Разное

Устройство передней подвески лада гранта: Детали передней подвески автомобилей Лада Калина, Гранта

Содержание

Детали передней подвески автомобилей Лада Калина, Гранта

_____________________________________________________________________________

Детали передней подвески автомобилей Лада Калина, Гранта

Передняя подвеска Лада Калина/Гранта ВАЗ-2190 независимая, с телескопическими поворотными стойками, поперечными рычагами, продольными растяжками рычагов и стабилизатором поперечной устойчивости торсионного типа.

Стойка передней подвески состоит из корпуса, в котором установлен гидравлический телескопический амортизатор винтовой пружины и верхней опоры. Снаружи к корпусу стойки приварены кронштейн для крепления поворотного кулака, поворотный рычаг и нижняя опорная чашка пружины.

В зависимости от комплектации автомобиля стойка может быть с бочкообразной или конической пружиной. Пружина своим нижним витком упирается в нижнюю опорную чашку, а верхним — в верхнюю опорную чашку, закрепленную на штоке амортизатора.

Также на штоке амортизатора Лада Гранта/Калина установлена верхняя опора стойки, состоящая из корпуса, резиновой подушки и подшипника. Корпус опоры крепится к кузову автомобиля тремя шпильками с гайками.

Подшипник позволяет штоку амортизатора поворачиваться в опоре при повороте стойки, а резиновый буфер препятствует передаче вибраций на корпус автомобиля.

Шток амортизатора защищён от грязи и пыли пластмассовым кожухом. При пробое подвески ход штока ограничен буфером хода сжатия.

Поворотный рычаг стойки соединяется с рулевой тягой через шаровой палец. Изменение длины тяги при помощи ее соединительной муфты позволяет регулировать схождение передних колес.

Рис.27. Регулировочная втулка рулевой тяги Лада Гранта/Калина

1 — наконечник рулевой тяги; 2 регулировочная втулка; 3 — рулевая тяга

Поворотный кулак крепится к кронштейну стойки двумя болтами с гайками. Верхнее отверстие кронштейна выполнено овальным, а установленный в него болт имеет эксцентриковый поясок и эксцентриковую шайбу.

При вращении этого болта поворотный кулак смещается относительно стойки, поворачиваясь на болте нижнего крепления, как на оси. Благодаря этому изменяется угол между стойкой и кулаком, что в свою очередь позволяет регулировать развал переднего колеса.

Снизу поворотный кулак соединен с поперечным рычагом передней подвески Лада Калина/Гранта ВАЗ-2190 при помощи шаровой опоры.

От перемещения поперечный рычаг удерживается растяжкой, которая своим задним концом крепится через резинометаллический шарнир к рычагу, а передним через подушку к кронштейну, закрепленному на кузове автомобиля.

Изменяя количество шайб в переднем и заднем креплениях растяжки, можно изменять положение рычага, регулируя тем самым угол продольного наклона оси поворота колеса.

Концы стабилизатора поперечной устойчивости при помощи стоек соединены с поперечными рычагами передней подвески автомобиля Лада Калина/Гранта ВАЗ-2190. Центральная часть стабилизатора закреплена через резиновые подушки на кузове скобами.

Движение одного из рычагов через стабилизатор передается на второй. Это позволяет частично синхронизировать работу обеих сторон подвески и тем самым уменьшить раскачивание автомобиля на неровной дороге и крены в поворотах.

Рис.28. Передняя подвеска Лада Гранта/Калина

1 — штанга стабилизатора; 2 — скоба крепления штанги стабилизатора; 3 — кронштейн поперечного рычага; 4 — поперечный рычаг; 5 — стойка стабилизатора; 6 — телескопическая стойка; 7 — шаровая опора; 8 — поворотный кулак; 9 — продольная растяжка; 10 — кронштейн растяжки

После ремонта любых элементов подвески или рулевого управления обязательно проверьте углы установки передних колес. Качественно провести проверку и регулировку углов установки передних колес можно только в условиях сервисного предприятия, имеющего специальный стенд для выполнения регулировочных работ.

Рис.29. Крепление поворотного кулака к стойке Лада Гранта/Калина

1 — кронштейн крепления поворотного кулака; 2 — корпус стойки; 3 — болт (эксцентриковый) верхнего крепления поворотного кулака; 4 — болт нижнего крепления поворотного кулака; 5 — поворотный кулак

В отверстие поворотного кулака запрессован и зафиксирован двумя стопорными кольцами двухрядный шариковый подшипник. Во внутреннее кольцо подшипника запрессована ступица колеса.

Рис.30. Крепление продольной растяжки к поперечному рычагу передней подвески Лада Калина/Гранта ВАЗ-2190

1 — задний конец продольной растяжки; 2 — регулировочные шайбы; 3 — упорная шайба; 4 — резинометаллический шарнир; 5 — поперечный рычаг подвески

Замена продольной растяжки передней подвески Лада Гранта/Калина

При регулировке угла продольного наклона оси поворота в сервисном центре продольную растяжку будут снимать повторно, поэтому замену растяжки лучше проводить там же, одновременно с регулировкой.

Чтобы при установке старой продольной растяжки минимизировать нарушение регулировки угла продольного наклона оси поворота, подсчитайте и запишите количество регулировочных шайб, находящихся на заднем и переднем концах растяжки.

— Снимаем кронштейн крепления растяжки передней подвески.

— Удерживая растяжку от проворачивания рожковым ключом на 24 мм, вторым ключом того же размера с длинным воротком отворачиваем гайку крепления переднего конца продольной растяжки к поперечному рычагу.

— Снимаем с растяжки упорную шайбу, извлекаем задний конец растяжки из резинометаллического шарнира поперечного рычага и снимаем с растяжки
регулировочные шайбы.

— Устанавливаем продольную растяжку в обратной последовательности.

— При установке регулировочной шайбы необходимо, чтобы фаска на ее внутренней кромке была обращена к растяжке.

— После замены продольной растяжки необходимо проверить углы установки передних колес в сервисном центре.

Замена шаровой опоры стойки Лада Гранта/Калина

— Снимаем переднее колесо автомобиля.

— Отворачиваем гайку пальца шаровой опоры

— Отворачиваем два болта крепления шаровой опоры к поворотному кулаку.

— Устанавливаем на конец рычага съемник.

— Заворачивая болт съемника, выпрессовываем палец шаровой опоры из отверстия рычага и снимаем шаровую опору.

— Если предстоит установка шаровой опоры, бывшей в эксплуатации, предварительно снимите с нее защитный чехол и заложите смазку в шарнир шаровой опоры и на внутреннюю поверхность защитного чехла опоры.

— Устанавливаем шаровую опору в последовательности, обратной снятию.

Замена поперечного рычага передней подвески Лада Калина/Гранта ВАЗ-2190

— Снимаем переднее колесо.

— Снимаем брызговик двигателя.

— Отворачиваем два болта крепления шаровой опоры к поворотному кулаку.

— Вынимаем болт крепления стойки стабилизатора к рычагу.

— Отворачиваем гайку болта крепления поперечного рычага к кронштейну кузова и вынимаем болт.

— Чтобы при установке рычага минимизировать нарушение регулировки угла продольного наклона оси поворота, подсчитайте и запишите количество регулировочных шайб, находящихся на заднем конце продольной растяжки.

— Удерживая растяжку от проворачивания рожковым ключом на 24 мм, торцовым ключом того же размера с длинным воротком отворачиваем гайку заднего конца растяжки.

— Снимаем с заднего конца продольной растяжки упорную шайбу.

— Снимаем нижний рычаг в сборе с шаровой опорой с продольной растяжки передней подвески Лада Калина/Гранта ВАЗ-2190.

— Чтобы не потерять, снимаем с растяжки упорную и регулировочные шайбы.

— При необходимости зажимаем рычаг в тисках и выпрессовываем из него палец шаровой опоры.

— Устанавливаем рычаг в обратной последовательности.

— При установке регулировочной шайбы необходимо, чтобы фаска на ее внутренней кромке была обращена к растяжке.

— Окончательно затягивайте гайки крепления резинометаллических шарниров только после установки автомобиля на колеса.

Замена стойки передней подвески Лада Гранта/Калина

— Стойки следует заменять парой, даже если неисправна только одна.

— Снимаем переднее колесо

— Отсоединяем наконечник рулевой тяги от поворотного рычага стойки.

— Если снимаете стойку для разборки, ослабьте затяжку гайки штока амортизатора специальным приспособлением или накидным ключом на 22 мм, удерживая шток рожковым ключом на 9 мм.

— Ослабляем затяжку трех гаек крепления верхней опоры стойки к кузову автомобиля Лада Гранта/Калина.

— Чтобы минимизировать нарушение угла развала передних колес, кернером или краской наносим метки на болт верхнего крепления поворотного кулака и на кронштейн стойки.

— Отворачиваем гайки болтов верхнего и нижнего крепления поворотного кулака к стойке, удерживая болты от проворачивания накидным ключом на 17 мм.

— Снимаем с болтов шайбы (шайба верхнего болта эксцентриковая) и вынимаем болты.

— Отверткой или монтажной лопаткой выводим поворотный кулак из зацепления с кронштейном стойки.

— Выводим тормозной шланг из кронштейна стойки.

— Отворачиваем гайки крепления верхней опоры стойки и снимаем стойку в сборе.

— Устанавливаем стойку в обратной последовательности, при этом метка (стрелка) на верхней опоре должна быть обращена к передней части автомобиля.

— Гайки крепления верхней опоры к кузову затягиваем моментом 19,6— 24,2 Нм (2,0-2,4 кг/см).

— Перед затягиванием гаек болтов крепления поворотного кулака к стойке совмещаем метки, нанесенные на эксцентриковом болте и кронштейне.

— Затягиваем гайки болтов моментом 77,5-96,1 Нм (7,9-9,8 кг/см).

Замена стоек стабилизатора поперечной устойчивости Лада Калина/Гранта ВАЗ-2190

— Отворачиваем гайку болта крепления стойки стабилизатора к поперечному рычагу.

— При помощи бородка подходящего диаметра выбиваем болт из стойки и рычага.

— Смазываем конец штанги стабилизатора мыльным раствором.

— Вставляем в отверстие нижнего сайлент-блока бородок и, используя его как рычаг, проворачиваем стойку из стороны в сторону, постепенно сдвигая ее к краю штанги.

— Снимаем стойку со штанги.

— Аналогично снимаем стойку с другого конца штанги стабилизатора.

— Устанавливаем стойки в обратной последовательности, предварительно смазав концы штанги стабилизатора мыльным раствором.

Замена подшипника ступицы переднего колеса Лада Гранта/Калина

Подшипник ступицы переднего колеса нерегулируемый. При появлении люфта в подшипнике его необходимо заменить.

Выпрессовывайте подшипник ступицы только в случае его замены, поскольку при демонтаже он, скорее всего, разрушится.

— Снимаем декоративный колпак с колеса.

— Подкладываем противооткатные упоры под передние колеса автомобиля.

— Постукивая по кернеру молотком, отгибаем замятый в проточки вала привода край гайки (в двух местах).

— Помощник нажимает педаль тормоза и удерживает ее в нажатом положении.

— Ослабляем затяжку гайки ступицы переднего колеса Лада Гранта/Калина.

— Снимаем переднее колесо и отворачиваем гайку ступицы.

— Снимаем суппорт тормозного механизма, не отсоединяя от него тормозной шланг.

— Снимаем тормозной диск.

— Отворачиваем два болта крепления шаровой опоры к поворотному кулаку.

— Отворачиваем на несколько оборотов гайки крепления верхней опоры стойки к кузову.

— Отжав нижний рычаг подвески вниз, отводим нижний конец стойки в сторону и выводим из ступицы хвостовик наружного ШРУС.

— Упираем лапы съемника в поворотный кулак и, вращая гайку болта, выпрессовываем ступицу из поворотного кулака.

— Съемником сжимаем и снимаем стопорное кольцо с наружной стороны подшипника ступицы.

— С обратной стороны поворотного кулака съемником сжимаем и снимаем другое стопорное кольцо подшипника ступицы.

— Устанавливаем приспособление и выпрессовываем подшипник из поворотного кулака Лада Калина/Гранта ВАЗ-2190.

— Если на ступице осталось внутреннее кольцо подшипника, спрессовываем его съемником из набора, либо универсальным двухзахватным съемником (для установки лап съемника на ступице имеются специальные выемки).

— Тщательно очищаем от грязи и коррозии посадочное отверстие под подшипник в поворотном кулаке.

— Съемником устанавливаем стопорное кольцо с наружной стороны подшипника.

