET.

Чтобы выяснить, влияет ли развязка между R _ee и R _g на профиль SAXS, и как проверить нашу способность извлекать информацию из таких отклонений, мы использовали Upside , наш алгоритм моделирования полипептидной цепи на уровне Cβ (71 , 72), чтобы моделировать рассеяние для развернутых ансамблей из 50 белковых последовательностей из 250-650 остатков, случайно выбранных из PDB.В своей простейшей форме Upside представляет собой полипептидный каркас с шестью атомами на остаток (N, Cα, C, H, O, Cβ) и использует зависимые от соседей карты Рама-чандрана, полученные из библиотеки катушек (73). Такие модели способны воспроизводить R _g и NH остаточные диполярные связи (RDC), наблюдаемые в развернутых белках; эти два параметра чувствительны к глобальным и локальным свойствам позвоночника соответственно (74, 75). После создания ансамбля основных конформаций мы добавляем боковые цепи (76) и определяем профили рассеяния гидратированных версий (77).Мы назвали каждый Cβ либо гидрофобным, либо полярным (H / P), где единственные благоприятные взаимодействия происходят между атомами Cβ алифатических и / или ароматических остатков. Для каждой из 50 последовательностей использовали 30 различных сил β-взаимодействия. Это моделирование дало диапазон отклонений от G (v) = (R _ee / R _g ) ² , полученных из моделирования гомополимеров (рис. S4A). Из 1500 результирующих ансамблей мы определили R _g , v и R _ee как непосредственно из атомных координат моделируемого ансамбля, так и путем аппроксимации гидрированного профиля SAXS (с добавленными реалистичными случайными ошибками) каждого ансамбля с использованием наш MFF.Предполагаемое расстояние от конца до конца было определено с использованием соотношения, где G (v) была получена из моделирования гомополимеров.

По сравнению с истинными значениями, рассчитанными по координатам атомов, соответствия, полученные с использованием наших значений выхода MFF для R _g , v и R _ee со средним абсолютным отклонением только 1,3 Å, 0,011 и 4,2 Å соответственно что представляет собой среднюю абсолютную ошибку 3%, 2% и 4% ( Fig S3 ). Наибольшие отклонения наблюдаются для более компактных конструкций; для более расширенных конформаций (v> 0.54) ошибка ~ 2%. Чтобы еще больше уменьшить небольшую ошибку, связанную с применением нашего MFF, полученного из гомополимеров, к рассеянию гетерополимеров, мы создали новый молекулярный форм-фактор, MFF _het , используя моделирование гетерополимеров, описанное выше. Применение этого слегка модифицированного MFF снижает погрешности в подогнанных R _g , v и R _ee до 0,5, 0,005 и 2,7 Å, соответственно, что составляет 1%, 1% и 2% средней абсолютной ошибки ( Рис. 4A- С ). Эти результаты демонстрируют, что анализ SAXS возвращает точные значения R _ee в дополнение к R _g и v, что указывает на то, что R _g и R _ee связаны даже для неупорядоченных гетерополимеров.

Рис. 4. Подгонка смоделированных данных SAXS к реалистичным последовательностям гетерополимеров демонстрирует, что профили SAXS являются надежным показателем R _g , v и R _ee , а также информируют о степени неоднородности.

( AC ) Сравнение R _g , v и R _ee , рассчитанных на основе координат моделирования HP-модели, по сравнению с нашим MFF _het (R _g , v) с профилями SAXS со случайным добавлением экспериментальные ошибки. (D) Отклонения в концах v наблюдаются для гетерополимеров с менее хорошо перемешанными паттернами HP (полученными с помощью аппроксимации наклона зависимости внутрицепочечного расстояния R _{| i – j |} от разделение последовательностей, | i – j |, где | i – j |> N / 2). (E) Эффекты Δv _end при различных значениях v. (F) Экспериментальные данные, соответствующие MFF (R _g , v, Δv _end ), демонстрируют фторофорное мечение и образование петель с помощью дисульфида. связей в PNt вызывает значительные и измеримые отклонения.

Далее мы рассмотрели вопрос о том, чувствительны ли наши выводы к деталям нашей модели или энергетической функции. Чтобы проверить это, мы провели дополнительное моделирование с использованием более подробной версии алгоритма Upside , который способен сворачивать de novo белков короче 100 остатков (71, 72).В этой версии каждая из 20 боковых цепей представлена ​​многопозиционным эксцентриком, который позволяет детально упаковать сердечник. Энергетическая функция включает водородные связи, взаимодействия боковой цепи-боковой цепи и боковой цепи-скелета, зависимые от аминокислот потенциалы двугранного угла и член десольватации. Используя эту модель, мы сгенерировали 30 ансамблей для каждого из шести белков (PNt и пять других белков, случайно выбранных из списка 50 выше), используя короткие симуляции, которые выбирают только развернутое состояние.Ансамбли были получены путем моделирования обмена репликами в диапазоне температур 280–320 К, как описано ранее (71, 72). Значения v, полученные из этих ансамблей, варьировались от 0,4 до 0,6, в зависимости от температуры моделирования. Примечательно, что значения R _ee , R _g и v, полученные из этих ансамблей, находятся в хорошем согласии со значениями, определенными с помощью нашего MFF, с почти такой же точностью ( Рис. S3 ). Таким образом, наш вывод о том, что R _g и R _ee остаются связанными даже для гетерополимеров, устойчив к деталям моделирования.