— Запрессовываем новый подшипник в поворотный кулак до упора в стопорное кольцо.

— Съемником устанавливаем стопорное кольцо с внутренней стороны подшипника.

— Приспособлением запрессовываем ступицу во внутреннее кольцо подшипника.

— Вставляем вал привода в шлицевое отверстие ступицы.

— Надеваем на вал упорную шайбу и заворачиваем новую гайку ступицы.

— Устанавливаем все снятые детали в обратной последовательности.

— Устанавливаем колесо и опускаем машину. Фиксируем колесо противооткатными упорами, а помощник нажимает педаль тормоза.

— Затягиваем гайку подшипника ступицы моментом 225,6—247,2 Нм (23-25,2 кг/см).

— Заминаем край гайки в проточки вала привода (в двух местах) и устанавливаем колпак ступицы.

_____________________________________________________________________________

_____________________________________________________________________________

Лада Гранта, Калина

_____________________________________________________________________________

_____________________________________________________________________________

ВАЗ-2110

готовим к зиме ходовую и трансмиссию — журнал За рулем

Если вы собираетесь ездить зимой на автомобиле, неплохо было бы проверить состояние ходовой части и трансмиссии, чтобы не пришлось заниматься ремонтом прямо на дороге, в грязной снежной жиже. Любой владелец Granta может сэкономить и время, и деньги, если проверит авто самостоятельно. Сегодня речь — о ходовой и трансмиссии.

Проверку ходовой части и трансмиссии выполняем через каждые 15 тыс. км пробега.

Работу выполняем на смотровой канаве или эстакаде.

На деталях ходовой части (колесах, рычагах подвесок, стабилизаторе поперечной устойчивости, балке задней подвески, амортизаторах и пружинах подвесок) и трансмиссии (валах приводов передних колес) не должно быть деформаций, трещин и других механических повреждений, влияющих на форму и прочность деталей.

Поочередно вывешивая передние колеса (при этом автомобиль должен быть надежно зафиксирован на опорной стойке), проверяем состояние подшипников ступиц колес.

Используйте опорные стойки только заводского изготовления.

Колесо от руки должно вращаться равномерно, без заеданий и стуков.

Granta 38 4 новый размер

Взявшись за колесо в вертикальной плоскости, поочередно резко тянем верхнюю часть колеса на себя, а нижнюю — от себя, и наоборот.

Убеждаемся в отсутствии люфта (стука). При наличии стука на переднем колесе просим помощника нажать педаль тормоза. Если при этом стук пропал, значит, неисправен подшипник ступицы, а если стук остался — то, скорее всего, изношена шаровая опора.

Подшипники ступиц передних и задних колес не регулируются и при наличии люфта подлежат замене.

Для проверки исправности шаровой опоры вставляем монтажную лопатку между рычагом подвески и корпусом шаровой опоры. Не повредите при этом чехол шаровой опоры.

Granta 39 1 новый размер

Отжимая монтажной лопаткой рычаг, следим за перемещением головки рычага относительно корпуса шаровой опоры.

При наличии люфта в соединении заменяем шаровую опору.

Granta 39 2 новый размер

Проверяем состояние защитных чехлов шаровых опор.

Шаровые опоры с порванными, потрескавшимися чехлами заменяем.

Для проверки сайлент-блока рычага передней подвески…

Granta 39 3 новый размер

…вставляем монтажную лопатку между кронштейном кузова и головкой рычага…

…и пытаемся сдвинуть рычаг вдоль его оси и вдоль оси болта. Если рычаг перемещается свободно, без усилий, значит, сильно изношен или поврежден сайлент-блок рычага и его необходимо заменить. Разрывы, растрескивания и выпучивание резиновой втулки сайлент-блока недопустимы.

Granta 39 4 новый размер

Проверяем состояние сайлент-блоков передних и задних концов растяжек.

Разрывы, растрескивания выпучивание резины сайлент-блоков недопустимы.

Granta 39 5 новый размер

Осматриваем подушки штанги стабилизатора поперечной устойчивости и резиновые втулки стоек стабилизатора.

При обнаружении разрывов, растрескиваний и сильной деформации на резиновых подушках и втулках их необходимо заменить.

Поочередно вывешивая задние колеса, проверяем состояние подшипников ступиц задних колес. Колесо от руки должно вращаться равномерно, без заеданий и стуков.

Для проверки состояния сайлент-блоков рычагов задней подвески…

Granta 39 6 новый размер

…вставляем монтажную лопатку враспор между кронштейном рычага подвески и головкой рычага и пытаемся сдвинуть рычаг в разных направлениях.

Если рычаг перемещается свободно, без усилий, значит, сильно изношен или поврежден сайлент-блок рычага и его необходимо заменить.

Granta 39 7 новый размер

Проверяем состояние пружин, телескопических стоек и амортизаторов передней и задней подвесок.

Пружины подвесок не должны иметь повреждений. Разрывы, растрескивания и сильная деформация резиновых втулок, подушек и буферов сжатия амортизаторов недопустимы.

Не допускается подтекание жидкости из амортизаторов. Незначительное «отпотевание» амортизатора в верхней его части при сохранении характеристик не является неисправностью.

При осадке или разрушении резинового элемента верхней опоры телескопической стойки передней подвески опору необходимо заменить.

Granta 39 8 новый размер

Проверяем состояние шарниров и защитного чехла тяги переключения передач и реактивной тяги.

Поочередно вращая и поворачивая передние колеса (при вывешенной передней части автомобиля)…

Granta 40 1 новый размер

…осматриваем защитные чехлы наружных…

Granta 40 2 новый размер

…и внутренних шарниров приводов передних колес, проверяем надежность их крепления хомутами.

Потрескавшиеся, порванные или потерявшие эластичность чехлы подлежат замене.

Проверяем отсутствие течи масла из коробки передач через сальники внутренних шарниров приводов. При наличии течи заменяем сальники.

Продолжение:

проверяем рулевое управление

проверяем тормозную систему

Подробнее с устройством, техобслуживанием и ремонтом Lada Granta можно ознакомиться в нашей Википедии (ссылка)

Задняя подвеска лада гранта устройство

Задняя подвеска:
1 – рычаг балки задней подвески;
2 – балка;
3 – тормозной барабан;
4 – амортизатор;
5 – кронштейн крепления амортизатора;
6 – пружина;
7 – буфер хода сжатия;
8 – кожух амортизатора;
9 – прокладка пружины;
10 – ступица заднего колеса;
11 – тормозной механизм заднего колеса;
12 – стабилизатор поперечной устойчивости;
13 – сайлент-блок;
14 – кронштейн рычага подвески

Задняя подвеска – полунезависимая, с винтовыми цилиндрическими пружинами и гидравлическими телескопическими амортизаторами двустороннего действия.
Основной несущий элемент подвески – балка с приваренными к ней через усилители продольными рычагами. Внутри балки проходит штанга стабилизатора поперечной устойчивости, концы которой приварены к рычагам. К рычагам подвески приварены кронштейны с проушинами для крепления амортизаторов и фланцы для крепления осей задних колес и щитов тормозных механизмов.
Спереди рычаги снабжены приварными втулками с запрессованными в них сайлент-блоками. Через центральную втулку сайлент-блока проходит болт, соединяющий рычаг с кронштейном. Для крепления кронштейна к лонжерону кузова предусмотрены три приварные шпильки. Нижним концом пружина подвески опирается на чашку, приваренную к резервуару амортизатора, а верхним – через резиновую прокладку – на опору, приваренную изнутри к арке колеса.
Нижняя проушина амортизатора крепится болтом к кронштейну рычага подвески, а его шток закреплен на верхней опоре пружины подвески через две резиновые подушки (одна – снизу опоры, другая – сверху) и опорную шайбу (под гайкой).
В ступице установлен двухрядный шариковый подшипник. Посадка подшипника на оси – переходная (с легким натягом или зазором). В процессе эксплуатации подшипник не требует пополнения смазки.

Детали амортизатора:
1 – чашка чехла;
2 – прокладка пружины;
3 – амортизатор;
4 – пружина;
5 – буфер хода сжатия;
6 – чехол;
7 – подушки штока;
8 – распорная втулка;
9 – опорная шайба;
10 – пружинная шайба;
11 – гайка

Задняя подвеска Гранта полунезависимая, выполнена на «упругой» балке с продольными рычагами, цилиндрическими пружинами и телескопическими амортизаторами двустороннего действия.

Балка задней подвески состоит из двух продольных рычагов, соединенных поперечиной U-образного сечения. Такое сечение обеспечивает соединителю (поперечине) большую жесткость на изгиб и меньшую — на кручение. Соединитель позволяет рычагам перемещаться относительно друг друга в небольших пределах. Рычага выполнены из трубы переменного ссчсния, — это задает им необходимую жесткость. К заднему концу каждого рычага приварены кронштейны для крепления амортизатора, шита заднего тормозного механизма и оси ступицы колеса. Спереди рычага балки закреплены болтами в съемных кронштейнах лонжеронов кузова. Подвижность рычагов обеспечивается резинометалличес-кими шарнирами (сайлент-блоками), запрессованными в передние концы рычагов.

Нижняя проушина амортизатора крепится к кронштейну рычага балки. К кузову амортизатор прикреплен штоком с гайкой. Эластичность верхнего и нижнего соединений амортизатора обеспечивают полушки штока и резнномсталлическая втулка, запрессованная в проушину. Шток амортизатора закрыт гофрированным кожухом, защищающим его от грязи и влаги. При «пробоях» подвески ход штока амортизатора ограничивается буфером хода сжатия, выполненным из эластичной пластмассы.

Пружина подвески своим нижним витком опирается на опорную чашку (стальную штампованную пластину, приваренную к корпусу амортизатора). а верхним — упирается в кузов через резиновую прокладку.

На фланце рычага балки установлена ось ступицы заднего колеса (она крепится четырьмя болтами). Ступицу с запрессованным в нее двухрядным роликовым подшипником удерживает на оси специальная гайка. На гайке выполнен кольцевой буртик, который надежно стопорит гайку путем его замятия в проточку оси. Подшипник ступицы закрытого типа и не требует регулировки и смазки в процессе эксплуатации автомобиля.

Пружина и детали амортизатора задней подвески Лада Гранта: 1 — пружина; 2 — резиновая прокладка; 3 — крышка кожуха: 4. 10 — подушка штока амортизатора; 5 — распорная втулка; б — кожух амортизатора: 7 — тайка штока; 8 — пружинная шайба; 9 — опорная шайбз; 11 — шток амортизатора; 12 — корпус амортизатора; 13 — нижняя опорная чашка пружины; 14 гайка болта нижнею крепления амортизатора; 15 — проушина: 16 — болт нижнего крепления амортизатора; 17 — буфер хода сжатия

Проверку технического состояния необходимо выполнять в соответствии с регламентом периодического технического обслуживания

Оценить техническое состояние подвески можно во время движения автомобиля. При движении на небольшой скорости по неровной дороге подвеска должна работать без стуков, скрипов и других посторонних звуков. После переезда через препятствие автомобиль не должен раскачиваться.

Проверку подвески лучше совместить с проверкой состояния шин и подшипников ступиц колес Односторонний износ протектора шины свидетельствует о деформации балки задней подвески.

Для выполнения работы потребуется

смотровая канава или эстакада.

1. Подготавливаем автомобиль к выполнению работы

Проверять работоспособность амортизатороя лучше после продолжительной поездки, пока рабочая жидкость в амортизаторах не остыла.

2. Энергично раскачиваем заднюю часть кузова автомобиля в вертикальном направлении. Если по инерции кузов продолжает совершать колебания (более двух: вверх и вниз), после того как его перестали раскачивать, значит, неисправен один или оба амортизатора. Чтобы выявить неисправный амортизатор, повторяем проверку, прикладывая усилия сначала с одной стороны автомобиля, а затем с другой.

Такая проверка позволяет выявить только неисправные амортизаторы. Проверить эффективность гашения колебаний амортизаторами можно только на специальном стенде.

3. Осматриваем амортизаторы подвески — подтекание жидкости из амортизаторов не допускается.

Амортизаторы следует заменять парой, даже если второй амортизатор задней подвески исправен.

4. Визуально проверяем состояние резинометаллических шарниров крепления амортизаторов 1 и рычагов балки заднего моста 2
Шарниры с односторонним выпучиванием резины, разрывами и трещинами заменяем

5. Проверяем затяжку гаек крепления деталей подвески, ири необходимости подтягиваем их.

6. Осматриваем детали подвески. Деформация и усталостные трещины в деталях подвески не допускаются. Поврежденные детали заменяем.

Пружины, как и амортизаторы, заменяйте парами.

Что же представляет собой ходовая часть авто? В такой машине, как Лада Гранта, подвеска играет весьма существенную роль. Передняя является совершенно независимой деталью автомобиля. На ней установлено несколько разнообразных видов стоек амортизаторов и витых конических пружин. Все эти части представляют собой ходовую часть автомобиля. Хотя это неполный список элементов, ведь в ее состав входят даже колеса. Можно сделать вывод, что ходовой частью автомобиля называют все детали, без которых он не сможет начать передвижение.

Стоит заметить, что обе подвески Лады получили от производителя существенно улучшенные характеристики. Теперь для стоек амортизации даже используются новые опоры. Все проведенные новшества позволили добиться лучшей управляемости автомобилем. Заднюю подвеску производитель оснастил отрицательным развалом колес, что положительно влияет на качество использования машины на сложных участках дороги.

Устройство подвески

Основанием подвески является стойка амортизатора, оснащенная множеством современных новшеств. Ее низ в обязательном порядке прикреплен к поворотному кулаку, используя для данной задачи помощь двух специальных креплений. Их роль играют болты, один из которых имеет в наличии специальный поясок и точно такую же шайбу. Если понадобится отрегулировать угол, с которым происходит развал переднего колеса, необходимо попросту ее повернуть.

На телескопической стойке стоит специальная пружина. Она оснащена пенополиуретановым буфером, отвечающим за ход сжатия. Также к ней присоединяется расположенная вверху стойки опора вместе с подшипником. Ее крепление производится при помощи самостоятельно контактирующих гаек (их три) к чашке брызговика в кузовной части машины. Конструкция, с которой произведена передняя подвеска, была существенно модернизирована в отличие от тех, что раньше использовались в автомобилях отечественной автомобильной промышленности.

Лада Гранта оснащена модернизированной подвеской

Теперь в автомобиль Лада Гранта устанавливается стальная втулка, которая, в свою очередь, закрепляется с использованием метода вулканизации к резиновому массиву опоры. Благодаря этому удалось уменьшить и кое-где удалить люфты и посторонние звуки, проникающие в салон автомобиля. Стоит заметить, что используемый подшипник получил намного больший диаметр и абсолютно другую конструкцию. Теперь он размещается между верхней частью опоры и пружиной. Под весом, который оказывает автомобиль, подшипнику приходится находиться в сжатом положении. Это позволяет вовремя устранять все образовавшиеся зазоры и стуки.

Рулевая рейка авто

Основное регулирование рейки происходит еще на заводе-изготовителе. Необходимо помнить: когда вы начали пользоваться автомобилем, рейку уже нельзя подтянуть самостоятельно. Это происходит из-за того, что специальная пружина со временем практически полностью стирается. Все данные факторы создают в автомобиле множество посторонних звуков, для удаления которых необходимо заменить специальную тарельчатую пружину.

Наиболее благоприятным в этой процедуре является тот факт, что саму рейку можно не деинсталлировать. Но посторонние звуки в автомобиле могут появляться даже в том случае, если рейка и передняя подвеска являются полностью исправными.

Что представляют собой детали передней подвески?

В процессе ремонта будьте осторожны откручивая болты соединяющие опору и поворотный кулак

Площадь, которая позволяет шарикам контактировать с дорожками качения, стала более просторной, увеличилась долговечность службы подшипника опоры. Благодаря такой конструкции при повороте колес автомобиль вращается вместе с корпусом стойки и специальной пружиной. При этом некоторые детали остаются в неподвижном положении. Немаловажным является то, что соединение специального штока стало получать намного меньше повреждений и стало не так быстро изнашиваться.

Нижняя часть такой детали, как поворотный кулак, соединяется с нижним рычагом, который, в свою очередь, находится на подвеске. Крепится он благодаря специальной опоре, которая, в свою очередь, прикрепляется к поворотному кулаку, используя несколько болтов. Если вам необходимо их открутить, будьте осторожны, так как они весьма хрупкие.

Задняя подвеска

В машине Лада Гранта именно задняя подвеска идентична предыдущим моделям автомобилей данного семейства. Производитель хоть и не сделал модификацию данной детали, но подвеска хорошо зарекомендовала себя в предыдущих моделях. Ее технические характеристики вполне подходят для эксплуатации на новых автомобилях.

Задняя подвеска автомобиля Лада Гранта не только дешевая, но и выполнена высококачественно. При необходимости произвести ремонт его стоимость не будет достаточно высокой.

При покупке автомобиля Лада Гранта потребуется в обязательном порядке выяснить для себя все детали и их особенности. Разобраться, как выполнено устройство, чтобы в случае возникновения каких-либо поломок вы могли сразу же их устранить. Вы должны знать полный список всевозможных поломок вашего автомобиля, ходовая часть которого играет весьма существенную роль.

Балка задней подвески присоединяется на двух креплениях к кузову. Стоит обратить внимание на то, что они фиксируют специальный шарнир, а вся работа выполняется за счет амортизатора и пружины на задней подвеске.

Лада Гранта создавалась в качестве одного из наиболее доступных по цене автомобилей, обладающих существенными характеристиками качества. Эти преимущества позволили сделать ее классической маркой для большинства людей. Лада Гранта создавалась как модифицированная версия Лады Калины.

Большинство модификаций Лады Гранты оснащено подвеской с увеличенным кластером, что позволило добиться дополнительной кузовной устойчивости. Установлены новая подвеска Лада Гранта и мощный усилитель руля с короткой рейкой, позволяющей использовать данный автомобиль не только на городских улицах, но и на бездорожье.

Задняя подвеска Лада Гранта

Задняя подвеска автомобиля полунезависимая, выполнена на упругой балке с продольными рычагами, цилиндрическими пружинами и телескопическими амортизаторами двустороннего действия

Балка задней подвески состоит из двух продольных рычагов, соединенных поперечиной U — образного сечения.

Такое сечение обеспечивает соединителю (поперечине) большую жесткость на изгиб и меньшую — на кручение.

Соединитель позволяет рычагам перемещаться относительно друг друга в небольших пределах. Рычаги выполнены из трубы переменного сечения, — это задает им необходимую жесткость

К заднему концу каждого рычага приварены кронштейны для крепления амортизатора, щита заднего тормозного механизма и оси ступицы колеса.

Спереди рычаги балки закреплены болтами в съемных кронштейнах лонжеронов кузова.

Подвижность рычагов обеспечивается резинометаллическими шарнирами (сайлент-блоками), запрессованными в передние концы рычагов.

Нижняя проушина амортизатора крепится к кронштейну рычага балки. К кузову амортизатор прикреплен штоком с гайкой.

Эластичность верхнего и нижнего соединений амортизатора обеспечивают подушки штока и резинометаллическая втулка, запрессованная в проушину.

Шток амортизатора закрыт гофрированным кожухом, защищающим его от грязи и влаги. При пробоях подвески ход штока амортизатора отграничивается буфером хода сжатия, выполненным из эластичной пластмассы.

Пружина подвески своим нижним витком опирается на опорную чашку (стальную штампованную пластину, приваренную к корпусу амортизатора), а верхним — упирается в кузов через резиновую прокладку.

На фланце рычага балки установлена ось ступицы заднего колеса (она крепится четырьмя болтами).

Ступицу с запрессованным в нее двухрядным роликовым подшипником удерживает на оси специальная гайка. На гайке выполнен кольцевой буртик, который надежно стопорит гайку путем его замятия в проточку оси.

Подшипник ступицы закрытого типа и не требует регулировки и смазки в процессе эксплуатации автомобиля.

Пружины задней подвески делятся на два класса: А — более жесткие, В — менее жесткие.

Пружины класса A маркируются коричневой краской, класса B — синей.

С правой и с левой стороны автомобиля должны устанавливаться пружины одного класса.

В передней и задней подвеске устанавливаются пружины одного класса. В исключительных случаях допускается установка пружин класса B в задней подвеске, если в передней установлены пружины класса A.

Установка пружин класса A на заднюю подвеску не допускается, если в передней установлены пружины класса B.

Проверка состояния подвески

Оценить техническое состояние подвески можно во время движения автомобиля. При движении на небольшой скорости по неровной дороге подвеска должна работать без стуков, скрипов и других посторонних звуков.

После переезда через препятствие автомобиль не должен раскачиваться.

Проверку подвески лучше совместить с проверкой состояния шин и подшипников ступиц колес.

Односторонний износ протектора шины свидетельствует о деформации балки задней подвески.

Последовательность выполнения

Подготавливаем автомобиль к выполнению работы.

Проверять работоспособность амортизаторов лучше после продолжительной поездки, пока рабочая жидкость в амортизаторах не остыла.

Энергично раскачиваем заднюю часть кузова автомобиля в вертикальном направлении.

Если по инерции кузов продолжает совершать колебания (более двух: вверх и вниз), после того как его перестали раскачивать, значит, неисправен один или оба амортизатора.

Чтобы выявить неисправный амортизатор, повторяем проверку, прикладывая усилия сначала с одной стороны автомобиля, а затем с другой.

Такая проверка позволяет выявить только неисправные амортизаторы.

Проверить эффективность гашения колебаний амортизаторами можно только на специальном стенде.

Осматриваем амортизаторы подвески — подтекание жидкости из амортизаторов не допускается.

Амортизаторы следует заменять парой, даже если второй амортизатор задней подвески исправен.

Визуально проверяем состояние резинометаллических шарниров крепления амортизаторов 1 и рычагов балки заднего моста 2.

Шарниры с односторонним выпучиванием резины, разрывами и трещинами заменяем.

Проверяем затяжку гаек крепления деталей подвески, при необходимости подтягиваем их.

Осматриваем детали подвески. Деформация и усталостные трещины в деталях подвески не допускаются.

Поврежденные детали заменяем.

Пружины, как и амортизаторы, заменяйте парами.

Моменты затяжки резьбовых соединений задней подвески

Наименование узлов и деталей – Резьба — Момент затяжки Нм (кгсм)

Болты крепления колеса М12х1,25 — 65,2—92,6 (6,7—9,5)

Гайка подшипника ступицы заднего колеса М20х1,5 — 186,3—225,6 (19,0—23,0)

Гайка болта нижнего крепления амортизатора к рычагу задней подвески М12х1,25 — 66,6—82,3 (6,8—8,4)

Гайка крепления штока амортизатора задней подвески к кузову М10х1,25 — 50,0—61,7 (5,1—6,3)

Гайки болтов крепления рычага задней подвески к кронштейну М12х1,25 — 66,6—82,3 (6,8—8,4)

Гайки крепления кронштейна рычага задней подвески к кузову М10х1,25 — 27,4—34,0 (2,8—3,5)

Задняя подвеска: конструкция и особенности

Балка от подвески задней состоит из 2-х рычагов продольных 13 и соединителя 12, связанных посредством усилителей между собой.

 

Детали подвески задней: 1 – шарнир резинометаллический, 2 – кронштейн для крепления рычага от подвески, 3 – кожух защиты амортизатора гидравлического, 4 – буфер для хода сжатия, 5 – крышка от кожуха, 6 – шайба опорная, 7 – амортизаторные подушки, 8 – втулка распорная, 9 – амортизатор гидравлический, 10 – прокладка изоляционная, 11 – пружина стойки амортизаторной, 12 – соединитель для рычагов, 13 – рычаг для балки подвески передней, 14 – кронштейн для крепления стойки амортизаторной, 15 – фланец, 16 – втулка от рычага.

 


Ступица колеса заднего и крепление стойки амортизаторной: 1 – кожух защиты амортизатора гидравлического 2 – буфер для хода сжатия, 3 – шайба опорная, 4 – прокладка изоляционная для пружины, 5 – чашка пружины верхняя опорная, 6 – подушки для крепления штока стойки амортизаторной, 10 – болт для крепления оси ступицы колеса заднего, 11 – барабан тормозной, 12 – подшипник ступицы, 13 – ступица от заднего колеса, 14 – ось ступицы, 15 – гайка ступицы от задней подвески, 16 – кольцо стопорное, 17 – штифт установочный.

 

Расположение деталей от задней подвески на машине: 1 – кронштейн для крепления рычага к самому кузову, 2 – рычаг, 3 – амортизатор от стойки, 4 – нижний шарнир от стойки, 6 – соединитель для рычагов, 6 – шарнир рычага резинометаллический.