Измерение отклонений от идеальности в гетерополимерах

MFF _het точно определяет общие размеры неупорядоченных гетерополимеров. Тем не менее, небольшие, но измеримые отклонения наблюдаются для белков в нашем тестовом наборе с менее хорошо смешанными паттернами HP ( рис. S4 ). Эти различия можно увидеть на графике внутримолекулярного распределения расстояний, где наклон при разделительных расстояниях | i-j |> N / 2 может отличаться от среднего наклона, который определяет глобальное значение v ( рис.4Д ). Мы определяем изменение наклона как Δv _конец ( Рис. 4D ). Отрицательные значения Δv _end коррелируют с преобладанием гидрофобных остатков на концах полипептидной последовательности ( фиг. 4D, S4C ) и отклонениями в G (v) ( фиг. S4A ) (R ² ). ~ 0,84). Профиль SAXS наиболее чувствителен к ΔVend при низком qR _g ( рис. 4E ).

Чтобы извлечь эту дополнительную информацию из данных SAXS, мы сгенерировали более общий трехпараметрический форм-фактор, MFF (R _g , v, Δv _end ) ( Рис.4E-F ; Фильм S2 ). Чтобы продемонстрировать его способность давать полезную информацию, мы подобрали данные из PNt, PNtCC-Alexa488 и циркулярного (с дисульфидными связями) PNtCC при 2 M Gdn ( рис. 4F ). Δv _конец снижается с ~ 0 для PNt до ~ -0,1 для PNtCC-Alexa488 и PNtCC, что согласуется с увеличением взаимодействий на аминоконце цепи. Эти данные демонстрируют, что для неупорядоченных полимеров SAXS чувствителен к зависимым от последовательности отклонениям от поведения гомополимера ( рис.4E-F ), при этом все еще имея возможность точно измерить R _{, g,} и v (, рис. 4A-C, ).

Обсуждение

В то время как измерения SAXS указывают на то, что вода является хорошим растворителем (v> 0,54) для развернутых полипептидов, измерения FRET обычно показывают противоположное (v <0,50). Однако мы обнаруживаем, что улучшенные процедуры анализа и взаимодействия флуорофор-флуорофор и / или флуорофор-цепь достаточны, чтобы объяснить это несоответствие. Таким образом, остается фундаментальный и важный вывод о том, что даже в отсутствие денатуранта вода является хорошим растворителем для большинства полипептидных последовательностей.В частности, мы обнаружили, что мечение с помощью Alexa488, флуорофора, обычно используемого для измерений FRET, может изменять конформационный ансамбль неупорядоченного белка, уменьшая R _g и v, даже когда анизотропия флуоресценции низка по сравнению с принятыми пределами для свободного флуорофора. вращение (43, 70). В сочетании с предыдущими исследованиями (10) аналогичные выводы можно сделать для PEG, известного SARW. Эти результаты, наряду с нашим предыдущим результатом о том, что неупорядоченные цепи претерпевают умеренное расширение денатуранта (46), и улучшенными методами извлечения значений R _g из данных FRET (41, 43-45), теперь обеспечивают достаточную основу для устранения несоответствий между SAXS и FRET о размерах неупорядоченных белков.

В соответствии с нашими выводами об эффектах, индуцированных флуорофором, другие обнаружили, что молекулярные размеры, определяемые FRET, могут зависеть от используемой пары флуорофоров, при этом более гидрофобные фторофоры приводят к меньшим (более компактным) размерам (44). Полноатомное моделирование молекулярной динамики с парой флуорофоров Alexa488 / 594, например, привело к 10% сокращению IDP даже в 1 М мочевины (78). Аналогичным образом, недавнее исследование показало, что сигналы smFRET как от ДНК, так и от PEG, которые часто называют «спектроскопическими линейками», зависят от условий растворителя, при которых размеры цепей, как ожидается, будут инвариантными (52).

Однако, явно не согласившись с нашими данными, Fuertes et al. (43) провели измерения SAXS на пяти IDP с Alexa488 / 594 и без них и пришли к выводу, что, в среднем , изменения, наблюдаемые при добавлении флуорофоров, были минимальными. Однако при рассмотрении каждого белка в отдельности различия кажутся значительными по сравнению с узким диапазоном возможных значений. В частности, для пяти белков, охарактеризованных в этом исследовании, v _unlabel -v _label = 0.08, 0,03, 0,03, -0,02, -0,04 (или 0,09, 0,06, 0,03, -0,02, -0,08 при анализе с использованием наших процедур; рис. S5). Хотя Fuertes et al. утверждают, что только один белок (NLS) демонстрирует сокращение, индуцированное флуорофором (50), на самом деле четыре из пяти протестированных белков имели статистически значимые индуцированные флуорофором изменения n, причем более половины из них демонстрировали сокращение, индуцированное флуорофором (43 ) по величине, аналогичной сокращению, которое мы наблюдали для меченного флуорофором PNt в воде (46) ( рис.S5 ). Вместе эти данные подтверждают согласованную картину возмущений, вызванных флуорофором, которые вносят свой вклад в различия в величине и денатурирующей зависимости R _g , полученные с помощью SAXS и FRET.