В задней части к рычагам подвески приварены кронштейны 14 с проушинами, благодаря которым можно крепить стойки амортизаторные и фланцы 15, к каким болтами крепятся оси от колес задних вместе со щитами механизмов торможения. Впереди к рычагам от подвески приварены втулки 16, в какие запрессованы шарниры резинометаллические 1. Через эти шарниры проходят болты, которые соединяют с кронштейнами 2 рычаги подвески, какие, в свою очередь, крепятся шпильками к силовым элементам кузова.

Пружины 11 подвески опираются 1-м концом на чашку стойки амортизаторной 9, а другим – через резиновую прокладку изоляционную 10 – в опору, которая приварена к задней колесной арке кузова.

Амортизатор от задней подсевки телескопический гидравлический с двусторонним действием прикрепляется болтом 9 к кронштейну от рычага подвески. Шток крепится к опоре верхней 5 от пружины подвески подушки 6 и шайбу опорную 3.

В ступицу 13 установлен 2-рядный подшипник радиально-упорный 12, подобный подшипнику ступицы в переднем колесе, но с меньшими габаритами. Отлично от ступицы в переднем колесе, на какую внутренне кольцо от подшипника установлено с гарантированным натягом, на ступице от колеса заднего подшипник 12 на оси 14 обладает переходной посадкой.

Не волнуйтесь: музыкальный магазин Мельбурна запускает круглосуточный торговый автомат для доставки гитарных струн своим клиентам

Прекращение зажигательного джем-сейшна из-за порвавшейся гитарной струны или сломанной барабанной палочки — это серьезная проблема, которая обычно приводит к резкому прекращению музыкального самовыражения до тех пор, пока магазины не откроются на следующий день, но одна компания из Мельбурна хочет это изменить.

Музыкальный магазин в Коллингвуде Компания Clingan Guitar Tone установила круглосуточный торговый автомат «toneshop» перед входом в магазин, в котором в любое время дня можно приобрести гитарные струны, медиаторы, колки, ремни, барабанные палочки и даже патчи.

В беседе с SmartCompany владелец магазина Джерем Клинган сказал, что торговый автомат стал «естественным продолжением» услуг его магазинов, поскольку магазин регулярно обеспечивает ремонт и поддержку музыкантов, выступающих в близлежащих районах.

«Магазин всегда был местом, где музыканты могли получить помощь или информацию, а также починить вещи, — говорит Клинган.

Получайте ежедневные деловые новости.

Последние новости, информация о финансировании и советы экспертов.Бесплатная регистрация.

«Мы всегда стремились быть этим центром, поэтому торговый автомат был просто естественным шагом в расширении наших услуг для фанатов, желающих получить любое снаряжение, которое им нужно, в любое время».

Коллингвуд – это горячая точка для концертных площадок, и Клинган узнавал местных музыкантов, которые собираются «хлопнуть концертом» и часто нуждаются в аварийном оборудовании.

Круглосуточный магазин тонов. Источник: Прилагается.

Из Мемфиса в Мельбурн

Clingan был вдохновлен аналогичными предприятиями в известном музыкальном городе Мемфисе, штат Теннесси, и машина в Мельбурне была официально представлена ​​​​в апреле.

«В Мемфисе было место, где сделали то же самое, и оно находилось в той же полосе музыкальных площадок», — говорит он.

«Если такой известный город живой музыки, как Мемфис, может это сделать, почему мы не можем?»

После подбора помощника, у которого есть «связь с торговыми автоматами», проект начался. Несмотря на несколько ранних заминок с вандализмом, Клинган говорит, что реакция была «фантастической».

«Нам уже несколько раз приходилось пополнять запасы, на прошлой неделе люди сходили с ума по этому поводу.Приятно видеть такие положительные отзывы, и так много людей сказали, что будут помнить об этом, когда им понадобится аварийное снаряжение», — говорит он.

В то время как магазин все еще разбирается в том, что продается, а что нет, Клинган был открыт для отзывов местных музыкантов о том, что еще должно быть в автомате. Поскольку гитарные струны и 9-вольтовые батареи пользуются неизменной популярностью, магазин рассматривает возможность добавления таких предметов, как клейкая лента и барабанные ключи, после многочисленных запросов.

По словам Клингана, после того, как ассортимент продукции будет решен, бизнес рассматривает возможность установки дополнительных торговых автоматов в окрестностях Мельбурна, а следующим местом, возможно, станет Брансуик.

«Как только мы выясним, какие продукты работают лучше всего, мы подумаем о расширении за счет дополнительных торговых автоматов, может быть, одного в Брансуике в самом заведении», — говорит он.

«Сейчас все дело в том, чтобы доработать его и заставить все продукты работать».

«Мы не собираемся зарабатывать на этом миллионы, это просто еще один аспект того, как бизнес может удовлетворить потребности общества».

Никогда не пропустите историю: подписаться на бесплатный ежедневный информационный бюллетень SmartCompany в и найти наши лучшие истории на Twitter , Facebook , LinkedIn и Instagram .

Время, проводимое детьми перед экраном, резко возросло во время пандемии, что вызывает тревогу у родителей и исследователей устройств, используемых детьми в возрасте от 4 до 15 лет во всем мире. Данные показали, что использование увеличивалось с течением времени: например, в Соединенных Штатах дети проводили в среднем 97 минут в день на YouTube в марте и апреле по сравнению с 57 минутами в феврале и почти вдвое больше, чем год назад. — с аналогичными тенденциями в Великобритании и Испании.Компания называет ежемесячный рост «Эффектом Covid».

Дети обращаются к экранам, потому что говорят, что у них нет альтернативных занятий или развлечений — здесь они тусуются с друзьями и ходят в школу — и все это в то время, как технологические платформы получают прибыль, соблазняя лояльность с помощью таких тактик, как вознаграждение в виде виртуальных денег или «ограниченный выпуск». ” привилегии за ежедневные «полосы» использования.

«Это был подарок для них — мы дали им пленную аудиторию: наших детей», — сказал доктор.Дмитрий Кристакис, директор Центра детского здоровья, поведения и развития Детского научно-исследовательского института Сиэтла. По словам доктора Кристакиса, расходы будут нести семьи, потому что более широкое использование Интернета связано с тревогой, депрессией, ожирением и агрессией — «и зависимостью от самой среды».

Важно отметить, что исследование показывает только ассоциации, а это означает, что интенсивное использование Интернета не обязательно вызывает эти проблемы. Что беспокоит исследователей, так это то, что использование устройств является плохой заменой деятельности, которая, как известно, имеет решающее значение для здоровья, социального и физического развития, включая физические игры и другие взаимодействия, которые помогают детям научиться противостоять сложным социальным ситуациям.

Тем не менее родители выражают какую-то безнадежность своими вариантами. Соблюдение допандемических правил кажется не просто непрактичным, но может показаться совершенно подлым лишение детей основного источника общения.

«Тогда я забираю его, и что они делают? Загадка? Научиться шить? Вязать? Я не знаю, каковы ожидания», — сказала Параскеви Бриасули, корпоративный писатель, которая воспитывает четверых детей — 8, 6, 3 и 1 года — со своим мужем в квартире с двумя спальнями на Манхэттене. По ее словам, время, проведенное на устройствах, заменило занятия спортом в будние дни и увеличилось на 70% по выходным.

Количественная визуализация FRET для визуализации инвазивности живых клеток рака молочной железы

Abstract

Матриксные металлопротеиназы (ММП) реконструируют микроокружение опухоли и способствуют метастазированию рака. Среди протеаз семейства MMP протеолитическая активность проонкогенной и прометастатической мембраны типа 1 (MT1)-MMP представляет собой перспективный и целевой биомаркер агрессивных раковых опухолей. В этом исследовании мы систематически разработали и охарактеризовали несколько высокочувствительных и специфичных биосенсоров на основе флуоресцентного резонансного переноса энергии (FRET) для визуализации активности MT1-MMP в живых клетках.Чувствительность биосенсора AHLR-MT1-MMP была самой высокой и в пять раз превышала заявленную версию. Следовательно, биосенсор AHLR использовался для количественного определения активности MT1-MMP в нескольких клеточных линиях рака молочной железы и для визуализации пространственно-временной активности MT1-MMP одновременно с лежащим в основе коллагеновым матриксом на уровне отдельных клеток. Мы обнаружили значительно более высокий уровень активности MT1-MMP в инвазивных раковых клетках, чем в доброкачественных или неинвазивных клетках. Наши результаты также показывают, что высокая активность MT1-MMP стимулировалась адгезией инвазивных раковых клеток к внеклеточному матриксу, что точно коррелирует со способностью клеток разрушать коллагеновый матрикс.Таким образом, мы систематически оптимизировали биосенсор на основе FRET, который представляет собой мощный инструмент для обнаружения проинвазивной активности MT1-MMP на уровне отдельных клеток. Это считывание можно применять для профилирования инвазивности отдельных клеток из клинических образцов и в качестве индикатора для скрининга противораковых ингибиторов.

Образец цитирования: Lu S, Wang Y, Huang H, Pan Y, Chaney EJ, Boppart SA, et al. (2013)Количественная визуализация FRET для визуализации инвазивности живых клеток рака молочной железы.ПЛОС ОДИН 8(3): е58569. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0058569

Редактор: Фань Юань, Университет Дьюка, Соединенные Штаты Америки

Поступила в редакцию: 29 ноября 2012 г.; Принято: 5 февраля 2013 г.; Опубликовано: 13 марта 2013 г.

Авторские права: © 2013 Lu et al. Это статья с открытым доступом, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.

Финансирование: Эта работа поддерживается грантами NIH HL098472, CA139272, NS063405, NSF CBET0846429, CMMI0800870 (Yingxiao W. and SL) и грантом Центра рака UIC (Yingxiao W. и HO). Финансирующие агентства не участвовали в разработке дизайна исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

Конкурирующие интересы: Соавтор Yingxiao Wang является членом редакционной коллегии PLOS ONE. Это не меняет приверженности авторов всем политикам PLOS ONE в отношении обмена данными и материалами.

Введение

Матриксные металлопротеиназы (ММП) представляют собой семейство цинкзависимых протеаз, которые играют важную роль в метастазировании, воспалении и развитии опухоли [1], [2]. Семейство ММП человека включает 23 члена: 16 секретируемых и 7 заякоренных в мембране протеаз [1]. Большинство ММП являются проонкогенными при раке, хотя некоторые отдельные ММП, такие как ММП-8, могут играть противоположную защитную роль [3]–[5]. Было показано, что ингибирование MMP широкого спектра полезно в клинических испытаниях и на животных моделях, если его начинать на ранней стадии, но не на поздней стадии прогрессии опухоли [6].Поэтому важно исследовать специфические роли, которые играют отдельные ММР на клеточном уровне, а также оценивать эффективность конкретных ингибиторов ММР с целью разработки противораковой терапии против ММР.

Среди протеаз семейства ММР ММР мембранного типа 1 (МТ1-ММР; также называемая ММР-14) необходима для периклеточного протеолиза коллагенового матрикса в базальной мембране, а также для инвазии опухолевых клеток и метастазирования [7]. -[11]. MT1-MMP также может активировать профермент MMP-2 [2] и регулировать множественные рецепторы адгезии, способствуя инвазии [12].MT1-MMP синтезируется в неактивной форме, состоящей из аутоингибирующего продомена, цинксвязывающего каталитического домена, гемопексиноподобного домена и трансмембранного домена, за которым следует короткий цитоплазматический хвост [13], [14]. Фуриноподобные конвертазы и MMP-зависимый протеолиз могут вызывать удаление продомена и последующую активацию MT1-MMP [15]–[17]. Затем активированный MT1-MMP может локализоваться на клеточной поверхности, интернализоваться через клатрин-зависимый путь [18] и возвращаться обратно в плазматическую мембрану посредством экзоцитоза [19].

В соответствии с его онкогенной функцией, MT1-MMP широко экспрессируется при многих типах рака, а его протеолитическая активность связана с несколькими инвазивными формами рака [20]–[25]. В результате измерение клеточной активности MT1-MMP может служить индикатором агрессивных типов рака, а также основой для выбора лечения для больных раком. Однако наша способность количественно и выборочно регистрировать активность MT1-MMP на уровне отдельных клеток все еще ограничена.Поэтому крайне важно разработать высокочувствительные и специфичные биосенсоры MT1-MMP в качестве молекулярных инструментов для исследования рака и терапии рака [26].

Недавно были разработаны молекулярные маяки и зонды на основе FRET

для определения активности расщепления MT1-MMP в среде и внеклеточном матриксе, соответственно [27], [28]. Однако эти флуоресцентные зонды более эффективно расщеплялись MMP-9, чем MT1-MMP, и им не хватало субклеточного разрешения. Наша группа ранее разработала активируемый расщеплением биосенсор MT1-MMP FRET (а именно биосенсор NL), который содержит расщепляемую последовательность NL (CPKESC NL FVLKD) из профермента MMP-2 [29].Применение этого оригинального биосенсора NL показало, что MT1-MMP преимущественно активируется на фронте миграции живых клеток, что подтверждается другими исследованиями [28]. Однако биосенсор NL продемонстрировал медленный отклик и ограниченную чувствительность к расщеплению MT1-MMP, что требовало дальнейшего улучшения.

Недавно стали доступны две стратегии повышения чувствительности и специфичности этого биосенсора. Во-первых, с помощью протеолиза ММП мы идентифицировали несколько эффективных субстратных последовательностей, которые можно использовать для замены последовательности NL в биосенсоре [30], [31].Во-вторых, сообщалось, что дополнительные линкеры, фланкирующие последовательность субстрата, обычно могут повышать чувствительность биосенсоров FRET [32]. В этой статье мы систематически внедрили эти модификации в биосенсор NL и количественно охарактеризовали как чувствительность, так и специфичность нескольких новых и значительно улучшенных биосенсоров MT1-MMP. Затем мы выбрали наиболее чувствительный биосенсор AHLR, который демонстрировал как оптимизированную последовательность расщепления, так и длину линкера, для регистрации активности MT1-MMP в нескольких клеточных линиях рака молочной железы.Наши результаты показывают, что инвазивность клеток коррелирует с уровнем клеточной активности MT1-MMP, который может быть точно обнаружен и профилирован биосенсором AHLR.

Результаты

In vitro оптимизация чувствительности биосенсора MT1-MMP

Сконструированный биосенсор содержит усиленный голубой флуоресцентный белок (ECFP) в качестве донора FRET, субстратный пептид с линкерными последовательностями или без них и желтый флуоресцентный белок (YPet) в качестве акцептора FRET (рис.С1А). В состоянии покоя происходит сильный перенос энергии между ECFP и YPet. Когда биосенсор расщепляется каталитически активным MT1-MMP, ECFP отделяется от YPet, вызывая снижение передачи энергии или увеличение отношения эмиссии ECFP/FRET (рис. S1B). Таким образом, сигнал соотношения ECFP/FRET биосенсоров можно использовать для представления зарегистрированной активности MT1-MMP.

Чтобы изучить влияние линкеров на чувствительность биосенсора, мы сконструировали биосенсоры FRET с многообещающей последовательностью субстрата (AHLR или RHLR), окруженной гибкими линкерами с последовательностью GGS или GGSGGT (рис.С1А)[32]. Последовательности AHLR и RHLR являются двумя наиболее чувствительными и специфичными субстратными последовательностями MT1-MMP среди восьми кандидатов, которые, согласно анализу расщепления библиотеки субстратных фагов, были значительно более эффективными, чем исходная последовательность NL (таблица S1) [29]. Когда очищенные биосенсоры совместно инкубировали с каталитическим доменом MT1-MMP (MT1-CAT), чтобы обеспечить расщепление, отношение ECFP/FRET биосенсора с последовательностью AHLR, окруженной линкером GGSGGT (названным биосенсором AHLR), увеличилось 7 -кратно, с ответом на 38% и 109% выше, чем у биосенсора с линкером GGS [30] и без линкера (только последовательность AHLR) соответственно (рис.1А). Реакция биосенсора AHLR с линкером GGSGGT на расщепление MT1-CAT также в 5 раз выше, чем у исходного биосенсора NL [29]. Точно так же биосенсор RHLR с линкером GGSGGT был лучше по сравнению с биосенсорами RHLR с линкером GGS или без линкера (только последовательность RHLR) (фиг. 1B). Эти результаты показывают, что гибкие линкеры GGSGGT могут улучшать чувствительность биосенсоров MT1-MMP, возможно, за счет предоставления активному MT1-CAT большего пространства для доступа и расщепления последовательности субстрата.Таким образом, все конструкции биосенсоров в оставшейся рукописи были сконструированы с использованием линкера GGSGGT. Мы обращаемся к биосенсорам по названиям последовательностей их субстратов.

Рисунок 1. In vitro характеристика чувствительности биосенсоров MT1-MMP.

(A) Сравнение ответов различных биосенсоров MT1-MMP при инкубации с каталитическим доменом MT1-MMP (MT1-CAT). Субстратные пептиды представляют собой только NL (NL’), только AHLR (AHLR’), AHLR, фланкированные линкерами GGS (AHLR”) или линкерами GGSGGT (AHLR).Метка «Контроль NL» указывает на отсутствие инкубации MT1-CAT. (B) Характеристика биосенсоров с субстратными пептидами только RHLR (RHLR’) и ​​RHLR, фланкированными линкерами GGS (RHLR») или GGSGGT (RHLR). Метка «Контроль RHLR» указывает на отсутствие инкубации MT1-CAT. (C) Характеристика биосенсоров MT1-MMP, содержащих различные субстратные пептиды с линкерами GGSGGT (HHLR, RHLM, RALR, MHLR, RGLR или AHLR). (D) Сравнение биосенсоров MT1-MMP, содержащих линкер GGSGGT и различные последовательности субстратных пептидов (NL, AHLR, AHLM или MHLR).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0058569.g001

Затем мы исследовали влияние различных последовательностей субстрата на чувствительность биосенсоров. Среди других шести исследованных многообещающих пептидных последовательностей, включая HHLR, RHLM, RALR, MHLR, RGLR и AHLM, биосенсор с последовательностью AHLM или MHLR оказался наиболее чувствительным к расщеплению MT1-CAT in vitro, с последовательностью 6 -кратное увеличение отношения ECFP/FRET (рис. 1C). Затем мы сравнили бок о бок три наиболее чувствительных биосенсора с последовательностью AHLR, AHLM или MHLR, окруженной линкером GGSGGT (рис.S2A и 1D). Как показано на рисунке 1D, биосенсор AHLR был наиболее чувствительным среди всех исследованных биосенсоров.

Исследование специфичности биосенсоров MT1-MMP in vitro

Для оценки специфичности биосенсора очищенные биосенсоры AHLR, AHLM и MHLR расщепляли in vitro с использованием различных каталитических доменов MT1-MMP, MT2-MMP и MT3-MMP, а также полноразмерных MMP-2 и MMP-9. Как показано на рисунке 2, все три биосенсора способствовали расщеплению MT1-MMP, как и предсказывал наш анализ расщепления фаговой библиотеки [31].Поэтому биосенсор AHLR был выбран как специфичный и наиболее чувствительный к протеолизу MT1-MMP, хотя биосенсоры AHLM и MHLR были умеренно более специфичными (рис. 2Г).

Рисунок 2. Охарактеризуйте специфичность трех наиболее чувствительных биосенсоров MT1-MMP.

Динамика отношения эмиссии ECFP/FRET биосенсоров (A) AHLR, (B) AHLM, (C) MHLR при расщеплении различными активными каталитическими доменами из MT1-, MT2-, MT3-MMP или полноразмерный активный MMP2 или MMP9. (D) Количественное максимальное отношение ECFP/FRET после расщепления сравнивается между биосенсорами NL-, AHLR-, AHLM- и MHLR с различным каталитическим расщеплением MMP. Значения рассчитывали путем усреднения ответа через 2-2,5 часа после инкубации MT1-CAT.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0058569.g002

Кроме того, мы оценили селективность биосенсора AHLR в отношении MMP-8. Результаты показали, что биосенсор AHLR был устойчив к протеолизу MMP-8 (рис.С3). Эта селективность важна, поскольку, в отличие от MT1-MMP, MMP-8 проявляет противоопухолевое свойство при определенных типах рака [4], [5]. Следовательно, биосенсор AHLR сообщает о проинвазивной активности MT1-MMP, но не о защитной активности MMP-8, и, таким образом, его можно применять для профилирования инвазивности раковых клеток.

Профилирование клеточной активности MT1-MMP в живых раковых клетках с использованием биосенсора AHLR

Мы разработали биосенсор AHLR для экспрессии на внеклеточной поверхности плазматической мембраны, где функционирует активный MT1-MMP (рис.С2Б) [18], [29]. Подобно анализу in vitro , расщепление MT1-MMP может позволить акцептору диффундировать от донора к клеточной мембране, вызывая снижение переноса энергии и увеличение отношения эмиссии ECFP/FRET. Таким образом, соотношение ECFP/FRET можно применять для количественной оценки клеточной активности MT1-MMP.

Исследованные клеточные линии имели разные уровни экспрессии MT1-MMP и инвазивные способности. Эти клетки включают высокоинвазивные клетки фибросаркомы HT1080 и клетки карциномы молочной железы MDA-MB-231 (оба с высоким уровнем MT1-MMP), неинвазивные клетки рака молочной железы SK-BR-3, CRL2314, ZR-75-1 и MCF-7. клетки, а CRL4010 иммортализованные эпителиальные клетки.Кроме того, клетки HeLa с минимальным уровнем эндогенного MT1-MMP и их аналоги со сверхэкспрессией экзогенного MT1-MMP использовали в качестве отрицательного и положительного контроля соответственно (таблица S2). Изображения отношения ECFP / FRET биосенсора AHLR в клетках, культивируемых на покровном стекле, были количественно определены и усреднены в периферических областях, где было показано, что активный MT1-MMP концентрируется [29] (рис. 3A). Количественные результаты показали, что активность MT1-MMP была значительно выше в инвазивных клетках HT1080 и MDA-MB-231, чем в других клеточных линиях.В частности, активность MT1-MMP была низкой в ​​неинвазивных клетках SK-BR-3, CRL2314, ZR-75-1, MCF-7 и CRL4010 (рис. 3A–B). Эти результаты позволяют предположить, что биосенсор AHLR можно применять для анализа активности MT1-MMP в отдельных клетках с различным уровнем инвазивного потенциала.

Рисунок 3. Профиль базового уровня кажущейся активности MT1-MMP в линиях раковых клеток.

(A) Изображения отношения ECFP/FRET репрезентативных раковых клеток с помощью биосенсора AHLR; (B) — количественные значения отношения ECFP/FRET линий раковых клеток (СРЕДНЕЕ ± SEM).(*) указывает на статистически значимую разницу по двустороннему t-критерию с неравной дисперсией. Например, между клетками MDA-MB-231 (n = 26) и CRL4010 (n = 21) значение p = 5,0e-10. Между клетками HT1080 (n = 33) и CRL4010 (n = 21) p-значение = 9,5e-4.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0058569.g003

Для дальнейшего устранения вклада клеточных протеиназ, отличных от MMP, в клеточных анализах расщепления биосенсора, клетки с мембраносвязанным биосенсором AHLR были предварительно обработаны GM6001, мощный гидроксаматный ингибитор ММП широкого спектра действия [33], [34].Сигнал соотношения ECFP/FRET, наблюдаемый в присутствии GM6001, представляет собой фон расщепления биосенсора не-MMP протеиназами. Затем GM6001 отмывали, чтобы обеспечить расщепление биосенсора клеточным MT1-MMP. Увеличение отношения после вымывания GM6001 затем количественно оценивали в периферических областях клеток, чтобы определить расщепление биосенсора MT1-MMP в различных типах клеток (рис. 4A-C и S4). Результаты согласовывались с нашими исследованиями профилирования клеток на базальном уровне, но с большей чувствительностью в дифференциации высокоинвазивных раковых клеток от других.Например, инвазивные клетки MDA-MB-231 и HT1080 демонстрировали гораздо более высокий уровень активности относительно MT1-MMP в анализе вымывания GM6001, чем неинвазивные клетки SK-BR-3 и MCF-7 (рис. 4D). и фильм S1).

Рисунок 4. Профиль инвазивной активности MT1-MMP в клеточных линиях рака молочной железы с использованием анализа вымывания GM6001.