Другой фактор, который, как предполагалось, способствовал расхождению между результатами SAXS и FRET, — это отклонения от пропорционального соотношения между R _g и R _ee , возникающие при анализе гетерополимеров по сравнению с гомополимерами (43).В основе этой точки зрения лежит наблюдение, что если повторно взвесить ансамбль (т. Е. Вычислить R _g , используя только подмножество конформаций), многие возможные значения R _ee согласуются с любым заданным R _g (и наоборот. наоборот). Вместо того, чтобы выбирать суб-ансамбль конформаций, чтобы соответствовать паре параметров, мы приняли альтернативный подход (46). С самого начала мы создаем физически правдоподобные ансамбли, создаем MFF, используя все эти ансамбли, и проверяем, соответствует ли он данным в целом.Мы обнаружили, что наша MFF точно соответствует всему профилю рассеяния (а не только R _g ), что обеспечивает надежную поддержку нашей процедуры. Поскольку мы можем вычислить значения R _g и R _ee непосредственно из базовых ансамблей, у нас есть процедура для получения этих двух параметров путем подгонки данных SAXS с нашим MFF.

Этот MFF несовершенный в том смысле, что несколько разные ансамбли могут быть подобраны с использованием одних и тех же параметров R _{, g,} и v.Но ошибка для этих двух параметров очень мала по сравнению с их истинными значениями ( Рис. 4A-C ). Учет эффектов гетерополимера не меняет этого вывода. Из этих результатов мы заключаем, что SAXS хорошо подходит для извлечения как R _g , так и R _ee для неупорядоченных гетерополимеров, избегая при этом потенциальных артефактов из-за взаимодействий флуорофора с полипептидными цепями. Этот вывод не отрицает возможности FRET для измерения динамики, связывания и конформационных изменений; Однако в нем подчеркивается, что следует проявлять осторожность при использовании FRET для определения количественных расстояний в исходной немеченой биомолекуле.

Почти дюжина наборов данных IDP SAXS, представленных здесь, и ранее (46), как было показано, хорошо подходят для нашего общего MFF ( таблицы S1, S3 ). Это открытие предполагает, что взаимодействия, приводящие к сокращению цепи, распространяются по белковым последовательностям. Водорастворимые, хорошо уложенные белковые последовательности обычно представляют собой хорошо перемешанные гетерополимеры с относительно небольшими участками последовательных гидрофобных остатков (79). Эти хорошо перемешанные последовательности имеют тенденцию вести себя как гомополимеры при измерении глобальными методами с низким разрешением, такими как SAXS.Действительно, мы продемонстрировали, что при достаточном качестве данных плохо смешанные последовательности можно идентифицировать по их отклонению от нашего MFF ( рис. 4D-F ). Большие отклонения могут возникать для некоторых IDP, особенно с частичным сворачиванием, необычным формированием паттерна последовательности (например, блок-сополимеры) и / или в условиях скопления, которые могут выполнять определенные функции (80, 81).

Наши результаты подтверждают мнение о том, что вода является хорошим растворителем для большинства развернутых полипептидов, свойство, которое должно уменьшать неправильную укладку и агрегацию, одновременно облегчая синтез и транспорт.Тот факт, что большинство белков, тем не менее, легко сворачивается в воде, предполагает, что взаимодействия, которые управляют сворачиванием, являются более стабилизирующими, то есть легче преодолевают способность воды сольватировать развернутое состояние, чем те, которые способствуют неспецифическому коллапсу. Действительно, наблюдение, что, несмотря на минимальные доказательства значительного сокращения развернутого состояния даже при полном отсутствии денатуранта, некоторые белки остаются стабильно свернутыми до 6 M Gdn (42, 82), предполагает, что нативные взаимодействия намного более благоприятны, чем любые другие. неспецифические взаимодействия, связанные с коллапсом.Однако, учитывая высокоспецифический характер взаимодействий, образующихся в нативных белках, их предпочтительная способность преодолевать сольватацию развернутой цепи, возможно, не удивительна.

Материалы и методы

Очистка белка

PNtCC и PNtC были экспрессированы в E. coli BL21 (DE3) pLysS и очищены от телец включения, как описано ранее (46, 69, 83), со следующими модификациями. После солюбилизации телец включения конструкции PNt повторно укладывали в 50 мМ Трис, pH 7.2 с 50 мМ ß-меркаптоэтанолом (ßME). Перед заключительной стадией эксклюзионной хроматографии к исходному белковому раствору добавляли 20 мМ ßME.

Алкилирование

Очищенный PNtCC или PNtC (70 мкМ) в 50 мМ Трис, pH 8, 5 мМ ЭДТА восстанавливали 5 мМ ТСЕР в течение 30 мин при комнатной температуре при перемешивании. Алкилирование инициировали добавлением 10 мМ йодацетамида в воде. Конструкции PNt инкубировали 30 мин при комнатной температуре при перемешивании в темноте. Реакцию алкилирования гасили добавлением 20 мМ свежего DTT.Избыток реагентов удаляли с помощью эксклюзионной хроматографии (Superdex 16/60 S200). Эффективность алкилирования (100%) определяли масс-спектрометрией (МС).

Мечение Alexa488

конструкций PNt были сокращены, как указано выше. Малеимид Alexa488 C5 (ThermoFisher Scientific) ресуспендировали в ДМСО до 5 мг / мл и добавляли к восстановленному белку по каплям при перемешивании до конечного соотношения флуорофор: цистеин 5: 1. Реакция протекала в течение ночи при 4 ° C при перемешивании в темноте. Свободный флуорофор отделяли от меченого флуорофором белка с помощью эксклюзионной хроматографии (Superdex 16/60 S200), постоянно защищая от света.Эффективность маркировки (100% для PNtCC;> 50% для PNtC) определялась масс-спектрометрией.