Для клеточных линий рака молочной железы, включая (A) MDA-MB-231, (B) SK-BR-3 и (C) MCF-7, изображения соотношения выбросов ECFP/FRET показаны для репрезентативная клетка до (слева) и после (в центре) вымывания GM6001.Временная динамика количественного значения отношения ECFP/FRET, нормализованного к его среднему значению до вымывания GM6001, представлена ​​на правой панели. Другая репрезентативная клетка MDA-MB-231 в анализе вымывания GM6001 показана в фильме S1. (D) Количественные значения увеличения соотношения ECFP/FRET после вымывания GM6001 сравнивают между различными клеточными линиями (СРЕДНЕЕ ± SEM). (*) указывает на статистически значимое различие по двустороннему t-критерию с неравной дисперсией, значение p<0,01 между клетками MDA-MB-231 (n = 10) и CRL2314 (n = 15).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0058569.g004

Адгезия к фибронектину повышает клеточную активность MT1-MMP

Поскольку активность MT1-MMP необходима для эффективной клеточной инвазии и миграции через матрикс, мы предположили, что высокая активность MT1-MMP, наблюдаемая в инвазивных раковых клетках, связана с взаимодействием клеток с матриксом. В результате скрининг раковых клеток в адгезии может обеспечить более точное измерение, чем методы скрининга, нацеленные на клетки в суспензии.Для проверки этой гипотезы клетки MDA-MB-231 трансфицировали биосенсором AHLR, а затем помещали на покровное стекло, покрытое фибронектином, белком внеклеточного матрикса. Изображения отношения ECFP/FRET контролировались во время этого процесса динамической адгезии. В течение 40–50 минут после адгезии соотношение ECFP/FRET значительно увеличилось и было неравномерно распределено на субклеточном уровне с высоким соотношением в активной области ламеллоподий (рис. 5А и фильм S2). Это увеличение соотношения ECFP/FRET и субклеточная разница полностью подавлялись GM6001 (рис.5Б-Г). В качестве контроля не наблюдалось увеличения отношения ECFP/FRET в клетках, трансфицированных аналогичным биосенсором, содержащим субстратную последовательность, не расщепляемую МТ1-ММР (субстратная последовательность: CPKESC IV FVLKD, рис. 5C и D) [29]. Эти результаты позволяют предположить, что адгезия к фибронектину может повышать уровень активного MT1-MMP в инвазивных клетках MDA-MB-231. Следовательно, при адгезии на внеклеточном матриксе инвазивные раковые клетки могут проявлять более высокую активность MT1-MMP, чем в суспензии, что указывает на то, что адгезивные клетки могут обеспечивать более чувствительное считывание клеточной активности MT1-MMP.

Рисунок 5. Активность MT1-MMP повышалась за счет клеточной адгезии к матриксу в клетках MDA-MB-231.

(A-B) Изображения соотношения ECFP/FRET репрезентативной клетки, экспрессирующей биосенсор AHLR, показаны через 0 минут (слева) и через 40 минут (справа) после адгезии к покрытому фибронектином покровному стеклу с (B) или без ( А) предварительная обработка GM6001. Та же ячейка на панели (A) показана в фильме S2. (C) Количественное изменение во времени отношения ECFP/FRET клеток MDA-MB-231, экспрессирующих биосенсор AHLR с обработкой GM6001 или без нее, и клеток с IV-негативным мутантным биосенсором во время процесса адгезии на фибронектине. (D) Среднее увеличение отношения ECFP/FRET клеток в (C) через 20–30 мин после адгезии (MEAN ± SEM). Шкала баров: 10 мкм. (*) указывает на статистически значимую разницу с p-значением <0,01.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0058569.g005

Активность MT1-MMP коррелирует с деградацией коллагена в отдельных живых клетках

Поскольку MT1-MMP эффективно разрушает коллаген типа I и функционирует как коллагеназа, мы одновременно визуализировали как активность MT1-MMP (с использованием биосенсора AHLR), так и коллагенолиз (с использованием коллагена, конъюгированного с родамином) на уровне одной клетки.Для этого клетки MDA-MB-231, трансфицированные биосенсором AHLR, высевали на сшитую родамин-коллагеновую пленку и культивировали в течение 2 сут [8], [10]. Регистрировали соотношение ECFP/FRET и флуоресцентные изображения коллагена-родамина на границе клеток и матрикса. Как показано на фигуре 6, как активность MT1-MMP, так и деградация коллагена были явно высокими в клетках MDA-MB-231. Также наблюдалось усиление флуоресценции родамина внутри тел клеток, вероятно, за счет эндоцитоза фрагментированного коллагена [35].Как и ожидалось, GM6001 ингибировал как активность MT1-MMP, так и деградацию коллагена в этих клетках (фиг. 6А). В качестве контроля клетки SK-BR-3 с дефицитом MT1-MMP не вызывали заметной деградации коллагена, конъюгированного с родамином (данные не показаны). В совокупности эти результаты свидетельствуют о том, что наш биосенсор MT1-MMP FRET может служить мощным молекулярным инструментом для профилирования клеточной активности MT1-MMP и оценки инвазивного потенциала отдельных клеток.

Рисунок 6. Активность MT1-MMP в клетках MDA-MB-231 коррелирует с инвазивностью клеток на сшитых коллагеновых пленках.

(A) Соотношение ECFP/FRET и изображения интенсивности родамин-коллаген репрезентативной клетки, экспрессирующей биосенсор AHLR-MMP, через 2 дня после адгезии к покрытому коллагеном (CL) покровному стеклу, с ингибированием (вверху) или без (внизу) GM6001 . Форма ячеек обведена синими пунктирными линиями. Шкала баров: 10 мкм. (B) Левая панель: количественное соотношение ECFP/FRET (Ratio) и правая панель: интенсивность флуоресценции родаминового коллагена снаружи (FI-снаружи) и внутри (FI-внутри) клеточного тела сравнивалась между клетками, предварительно обработанными (GM+ ) или без ингибирования (GM-) GM6001 (СРЕДНЕЕ ± SEM).(*) указывает на статистически значимую разницу с p-значением <0,01.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0058569.g006

Обсуждение

При раке молочной железы и многих других типах рака ферментативно активный MT1-MMP находится на внеклеточной поверхности опухолевых и стромальных клеток. Протеолитическая активность MT1-MMP считается критической для опухолевых клеток для модификации внеклеточного матрикса (ECM) и проникновения в сшитые ткани человека [8], [10], [12], [36].Соответственно, MT1-MMP высоко экспрессируется в агрессивных опухолевых клетках молочной железы и предстательной железы и связан с плохими клиническими исходами [20]–[22]. Кроме того, МТ1-ММР можно обнаружить в образцах крови онкологических больных [23]. Было показано, что уровень мРНК MT1-MMP в периферической крови отражает прогрессирование рака [25], [37]. Следовательно, активность MT1-MMP опухолевых клеток может служить потенциальным биомаркером раковой агрессии. Соответственно, мониторинг уровней активности MT1-MMP на клеточной поверхности является ключом к рациональному прогнозированию потенциала инвазии раковых клеток, что может стать основой для выбора лечения онкологических больных.

Биосенсоры на основе

FRET могут быть генетически сконструированы и нацелены на субклеточные области для мониторинга молекулярной активности в живых клетках с высоким пространственно-временным разрешением [38]–[40]. Способность биосенсоров сообщать о динамической молекулярной активности на уровне отдельных клеток обеспечивает важные средства для оценки основного решения клеточной судьбы среди гетерогенной популяции [41]. В этой работе мы методически оптимизировали длину линкера и последовательность расщепления биосенсоров MT1-MMP FRET с помощью анализа расщепления in vitro .Биосенсор AHLR с линкерами GGSGGT показал наилучшую чувствительность к протеолизу MT1-MMP, что указывает на общий подход к повышению чувствительности биосенсора. Биосенсор AHLR также специфичен для расщепления MT1-MMP, хотя и в меньшей степени по сравнению с биосенсорами AHLM и MHLR. Что еще более важно, биосенсор AHLR не может быть расщеплен противораковой MMP-8 in vitro (рис. S3). Хотя биосенсор AHLR с линкером GGS был эвристически сконструирован и использован в предыдущей публикации от нас [30], он не был систематически охарактеризован и оптимизирован с другими сопоставимыми конструкциями биосенсора.В целом, выбранный нами биосенсор AHLR обладает высокой чувствительностью и достаточной специфичностью для оценки активности MT1-MMP отдельных раковых клеток.

Несмотря на то, что инвазивный потенциал и уровень экспрессии MT1-MMP некоторых из протестированных линий раковых клеток были исследованы ранее (таблица S2), ферментативная активность MT1-MMP не измерялась напрямую или систематически не изучалась, чтобы коррелировать с инвазивностью в одинаковые клетки. Здесь мы успешно использовали биосенсор AHLR для дифференциации инвазивных раковых клеток от их неинвазивных аналогов.Следовательно, сообщаемая активность MT1-MMP может применяться для профилирования и прогнозирования инвазивности новых или неизвестных раковых клеток. Кроме того, активность MT1-MMP была значительно выше в адгезивных клетках, чем в клетках в суспензии, что позволяет предположить, что технологии визуализации, скрининг активности MT1-MMP в адгезивных клетках, могут быть полезны при обнаружении и оценке агрессивных раковых клеток.

Наши результаты показывают, что активность MT1-MMP значительно повышается за счет взаимодействия клеток с матриксом в инвазивных раковых клетках в течение 10 минут после прикрепления.Однако остается неясным, как в этих клетках повышается активность MT1-MMP. Возможно, что ECM-вовлечение гемопексинового домена MT1-MMP может ингибировать клатрин-зависимый эндоцитоз MT1-MMP и способствовать его стабильной локализации на плазматической мембране [42]. Кластеризация и активация интегрина может также вызывать димеризацию и активацию связанных с мембраной MT1-MMP [43]. В результате тип и плотность специфических белков матрикса и жесткость матрикса могут влиять на обнаруженную активность MT1-MMP, что может стать важным направлением будущих исследований.Интересно, что клетки могут легко прикрепляться к матрице независимо от их активности MT1-MMP, указывая на то, что активность MT1-MMP является нижестоящим сигналом, необязательным для адгезии, хотя и существенным для инвазии. При исследовании клеток SK-BR-3 их активность и инвазивность MT1-MMP не могут быть активированы за счет адгезии на фибронектине или коллагене (данные не показаны). Эти результаты предполагают, что молекулярный механизм различных типов клеток в ответ на белки ECM окружающей среды может различаться в определении их функциональных результатов.

Таким образом, наша работа представляет собой мощный молекулярный инструмент для обнаружения активности MT1-MMP в одиночных клетках рака молочной железы, который должен проложить путь к профилированию инвазивности рака на уровне отдельных клеток и скринингу эффективных ингибиторов MT1-MMP.

Материалы и методы

Генная конструкция и плазмиды ДНК

Оригинальный биосенсор NL’ и IV’ MT1-MMP был описан ранее [29], [44]. Вкратце, кДНК YPet амплифицировали с помощью ПЦР со смысловым праймером, содержащим сайт BglII, и обратным праймером, содержащим сайт SacI.ECFP амплифицировали с помощью ПЦР со смысловым праймером, содержащим сайт SacI и последовательность субстратного пептида MT1-MMP, и обратным праймером, содержащим сайт PstI, стоп-кодон и сайт HindIII. Последовательности субстратных пептидов, используемые для биосенсоров MT1-MMP FRET, были выбраны из библиотеки субстратных фагов, расщепляемых MMP, включая MT1-MMP, а также сайт расщепления MT1-MMP, идентифицированный в proMMP-2 [29], [31].

Биосенсоры AHLR и RHLR были сконструированы путем замены исходного пептида-субстрата NL (CPKESCNLFVLKD) в биосенсоре NL на оптимизированные пептидные последовательности расщепления AHLR (CRPAHLRDSG) и RHLR (CRPRHLRDSG) соответственно.Эти биосенсоры дополнительно модифицировали с помощью ПЦР и лигирования для вставки линкеров GGS или GGSGGT, фланкирующих последовательность субстрата. Остальные биосенсоры с линкерами GGSGGT: биосенсоры NL, HHLR, RHLM, RALR, MHLR, RGLR и AHLM были сконструированы путем замены последовательности субстрата соответствующими последовательностями субстрата. Биосенсор MT1-MMP отрицательного контроля был сконструирован путем замены сайта расщепления субстрата NL на нерасщепляемую последовательность IV.

Продукты ПЦР сливали вместе и клонировали в pRSETb (Invitrogen) с использованием сайтов BglII/HindIII для бактериальной экспрессии и в pDisplay (Invitrogen) с использованием сайтов BglII/PstI для экспрессии в клетках млекопитающих.Вектор pDisplay содержит N-концевую лидерную последовательность κ-цепи мышиного Ig, которая направляет биосенсорный белок в секреторный путь, и С-концевой трансмембранный домен тромбоцитарного рецептора фактора роста β, который направляет биосенсорный белок в плазму. мембрана.