Стационарная анизотропия

Измерения стационарной анизотропии проводили на флуорометре QM-6 T-формата (Horiba) при комнатной температуре в 50 мМ Трис pH 7,5 и 2 M Gdn, где указано. Образцы, содержащие 1 мкМ Alexa-488, возбуждали вертикально поляризованным светом с длиной волны 494 нм. Анизотропия (r) рассчитывалась с использованием излучения на длине волны 516 нм по формуле

Где G — поправочный коэффициент прибора.G рассчитывали по излучению free-Alexa488 на длине волны 516 нм после возбуждения горизонтально поляризованным светом 494 нм по уравнению

SAXS

Данные были собраны на линии пучка BioCAT в Advanced Photon Source (Аргоннская национальная лаборатория) с использованием колонки GE Lifesciences Superdex 200 SEC с рассеянием, представленным как q = 4π sinθ / γ, где 2θ — угол рассеяния, а γ — длина волны рентгеновского излучения (1 Å). Планки погрешностей для экспериментальных точек данных основаны на статистике подсчета (Пуассона), где стандартное отклонение определяется как σ = √ (фотоны), поскольку детектор рентгеновского излучения считает отдельные фотоны (84).На этапах усреднения и вычитания из буфера ошибка распространяется в квадратуре (например, для X = aU + bV, σX ² = (aσU) ² + (bσV) ² , где a и b — константы). При нанесении на график I (q) шкала погрешности представляет собой значение стандартного отклонения, масштабированное для таких инструментальных факторов, как поток рентгеновского излучения, телесный угол детектора и т. Д., В зависимости от распространения ошибок (для x = au, σ _x = aσ _U , когда a — постоянная величина). Точно так же, когда данные представлены на безразмерном графике Кратки, значение σ масштабируется на значение qR _g ² / I _o , полученное в результате подгонки данных.Для каждой кривой рассеяния собирается около 1000 точек данных. Только для целей презентации после процедуры аппроксимации (см. Ниже) точки данных объединяются для сохранения ясности и облегчения сравнения кривых рассеяния. Стандартное отклонение для данных с разбиением на интервалы было получено путем добавления ошибок в квадратуре (84).

Подбор данных

Вычитание буфера является более сложной задачей при высоких значениях q (из-за эффектов гидратации) и при высоких концентрациях денатуранта (из-за пониженного контраста рассеяния).По этим причинам, а также для поддержания согласованности критериев с нашим предыдущим исследованием (46), мы подгоняли все данные только к q = 0,15 или 0,10 Å ^-1 , в воде или поднятом денатуранте (выше 3 M), соответственно. Сплошные линии обозначают область, используемую при подборе, а пунктирные линии представляют экстраполяцию к более высоким значениям q. R _g и v были получены путем подгонки данных I (q) к q с использованием стандартной нелинейной процедуры наименьших квадратов ( χ ^{2 2 минимизация с данными, взвешенными по 1 / σ 2 в Mathemat-ica) к указанному MFF.Эта процедура является подходящей, поскольку ошибка представляет собой ожидаемое стандартное отклонение измерения (84), полученное на основе статистики подсчета с σ 2 = counts. Эта процедура подгонки привела к уменьшению χ 2 около 1,0, как и ожидалось для высококачественной подгонки с надлежащим анализом ошибок.}

Моделирование и генерация MFF

Расчеты были выполнены в Исследовательском вычислительном центре Чикагского университета с использованием версии нашей программы молекулярной динамики Upside (71, 72), модифицированной для взаимодействий на уровне Cβ, как это было сделано ранее (46).После создания ансамбля основных конформаций мы добавляем полные боковые цепи с помощью алгоритма TreePack (76) и определяем профили рассеяния гидратированных версий с помощью программы FOXS (77). Для расчета эффективности FRET мы использовали нашу MFF и ранее опубликованные модели (46) для определения безразмерной функции FRET, E ( ee ² > ^0,5 / R ₀ , v), где R ₀ — радиус Ферстера, и использовалась ожидаемая зависимость между R _g , R _ee , v и N.Сравнение наших методов SAXS / FRET и других показано на рис. S1-2.

Код для моделирования и анализа

Код и связанные файлы, необходимые для моделирования, а также весь анализ данных SAXS и FRET, описанный здесь, можно найти по адресу http: // www. (Будет добавлено до публикации). Кроме того, доступен наш веб-сервер http://sosnick.uchicago.edu/SAXSonIDPs для согласования данных SAXS с нашим MFF (v, R _g ).

Благодарности

Мы благодарим Шриниваса Чакраварти за помощь в измерениях МУРР и Мэтью Чэмпиона за помощь в масс-спектрометрических экспериментах.Эта работа была поддержана грантом R01 GM055694 (TRS) Национального института здравоохранения (NIH), Фондом У. М. Кека (PLC) и грантами NSF GRF DGE-1144082 (JAR) и MCB 1516959 (CR Matthews). Использование Усовершенствованного источника фотонов, учреждение научного пользователя, находящееся в ведении Управления науки Министерства энергетики (DOE) Аргоннской национальной лабораторией, было поддержано Министерством энергетики в рамках контракта № DEAC02-06Ch21357. Этот проект был поддержан NIH (2P41RR008630-18 и 9 P41 GM103622-18).

Сноски

• ↵ ¹ Показанная ошибка — это SEM трех измерений.

• ↵ ² q выражено в обратных ангстремах. Когда (59) включен в столбец цитирования, он предоставляет данные, полученные из других исследований.

Ссылки

1. 1.↵
2. 2.
3. 3.↵
4. 4.↵
5. 5.