Экспрессия белков, спектроскопия in vitro и анализы расщепления

Белки биосенсора экспрессировали с N-концевыми 6×His-метками в Escherichia coli , которые культивировали в течение 16 ч при 37°C и очищали хроматографией с хелатированием никеля, как описано ранее [29].Затем очищенные белки биосенсора смешивали с буфером для анализа протеолиза (50 мМ HEPES, 10 мМ CaCl 2 , 0,5 мМ MgCl 2 , 50 мкМ ZnCl 2 и 0,01% Brij-35, pH 6,8) при 37°С. °С. Для анализа in vitro фермент MMP, такой как рекомбинантные каталитические домены MT1-, MT2- или MT3-MMP человека (2 мкг/мл, молекулярная масса 20 кДа, Calbiochem), или активный человеческий MMP -2, ММР-8 или ММР-9 (6 мкг/мл, молекулярная масса 60 кДа, Calbiochem) затем смешивали с буферным раствором биосенсора (1 мкМ).Концентрации корректировали по молекулярной массе так, чтобы каталитические домены и полноразмерная ММП имели примерно одинаковую молярную концентрацию [29]. Отношение эмиссии ECFP/FRET (476 нм/526 нм) биосенсора измеряли с помощью флуоресцентного планшетного ридера (TECAN, Sapphire II) до и после смешивания. Временные изменения отношения выбросов ECFP/FRET рассчитывали на основе записанных данных в Excel (Microsoft), которые затем сравнивали между различными группами после 2,5 часов инкубации. Тестируемые биосенсоры включают различные последовательности субстрата, фланкированные линкерной последовательностью GGS или GGSGGT, как показано на рисунке S2.

Культура клеток и трансфекция

Все клеточные линии были получены от ATCC и культивированы в инкубаторах при 37°C с добавлением 95% воздуха и 5% CO 2 . Клетки MCF-7 культивировали в минимальной основной среде Игла, содержащей 0,01 мг/мл бычьего инсулина и 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) в соответствии с рекомендациями ATCC. Клетки ZR-75-1 и CRL-2341 культивировали в среде RPMI-1640 и 10% FBS. Клетки SK-BR-3 культивировали в модифицированной среде McCoy’s 5a (ATCC) и 10% FBS.Клетки CRL-4010 культивировали в базовой среде для этой клеточной линии с добавками из набора MEGM (Lonza/Clonetics Corporation). Клетки MDA-MB-231 поддерживали в DMEM с высоким содержанием глюкозы (HyClone, Logan, UT) с добавлением 10% FBS (HyClone), 2 мМ L-глютамина [45]. Различные плазмиды ДНК трансфицировали в клетки с использованием Lipofectamine 2000 (Invitrogen) в соответствии с протоколом поставщика в течение 36–72 часов перед визуализацией. Вкратце, 0,5 мкг/мл ДНК биосенсора MT1-MMP использовали для трансфекции липофектамином и 0.125 мкг/мл ДНК MT1-MMP использовали для котрансфекции с биосенсором. Эффективность трансфекции составляла около 15–20%.

Микроскоп

Во время визуализации клетки выдерживали в CO 2 -независимой среде (Gibco BRL) без сыворотки при 37°C. Изображения были получены с помощью инвертированного микроскопа Zeiss Axiovert, оснащенного 100-кратным объективом (1,4 NA) и охлаждаемой камерой устройства с зарядовой связью (Cascade 512B; Photometrics) с использованием программного обеспечения MetaFluor 6.2 (Universal Imaging).Параметры дихроичных зеркал, фильтров возбуждения и испускания для различных флуоресцентных белков описаны ранее [44]. Вкратце, биосенсор MT1-MMP возбуждали при длине волны возбуждения донора 420 ± 20 нм, а эмиссию собирали при длине волны эмиссии донора 475 ± 40 нм или длине волны эмиссии акцептора 535 ± 25 нм для ECFP или FRET изображений соответственно. Фильтр возбуждения для ECFP на 420 ± 20 нм был специально выбран для смещения в сторону более низкой длины волны, в сторону от пикового спектра возбуждения YPet, чтобы уменьшить перекрестное возбуждение акцептора FRET YPet, который имеет значительно более высокую яркость, чем ECFP [38].Этот выбор фильтра может свести к минимуму эффект просачивания на канал FRET. Интенсивность флуоресценции нетрансфицированных клеток количественно определяли как фоновый сигнал и вычитали из сигналов ECFP и FRET трансфицированных клеток. Изображения соотношения пикселей FRET/ECFP рассчитывали на основе изображений интенсивности флуоресценции ECFP и FRET с вычитанием фона с использованием программного обеспечения MetaFluor. Эти изображения соотношений отображались в режиме отображения с модифицированной интенсивностью (IMD), в котором цвет и яркость каждого пикселя определяются соотношением FRET/ECFP и интенсивностью ECFP соответственно.Значения отношения эмиссии были определены количественно и проанализированы с помощью Excel (Microsoft). Родамин возбуждали при 560 ± 40 нм, а эмиссию собирали при 650 ± 100 нм для изображений коллагена.

Вымывание ингибитора, анализ адгезии, покрытие фибронектином и коллаген-родамином

Для вымывания ингибитора клетки предварительно инкубировали с 5 мкМ GM6001 в течение 12 часов, а затем пять раз промывали HBSS [29]. Затем клетки визуализировали для изучения эффекта удаления GM6001 и, следовательно, активации MT1-MMP.

Для анализа адгезии готовили фибронектиновое покрытие (из бычьей плазмы, Sigma, разбавленное до 20 мкг/мл) путем инкубации при 37°C в течение 4 часов. Затем клетки MDA-MB-231, трансфицированные биосенсорами, высевали на поверхность, покрытую фибронектином, для последующей визуализации.

Для приготовления коллагеново-родаминового покрытия [8] исходный коллаген (коллаген крысиного хвоста типа I в уксусной кислоте 4,59 мг/мл, экстрагированный без обработки пепсином, BD Biosciences) разводили боратным буфером с рН 3 до концентрации 1 мг/мл. мл.Разбавленный коллаген (100 мкл) смешивали с PBS (200 мкл, концентрация 0,33 мг/мл) и использовали для покрытия центральной лунки чашек со стеклянным дном (Cell E&G) при 37°C в течение примерно 3 часов. Затем покрытые коллагеном чашки инкубировали с 2 мл боратного буфера при pH 8,5 в течение 1 часа. 7 мкл раствора NHS-родамина (NHS-родамин 10 мг/мл в ДМСО, Thermo Scientific) растворяли в 300 мкл боратного буфера при pH 8,5 и наносили на чашки, покрытые коллагеном, на 2-3 часа для обеспечения конъюгации между поверхностями коллагеновый гель и родамин.Затем чашки 5 раз промывали PBS и инкубировали с PBS перед переносом на них клеток.

Дополнительная информация

Рисунок S2.

Принцип конструирования трех наиболее чувствительных биосенсоров MT1-MMP с оптимальным линкером GGSGGT. (A) Схематическое изображение оптимизированных биосенсоров MT1-MMP, каждый из которых содержит голубой флуоресцентный белок (ECFP), субстратный пептид (AHLR, AHLM или MHLR), окруженный линкерами GGSGGT с обеих сторон, и желтый флуоресцентный белок (YPet). (B) Механизм активации меченого мембраной биосенсора MT1-MMP, экспрессируемого на внеклеточной поверхности плазматической мембраны живой клетки.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0058569.s002

(TIF)

Рисунок S3.

Охарактеризовать специфичность биосенсора AHLR против противораковой MMP-8. Сравнивают временной ход соотношения выбросов биосенсора ECFP/FRET при инкубации с активным каталитическим доменом MT1-MMP или полноразмерным MMP-8.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0058569.s003

(TIF)

Рисунок S4.

Профилируйте инвазивную активность MT1-MMP в клеточных линиях рака молочной железы с использованием анализа вымывания GM6001. Для клеточных линий рака молочной железы (A) CRL 2314 и (B) ZR-75-1 изображения отношения эмиссии ECFP/FRET показаны для репрезентативной клетки до (слева) и после (в центре) вымывания GM6001. Временная динамика количественного значения отношения ECFP/FRET, нормализованного к его среднему значению до вымывания GM6001, представлена ​​на правой панели.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0058569.s004

(TIF)

Таблица S1.

Последовательности наиболее чувствительного и специфичного субстрата расщепления MT1-MMP. Последовательности, показанные в строках, были идентифицированы с помощью расщепления библиотек субстратных фагов (10×10 9 отдельных фагов, каждый из которых экспрессирует случайную последовательность гексамерного пептида) отдельными очищенными ММР, включая МТ1-ММР. Остатки, показанные в положениях P5, P4 и P3’-P5’, одинаково благоприятны для протеолиза MT1-MMP.Столбцы P1-P1’ показывают аминокислоты, признанные сайтом расщепления. В столбце оценки высокий балл указывает на высокую чувствительность и специфичность последовательности, предпочтительно расщепляемой MT1-MMP, по сравнению с другими MMP.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0058569.s005

(TIF)

Таблица S2.

Уровень экспрессии MT1-MMP и инвазивность линий раковых клеток. HeLa представляет собой бессмертную клеточную линию, полученную из железистого рака шейки матки [46], которая экспрессирует небольшое количество белка MT1-MMP и не может проникать через коллаген.Таким образом, клетки HeLa были выбраны в качестве отрицательного контроля, а клетки, сверхэкспрессирующие экзогенный MT1-MMP, — в качестве положительного контроля. Было обнаружено, что клетки HT1080, полученные из фибросаркомы, и клетки рака молочной железы MDA-MB-231 обладают высокой инвазивностью в коллагеновом геле и экспрессируют высокие уровни MT1-MMP [47]-[49]. Было показано, что по сравнению с клетками MDA-MB-231 низкоинвазивные клетки рака молочной железы MCF-7 и клетки ZR-75-1 экспрессируют низкие уровни MT1-MMP [50]-[52]. Клетки рака молочной железы (SK-BR-3) обладают низкой инвазивностью, но сообщалось о противоречивой экспрессии MT1-MMP [51], [53]-[55].Клетки Her2-негативного рака молочной железы CRL2314 (ATCC HCC-48) имеют низкий уровень экспрессии MT1-MMP, но их инвазивность относительно неизвестна [56]. Экспрессия MT1-MMP или инвазивный потенциал бессмертных эпителиальных клеток молочной железы CRL4010 (ATCC CRL_4010) неясны.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0058569.s006

(TIF)

Фильм S1.

Активация MT1-MMP во время анализа вымывания ингибитора. Живую клетку MDA-MB-231 трансфицировали биосенсором AHLR и предварительно инкубировали с ингибитором MMP, GM6001.За клеткой следили по мере вымывания ингибитора из среды. Левая панель: видеопоследовательность изображений ДИК; правая панель: видеопоследовательность изображений соотношения ECFP/FRET одной и той же клетки, меняющей цвет с синего на красный, что представляет собой активацию MT1-MMP.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0058569.s007

(AVI)

Фильм S2.

Активация MT1-MMP во время клеточной адгезии. Живую клетку MDA-MB-231, экспрессирующую биосенсор AHLR, поместили на поверхность покровного стекла, покрытого фибронектином, чтобы позволить клетке прикрепиться и распространиться.За клеткой следили в процессе адгезии (в центре кадра). Отношение ECFP/FRET на периферии клетки становилось красным по мере расширения клетки, что свидетельствует об активации MT1-MMP. Левая панель: видеопоследовательность изображений ДИК; правая панель: видеопоследовательность изображений соотношения ECFP/FRET той же клетки.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0058569.s008

(AVI)

Благодарности

Мы благодарим доктора Стивена Дж. Вайса (Мичиганский университет, Анн-Арбор) за содержательные обсуждения.

Авторские взносы

Задумал и спроектировал эксперименты: С.Л. Инсяо Ван. Выполняли эксперименты: SL Yi Wang HH YP EC. Проанализированы данные: SL SB HO AS Yingxiao Wang. Написал статью: SL SB HO AS Yingxiao Wang.