   Ripaud L, et al. (2014) Сверхэкспрессия Q-богатых прионоподобных белков подавляет цитотоксичность polyQ и изменяет взаимодействие polyQ.Proc Natl Acad Sci U S A 111 (51): 18219–18224.

6. 6.
7. 7.
8. 8.
9. 9.
10. 10.↵

    Watkins HM, et al. (2015) Отрицательный контроль со случайной спиралью воспроизводит несоответствие между измерениями рассеяния и FRET размеров денатурированного белка. Proc Natl Acad Sci U S A 112 (21): 6631–6636.

11. 11.↵
12. 12.↵

    Merchant KA, Best RB, Louis JM, Gopich IV, & Eaton WA (2007) Характеристика развернутых состояний белков с помощью спектроскопии FRET одномолекул и молекулярного моделирования.Proc Natl Acad Sci U S A 104 (5): 1528–1533.

13. 13.

    Chung HS, Louis JM, & Eaton WA (2009) Экспериментальное определение верхней границы времени перехода при сворачивании белка из траекторий фотон за фотоном одной молекулы. Proc Natl Acad Sci U S A 106 (29): 11837–11844.

14. 14.

    Nettels D, Gopich IV, Hoffmann A, & Schuler B (2007) Сверхбыстрая динамика коллапса белка на основе статистики одиночных фотонов.Proc. Natl. Акад. Sci. США 104 (8): 2655–2660.

15. 15.↵

    Nettels D, et al. (2009) Одномолекулярная спектроскопия коллапса развернутых белков, вызванного температурой. Proc. Natl. Акад. Sci. США 106 (49): 20740–20745.

16. 16.

    Sherman E & Haran G (2006) Переход клубок-глобула в денатурированном состоянии небольшого белка. Proc. Natl. Акад. Sci. США 103 (31): 11539–11543.

17. 17.
18. 18.
19. 19.↵

    O’Brien EP, Ziv G, Haran G, Brooks BR, & Thirumalai D (2008) Действие денатурирующих веществ и осмолитов на белки точно предсказывается моделью молекулярного переноса. Proc. Natl. Акад. Sci. США 105 (36): 13403–13408.

20. 20.
21. 21.↵

    Hofmann H, et al. (2012) Законы масштабирования полимеров развернутых и внутренне неупорядоченных белков, количественно оцененные с помощью спектроскопии одиночных молекул. Proc. Natl. Акад. Sci. США 109 (40): 1615516160.

22. 22.
23. 23.

    Вальдауэр С.А., Бакаджин О. и Лапидус Л.Дж. (2010) Чрезвычайно медленная внутримолекулярная диффузия в развернутом протеине L. Proc Natl Acad Sci U S. A 107 (31): 13713–13717.

24. 24.↵
25. 25.
26. 26.↵
27. 27.↵

    Bowman GR и Pande VS (2010) Сложенные белковые состояния являются кинетическими центрами. Proc Natl Acad Sci U S. A 107 (24): 10890–10895.

28. 28.
29. 29.↵
30. 30.↵
31. 31.↵

    Sadqi M, Lapidus LJ, & Munoz V (2003) Насколько быстро происходит гидрофобный коллапс белков? Proc.Natl. Акад. Sci. США 100 (21): 12117–12122.

32. 32.
33. 33.
34. 34.
35. 35.
36. 36.↵
37. 37.↵
38. 38.
39. 39.
40. 40.↵
41. 41.↵
42. 41.↵
43. ↵

    Скиннер Дж. Дж. И др. (2014) Сравнительный анализ моделирования всех атомов с использованием водородного обмена. Proc Natl Acad Sci U S A 111 (45): 15975–15980.

44. 43.↵

    Fuertes G, et al. (2017) Разделение флуктуаций размера и формы в гетерополимерных последовательностях устраняет расхождения в SAXS vs.Измерения FRET. Proc Natl Acad Sci US A.

45. 44.↵
46. 45.↵
47. 46.↵
48. 47.↵
49. 48.↵
50. 49.
51. 50.↵
52. 51.↵
53. 52.↵
54. 53.↵

    Gates ZP, et al. (2017) Затрудняет кооперативное сворачивание и стабильность белка полипролина 2 с низкой последовательностью и отсутствием гидрофобного ядра. Proc Natl Acad Sci U S A 114 (9): 2241–2246.

55. 54.
56. 55.
57. 56.
58. 57.
59. 58.
60. 59.↵
61. 60.
62. 61.
63. 62.
64. 63.
65. 64.
66. 65.
67. 66.
68. 67.

    M, Колодцы и другие. (2008) Структура опухолевого супрессора p53 и его внутренне неупорядоченный N-концевой домен трансактивации. Proc Natl Acad Sci U S A 105 (15): 5762–5767.

69. 68.↵
70. 69.↵
71. 70.↵

    Азнаурян М и др. (2016) Комплексное структурное и динамическое представление развернутого белка из комбинации одномолекулярных FRET, ЯМР и SAXS.Proc Natl Acad Sci U S A 113 (37): E5389–5398.

72. 71.↵
73. 72.↵
74. 73.↵
75. 74.↵

    Jha AK, Colubri A, Freed KF, & Sosnick TR (2005) Статистическая модель катушки развернутого состояния: разрешение согласования проблема. Proc. Natl. Акад. Sci. США 102 (37): 13099–13104.

76. 75.↵

    Bernado P, et al. (2005) Структурная модель развернутых белков от остаточных диполярных связей и малоуглового рассеяния рентгеновских лучей.Proc Natl Acad Sci U S A 102 (47): 17002–17007.

77. 76.↵
78. 77.↵
79. 78.↵
80. 79.↵
81. 80.↵
82. 81.↵
83. 82.↵
84. 83.↵

    Junker M, et al. (2006) Механизм сворачивания бета-спирали пертактина предполагает общие темы для секреции и сворачивания белков-аутотранспортеров. Proc Natl Acad Sci U S A 103 (13): 4918–4923.

85. 84.↵

Производство рентгеновских лучей

---

Обзор

1. Через вольфрамовую нить накала пропускается ток, который нагревает ее.
2. При нагревании повышенная энергия позволяет электронам высвобождаться из нити за счет термоэлектронной эмиссии .
3. Электроны притягиваются к положительно заряженному аноду и поражают вольфрамовую мишень с максимальной энергией, определяемой потенциалом (напряжением) трубки.
4. По мере того, как электроны бомбардируют цель, они взаимодействуют посредством тормозного излучения и характерных взаимодействий, которые приводят к преобразованию энергии в тепло (99%) и рентгеновские фотоны (1%).
5. Рентгеновские фотоны испускаются в пучке с диапазоном энергий ( спектр рентгеновского излучения ) из окна трубки и образуют основу для формирования рентгеновского изображения.

---

Оборудование

Катод

Нить

• Изготовлен из тонкой (0,2 мм) вольфрамовой проволоки, потому что вольфрам:
  • имеет высокий атомный номер (A 184, Z 74)
  • — хороший термоэлектронный эмиттер (хорошо испускает электроны)
  • может быть изготовлен из тонкой проволоки
  • имеет очень высокую температуру плавления (3422 ° C)
• Размер нити зависит от размера фокусного пятна.Некоторые катоды имеют две нити для широкой и точной фокусировки

Фокусирующее кольцо

• Изготовлен из молибдена как:
  • высокая температура плавления
  • плохой термоэлектронный эмиттер, поэтому электроны не высвобождаются и не мешают электронному пучку от нити накала
• Отрицательно заряжен для фокусировки электронов к аноду и прекращения пространственного распространения

Анод

• Мишень из вольфрама по тем же причинам, что и для нити накала
• Рений, добавленный в вольфрам для предотвращения растрескивания анода при высоких температурах и использовании
• Установлен в анодный диск из молибдена со стержнем
• Положительно заряжен для притяжения электронов
• Устанавливается под углом для направления пучка рентгеновских фотонов вниз на пациента.Обычный угол 5º — 15º

Определения

• Цель, фокус, точка фокусировки, точка фокусировки: , где электроны попадают на анод
• Фактическое фокусное пятно: физическая область фокусной дорожки, на которую воздействуют
• Фокусная дорожка: часть анода, которую бомбардируют электроны. На вращающемся аноде это круговой путь
• Эффективное фокусное пятно: площадь фокусного пятна, которое проецируется из трубки

Стационарный анод: обычно используется только в стоматологической радиологии и системах лучевой терапии.Состоит из анода, закрепленного на месте, с постоянным потоком электронного луча на одну небольшую область.

Вращающийся анод: используется в большинстве рентгенографических исследований, включая мобильные наборы и рентгеноскопию. Состоит из диска с тонким скошенным ободом из вольфрама по окружности, который вращается с частотой 50 Гц. Поскольку он вращается, он преодолевает нагрев за счет того, что различные области подвергаются воздействию электронного потока с течением времени. Он состоит из:

• Диск из молибдена с тонкой вольфрамовой мишенью по окружности
• Шток из молибдена, который плохо проводит тепло и препятствует передаче тепла к металлическим подшипникам
• Подшипники с серебряной смазкой между штоком и ротором, не влияющие на теплопередачу, но допускающие очень быстрое вращение при низком сопротивлении
• Почерневший ротор для облегчения теплопередачи

Нагрев анода

Это главное ограничение производства рентгеновских лучей.

Тепло (Дж) = кВэ x мАс

или

Тепло (Дж) = w x кВп x мАс

ключ:

kVe = эффективное кВ
w = форма волны напряжения через рентгеновскую трубку. Чем более однородна форма сигнала, тем ниже тепловыделение.
кВp = пиковое значение кВ
мАс = текущее произведение времени выдержки

Обычно тепло отводится от анода излучением через вакуум в проводящее масло за пределами стеклянной оболочки. Молибденовый шток проводит очень мало тепла, чтобы предотвратить повреждение металлических подшипников.

Тепловая мощность

Более высокая теплоемкость означает, что температура материала повышается лишь на небольшую величину при значительном увеличении подводимого тепла.

Повышение температуры = приложенная энергия / тепловая мощность

Номинал трубки

Каждая машина имеет разную способность рассеивать тепло до того, как будет нанесен ущерб. Пропускная способность каждого фокусного пятна на машине указана в диаграммах номинальных характеристик трубки, предоставленных производителем. Они отображают максимальную мощность (кВ и мА), которую можно использовать в течение заданного времени воздействия до того, как система перегрузится.Максимально допустимая мощность уменьшается с:

• Увеличение времени выдержки
• Уменьшение эффективного размера фокусного пятна (тепло распространяется на меньшую площадь)
• Большие углы мишени для данного эффективного размера фокусного пятна (для данного эффективного размера фокусного пятна фактическая дорожка фокусного пятна меньше с большими углами анода. Это означает, что тепло распространяется по меньшей площади и скорость рассеивания тепла снижается)
• Уменьшение диаметра диска (распространение тепла по меньшей окружности и площади)
• Уменьшение скорости вращения диска

Другие факторы, которые следует учитывать:

• При использовании более высокого мА максимальное напряжение уменьшается, и наоборот.
• Для очень короткого исследования может потребоваться более высокая мощность для получения адекватного изображения. Это необходимо учитывать, поскольку трубка может не справиться с таким количеством тепла за такой короткий период времени.

Схема охлаждения анода

Анод должен не только выдерживать высокие температуры, но и быстро отводить тепло. Эта способность представлена ​​на диаграмме охлаждения анода. Он показывает, сколько времени требуется аноду, чтобы остыть от его максимального уровня тепла, и используется для предотвращения повреждения анода, давая достаточно времени для охлаждения между экспозициями.

Анодный эффект пятки

Рентгеновский луч ослабляется на выходе самим материалом мишени, вызывая постепенное уменьшение интенсивности от катода к направлению анода, поскольку больше материала мишени проходит через него. Следовательно, катодная сторона должна располагаться над зоной наибольшей плотности, поскольку это сторона с наиболее проникающим лучом. Уменьшение угла анода дает меньший эффективный размер фокусного пятна, что полезно при визуализации, но больший эффект пятки анода.Это приводит к менее однородному и более ослабленному лучу.

** меньший угол = меньший размер фокусного пятна, но больший эффект пятки анода **

прочие

Окно: из бериллия с алюминием или медью для фильтрации мягких рентгеновских лучей. Более мягкие (с меньшей энергией) рентгеновские фотоны влияют на дозу облучения пациента, но не на формирование изображения, поскольку у них недостаточно энергии для прохождения через пациента к детектору. Чтобы уменьшить эту избыточную дозу облучения пациента, эти рентгеновские фотоны удаляются.

Стеклянная оболочка: содержит вакуум, поэтому электроны не сталкиваются ни с чем, кроме цели.

Изоляционное масло: отводит тепло, выделяемое анодом, за счет теплопроводности.

Фильтр: Общая фильтрация должна быть> 2,5 мм алюминиевого эквивалента (это означает, что материал обеспечивает такую ​​же степень фильтрации, как и алюминий толщиной> 2,5 мм) для генератора> 110 кВ

Полная фильтрация = собственная фильтрация + дополнительная фильтрация (съемный фильтр)

Уже выпущен в мягкой обложке и на Kindle.
Написано радиологами для радиологов с большим количеством простых и понятных диаграмм, поясняющих сложные концепции.Отличный ресурс для пересмотра физики радиологии.

Примечание. Доступно не во всех регионах.

Примечание. Доступно не во всех регионах.

---

Получение рентгеновского луча

1. Произведенные электроны: термоэлектронная эмиссия

А ток проходит через катодную нить накала, которая нагревается и высвобождает электроны за счет термоэлектронной эмиссии. Электроны ускоряются к положительному аноду за счет напряжения трубки, приложенного к трубке.На аноде 99% энергии электронов преобразуется в тепло и только 1% преобразуется в рентгеновские фотоны.

Ускоряющий потенциал

Ускоряющий потенциал — это напряжение, приложенное к трубке для создания градиента от отрицательного к положительному на трубке и ускорения электронов на аноде. Обычно это 50–150 кВ для рентгенографии, 25–40 кВ для маммографии и 40–110 кВ для рентгеноскопии. Электропитание в Великобритании составляет 230 В и 50 Гц переменного тока.Когда заряд отрицательный, ускоряющий потенциал меняется на противоположное (катод становится положительным, а анод становится отрицательным). Это означает, что электроны не ускоряются по направлению к аноду для получения рентгеновского луча. Идеальная форма волны для визуализации — это постоянная положительная прямоугольная волна, так что поток электронов непрерывно направлен к аноду. Мы можем преобразовать стандартную синусоидальную волну в прямоугольную с помощью выпрямления.

Двухполупериодное выпрямление: использование схемы выпрямления для преобразования отрицательного напряжения в положительное.Однако все еще есть точки, в которых напряжение равно нулю, и в большинстве случаев оно меньше максимального значения кВ (кВп). Это привело бы к появлению большого количества фотонов с более низкой энергией. Есть два механизма выпрямления, которые предотвращают слишком много фотонов с более низкой энергией:

1. Трехфазное питание: используются три источника питания, каждый из которых применяется в разное время. «Пульсация» (разница между максимальным и минимальным током) составляет около 15% кВп.
2. Генератор высокой частоты: может обеспечивать почти постоянный потенциал.Электропитание включается и выключается быстро (14 кГц), что затем может быть исправлено. Они намного компактнее, чем трехфазный источник питания, и используются чаще.

Влияние выпрямления на спектр

• Увеличенная средняя энергия фотонов — на меньше фотонов с более низкой энергией
• Повышенная мощность рентгеновского излучения — остается ближе к максимуму дольше
• Более короткая экспозиция — при увеличении выхода, можно проводить экспозицию в течение более короткого времени для получения того же выхода
• Более низкая доза пациента — Повышенная средняя энергия означает меньшее количество фотонов с низкой энергией, которые влияют на дозу пациента, но не влияют на окончательное изображение

Ток накала

Ток (обычно 10 А) нагревает нить накала, чтобы передать достаточно энергии электронам, чтобы они высвободились i.е. он влияет на количество выпущенных электронов.

Ток трубки

Это поток электронов к аноду, обычно 0,5 — 1000 мА.

Сводка

• Ток накала подается через вольфрамовую катодную нить накала (10 А) и влияет на число выпущенных электронов.
• Ток трубки подается через рентгеновскую трубку от катода к аноду и влияет на энергию и количество выпущенных электронов .

2. Производство рентгеновского излучения на аноде

Электроны ударяются об анод с максимальной кинетической энергией kVp и взаимодействуют с анодом, теряя энергию через:

• Упругое взаимодействие: редко, происходит только при kVp <10 эВ. Электроны взаимодействуют, но сохраняют всю свою энергию
• Неэластичное взаимодействие: вызывает возбуждение / ионизацию в атомах и высвобождает энергию посредством электромагнитного (ЭМ) излучения и тепловой энергии

Взаимодействия

На аноде электроны могут взаимодействовать с атомами анода несколькими способами, создавая рентгеновские фотоны.

1. Взаимодействие с внешней оболочкой: высвобождение малой энергии ЭМ и быстрое преобразование в тепловую энергию
2. Взаимодействие с внутренней оболочкой: производит характеристическое излучение
3. Взаимодействие с ядерным полем: aka Bremsstahlung

1. Характеристическое излучение

1. Бомбардирующий электрон выбивает электрон с k-оболочкой или l-оболочкой.
2. Электрон высшей оболочки движется в пустое пространство.
3. Это движение к более низкому энергетическому состоянию высвобождает энергию в виде рентгеновского фотона.
4. Бомбардирующий электрон продолжает свой путь, но отклоняется.

Это называется «характеристикой», поскольку энергия испускаемых электронов зависит от материала анода , а не от напряжения трубки . Энергия выделяется в характерных значениях, соответствующих энергиям связи различных оболочек.

Для вольфрама:
Ek — El (также известный как Kα) = 59.3 кэВ
Ek — Em (также известный как Kβ) = 67,6 кэВ

2. Тормозное излучение

1. Бомбардирующий электрон приближается к ядру.
2. Электрон отклоняется электрическим полем ядра.
3. Энергетическая потеря от этого отклонения высвобождается в виде фотона ( Тормозное излучение, ).

Тормозное излучение вызывает выделение спектра энергии фотонов. 80% рентгеновского излучения излучается тормозным излучением.В редких случаях электрон полностью останавливается и отдает всю свою энергию в виде фотона. Чаще происходит серия взаимодействий, в которых электрон теряет энергию в несколько этапов.

Характеристическое излучение	Тормозное излучение
Учитывает только небольшой процент произведенных рентгеновских фотонов	На долю рентгеновского луча приходится 80% фотонов
Бомбардирующий электрон взаимодействует с электроном внутренней оболочки	Бомбардировочный электрон взаимодействует со всем атомом
Излучение, выделяющееся из-за падения электрона в более низкое энергетическое состояние	Излучение, выделяющееся при отклонении бомбардирующего электрона в результате притяжения атома
Излучение имеет удельную энергию	Излучение имеет широкий диапазон энергий
Энергия рентгеновского фотона зависит от элемента атомов мишени, а не от напряжения трубки	Энергия рентгеновских фотонов зависит от напряжения трубки

Сводка шагов

1. Ток накала , пропускаемый через вольфрамовую нить накала на катоде.
2. Нагревает нить для выработки энергии, достаточной для преодоления энергии связи электронов ( термоэлектронная эмиссия, ).
3. Электроны, выпущенные из нити накала.
4. Напряжение трубки приложено к рентгеновской трубке.
5. Электроны, следовательно, ускоряются по направлению к положительно заряженному аноду, что дает им определенную энергию .
6. Электроны ударяются об анод, и энергия, выделяемая при взаимодействии с атомами анода, производит рентгеновских фотонов .
7. Эти рентгеновские фотоны покидают рентгеновскую трубку через окно в рентгеновском луче по направлению к пациенту.
8. Они проходят через пациента к детектору для получения рентгеновского изображения (этот раздел рассматривается в следующей главе «Взаимодействие с веществом»).

---

Рентгеновский спектр

Результирующий спектр энергии выделяемых рентгеновских фотонов показан на графике. При определенной фотоэнергии есть пики, при которых испускается больше рентгеновских лучей.Они имеют характеристическое излучение энергий и различаются для разных материалов. Остальная часть графика — это в основном тормозное излучение, в котором генерируются фотоны с диапазоном энергий. На тормозное излучение приходится большая часть производства рентгеновских фотонов.

Качество луча: способность луча проникать в объект или энергия луча.

Количество пучка: Количество рентгеновских фотонов в пучке

Изменение рентгеновского спектра

---

Увеличение потенциала трубки (кВ)

Увеличилось:

• Количество рентгеновских фотонов
• Средняя энергия
• Максимальная энергия

Если кВ достаточно велико, выработанная характерная энергия

---

Увеличение тока трубки (мА)

Увеличение количества рентгеновских фотонов

Без изменений:

• Характеристическая энергия
• Средняя энергия
• Минимальная энергия
• Максимальная энергия

---

Фильтрация

Меньше фотонов с более низкой энергией

Увеличилось:

• Средняя энергия фотонов

Уменьшено:

---

Форма сигнала тока

Наличие более равномерного тока (выпрямленного) приводит к увеличению:

• Средняя энергия
• Количество рентгеновских фотонов
• То же максимальное значение кэВ

---

Увеличение атомного номера цели

Увеличилось:

• Количество рентгеновских фотонов
• Характеристическая энергия

Следующая страница: Взаимодействие с материей

.