Каталожные номера

  1. 1. Кессенброк К., Плакс В., Верб З. (2010)Матричные металлопротеиназы: регуляторы микроокружения опухоли. Ячейка 141: 52–67.
  2. 2. Стронгин А.Ю. (2010)Протеолитическая и непротеолитическая роль матриксной металлопротеиназы мембранного типа 1 при злокачественных новообразованиях.Биохим Биофиз Акта 1803: 133–141.
  3. 3. Мартин М.Д., Матрисиан Л.М. (2007)Другая сторона MMP: защитные роли в развитии опухоли. Раковые метастазы Откр. 26: 717–724.
  4. 4. Гутьеррес-Фернандес А., Фуэйо А., Фольгерас А.Р., Гарабая С., Пеннингтон С.Дж. и др. (2008)Матричная металлопротеиназа-8 действует как супрессор метастазирования посредством модуляции адгезии и инвазии опухолевых клеток. Рак Рез. 68: 2755–2763.
  5. 5. Palavalli LH, Prickett TD, Wunderlich JR, Wei X, Burrell AS, et al.(2009) Анализ семейства матриксных металлопротеиназ показывает, что ММР8 часто мутирует при меланоме. Нат Жене 41: 518–520.
  6. 6. Coussens LM, Fingleton B, Matrisian LM (2002)Ингибиторы матриксной металлопротеиназы и рак: испытания и невзгоды. Наука 295: 2387–2392.
  7. 7. Сато Х., Такино Т., Окада Й., Цао Дж., Синагава А. и др. (1994)Матричная металлопротеиназа экспрессируется на поверхности инвазивных опухолевых клеток. Природа 370: 61–65.
  8. 8.Сабех Ф., Ота И., Холмбек К., Биркедал-Хансен Х., Солоуэй П. и др. (2004) Движение опухолевых клеток через внеклеточный матрикс контролируется прикрепленной к мембране коллагеназой MT1-MMP. J Cell Biol 167: 769–781.
  9. 9. Hotary K, Allen E, Punturieri A, Yana I, Weiss SJ (2000) Регуляция клеточной инвазии и морфогенеза в трехмерном коллагеновом матриксе I типа с помощью матриксных металлопротеиназ мембранного типа 1, 2 и 3. J Cell Biol 149: 1309–1323 гг.
  10. 10.Sabeh F, Shimizu-Hirota R, Weiss SJ (2009)Протеазозависимые и независимые программы инвазии раковых клеток: новый взгляд на трехмерное амебоидное движение. J Cell Biol 185: 11–19.
  11. 11. Kachgal S, Carrion B, Janson IA, Putnam AJ (2012)Стромальные клетки костного мозга стимулируют ангиогенную программу, которая требует эндотелиального MT1-MMP. J Cell Physiol 227: 3546–3555.
  12. 12. Seiki M (2003)Матричная металлопротеиназа мембранного типа 1: ключевой фермент для инвазии опухоли.Раковое письмо 194: 1–11.
  13. 13. Эгеблад М., Верб З. (2002)Новые функции матриксных металлопротеиназ при прогрессировании рака. Nat Rev Рак 2: 161–174.
  14. 14. Apte SS, Fukai N, Beier DR, Olsen BR (1997) Ген матриксной металлопротеиназы-14 (MMP-14) структурно отличается от других генов MMP и коэкспрессируется с геном TIMP-2 во время эмбриогенеза мыши. J Biol Chem 272: 25511–25517.
  15. 15. Sato H, Kinoshita T, Takino T, Nakayama K, Seiki M (1996)Активация рекомбинантной матричной металлопротеиназы мембранного типа 1 (MT1-MMP) фурином и ее взаимодействие с тканевым ингибитором металлопротеиназ (TIMP)-2.Письмо ФЭБС 393: 101–104.
  16. 16. Yana I, Weiss SJ (2000) Регуляция активации матриксной металлопротеиназы мембранного типа 1 пропротеинконвертазами. Мол Биол Ячейка 11: 2387–2401.
  17. 17. Голубков В.С., Чеканов А.В., Ширяев С.А., Алешин А.Е., Ратников Б.И. (2007)Протеолиз продомена матриксной металлопротеиназы мембранного типа 1: значение для двухэтапного протеолитического процессинга и активации. J Biol Chem 282: 36283–36291.
  18. 18. Osenkowski P, Toth M, Fridman R (2004)Обработка, потеря и эндоцитоз матричной металлопротеиназы мембранного типа 1 (MT1-MMP).J Cell Physiol 200: 2–10.
  19. 19. Remacle A, Murphy G, Roghi C (2003)Мембранная матричная металлопротеиназа I типа (MT1-MMP) интернализуется двумя разными путями и рециркулируется на клеточную поверхность. J Cell Sci 116: 3905–3916.
  20. 20. Jiang WG, Davies G, Martin TA, Parr C, Watkins G, et al. (2006)Экспрессия матриксной металлопротеиназы мембранного типа 1, MT1-MMP, при раке молочной железы человека и ее влияние на инвазивность клеток рака молочной железы. Int J Mol Med 17: 583–590.
  21. 21. Sroka IC, Nagle RB, Bowden GT (2007)Матричная металлопротеиназа мембранного типа 1 регулируется sp1 посредством дифференциальной активации путей AKT, JNK и ERK в клетках опухоли предстательной железы человека. Неоплазия 9: 406–417.
  22. 22. Нагакава О., Мураками К., Ямаура Т., Фудзиучи Ю., Мурата Дж. и др. (2000) Экспрессия матриксной металлопротеиназы мембранного типа 1 (MT1-MMP) на клеточных линиях рака предстательной железы. Рак Летт 155: 173–179.
  23. 23. Itoh Y, Seiki M (2006) MT1-MMP: мощный модификатор перицеллюлярной микросреды.J Cell Physiol 206: 1–8.
  24. 24. Перентес Дж. Ю., Киркпатрик Н. Д., Нагано С., Смит Э. Ю., Шейвер К. М. и соавт. (2011)Связанный с раковыми клетками MT1-MMP способствует инвазии кровеносных сосудов и отдаленным метастазам в трижды негативных опухолях молочной железы. Рак Res 71: 4527–4538.
  25. 25. Мимори К., Фукагава Т., Косака Ю., Исикава К., Ивацуки М. и др. (2008) Крупномасштабное исследование MT1-MMP в качестве маркера изолированных опухолевых клеток в периферической крови и костном мозге при раке желудка.Энн Сург Онкол 15: 2934–2942.
  26. 26. Lu S, Wang Y (2010)Флуоресцентный резонансный перенос энергии биосенсоров для обнаружения рака и оценки эффективности лекарств. Clin Cancer Res 16: 3822–3824.
  27. 27. Jabaiah A, Daugherty PS (2011)Направленная эволюция протеазных маяков, которые позволяют чувствительно обнаруживать эндогенную активность MT1-MMP в линиях опухолевых клеток. Химическая биология 18: 392–401.
  28. 28. Паккард Б.З., Артым В.В., Комория А., Ямада К.М. (2009)Прямая визуализация активности протеаз на клетках, мигрирующих в трех измерениях.Матрица Биол 28: 3–10.
  29. 29. Ouyang M, Lu S, Li XY, Xu J, Seong J и др. (2008) Визуализация активности матриксной металлопротеиназы поляризованной мембраны 1 типа в живых клетках с помощью визуализации переноса энергии флуоресцентного резонанса. J Biol Chem 283: 17740–17748.
  30. 30. Ouyang M, Huang H, Shaner NC, Remacle AG, Shiryaev SA, et al. (2010)Одновременная визуализация протуморогенной активности Src и MT1-MMP с резонансной передачей энергии флуоресценции. Рак Рез. 70: 2204–2212.
  31. 31. Ратников Б., Чеплак П., Смит Дж. В. (2009) Фаговый дисплей с высокой пропускной способностью для определения профиля протеазы. Методы Мол Биол 539: 93–114.
  32. 32. Комацу Н., Аоки К., Ямада М., Юкинага Х., Фудзита Ю. и др. (2011)Разработка оптимизированной основы биосенсоров FRET для киназ и GTPases. Mol Biol Cell 22: 4647–4656.
  33. 33. Ямамото М., Цуджишита Х., Хори Н., Охиши Ю., Иноуэ С. и др. (1998)Ингибирование матриксной металлопротеиназы мембранного типа 1 ингибиторами гидроксамата: исследование подсайтового кармана.J Med Chem 41: 1209–1217.
  34. 34. Grobelny D, Poncz L, Galardy RE (1992)Ингибирование коллагеназы фибробластов кожи человека, термолизина и эластазы Pseudomonas aeruginosa пептидными гидроксамовыми кислотами. Биохимия 31: 7152–7154.
  35. 35. Madsen DH, Ingvarsen S, Jurgensen HJ, Melander MC, Kjoller L, et al. (2011) Нефагоцитарный путь поглощения коллагена: особый путь деградации. J Biol Chem 286: 26996–27010.
  36. 36. Yana I, Seiki M (2002) MT-MMPs играют ключевую роль в распространении рака.Clin Exp Metastasis 19: 209–215.
  37. 37. Somiari SB, Somiari RI, Heckman CM, Olsen CH, Jordan RM, et al. (2006) Циркулирующие MMP2 и MMP9 при раке молочной железы — потенциальная роль в классификации пациентов на категории низкого риска, высокого риска, доброкачественного заболевания и рака молочной железы. Int J Рак 119: 1403–1411.
  38. 38. Wang Y, Shyy JY, Chien S (2008)Флуоресцентные белки, визуализация живых клеток и механобиология: надо верить. Annu Rev Biomed Eng 10: 1–38.
  39. 39.Коварик М.Л., Олбриттон Н.Л. (2011)Измерение активности ферментов в одиночных клетках. Тенденции биотехнологии 29: 222–230.
  40. 40. Qin Y, Dittmer PJ, Park JG, Jansen KB, Palmer AE (2011)Измерение стационарного и динамического эндоплазматического ретикулума и Golgi Zn2+ с помощью генетически закодированных датчиков. Proc Natl Acad Sci USA 108: 7351–7356.
  41. 41. Спиллер Д.Г., Вуд К.Д., Рэнд Д.А., Уайт М.Р. (2010) Измерение одноклеточной динамики. Природа 465: 736–745.
  42. 42.Лафлер М.А., Меркури Ф.А., Руангпанит Н., Сейки М., Сато Х. и др. (2006) Коллаген типа I отменяет опосредованную клатрином интернализацию матриксной металлопротеиназы мембранного типа 1 (MT1-MMP) через гемопексиновый домен MT1-MMP. J Biol Chem 281: 6826–6840.
  43. 43. Itoh Y, Palmisano R, Anilkumar N, Nagase H, Miyawaki A, et al. (2011)Димеризация MT1-MMP во время клеточной инвазии, обнаруженная с помощью резонансного переноса энергии флуоресценции. Биохим J 440: 319–326.
  44. 44.Ouyang M, Sun J, Chien S, Wang Y (2008)Определение иерархических отношений Src и Rac в субклеточных местах с помощью биосенсоров FRET. Proc Natl Acad Sci U S A 105: 14353–14358.
  45. 45. Артым В.В., Чжан Ю., Зайлер-Мойсейвич Ф., Ямада К.М., Мюллер С.К. (2006)Динамические взаимодействия кортактина и матриксной металлопротеиназы мембранного типа 1 при инвадоподиях: определение стадий образования и функции инвадоподий. Рак Рез. 66: 3034–3043.
  46. 46.Masters JR (2002) Клетки HeLa 50 лет спустя: хорошие, плохие и уродливые. Nat Rev Рак 2: 315–319.
  47. 47. Zhai Y, Hotary KB, Nan B, Bosch FX, Munoz N и др. (2005) Экспрессия матриксной металлопротеиназы мембранного типа 1 связана с прогрессированием и инвазией карциномы шейки матки. Рак Рез. 65: 6543–6550.
  48. 48. Брехман В., Нойфельд Г. (2009)Новый асимметричный трехмерный анализ in-vitro для изучения инвазии опухолевых клеток. BMC Рак 9: 415.
  49. 49.Пуляева Х., Буэно Дж., Полетт М., Бирембо П., Сато Х. и др. (1997) MT1-MMP коррелирует с потенциалом активации MMP-2, наблюдаемым после перехода эпителия в мезенхиму в клетках карциномы молочной железы человека. Clin Exp Metastasis 15: 111–120.
  50. 50. Figueira RC, Gomes LR, Neto JS, Silva FC, Silva ID и др. (2009) Корреляция между ММР и их ингибиторами в образцах опухолевой ткани рака молочной железы и в клеточных линиях с различным метастатическим потенциалом. BMC Рак 9:20.
  51. 51.Zajchowski DA, Bartholdi MF, Gong Y, Webster L, Liu HL, et al. (2001)Идентификация профилей экспрессии генов, которые предсказывают агрессивное поведение клеток рака молочной железы. Рак Рез. 61: 5168–5178.
  52. 52. Деви Л., Хуанг Л., Наа Л., Янамандра Н., Питерс Х. и др. (2009)Селективное ингибирование матриксной металлопротеиназы-14 блокирует рост, инвазию и ангиогенез опухоли. Рак Рез. 69: 1517–1526.
  53. 53. Binder C, Hagemann T, Husen B, Schulz M, Einspanier A (2002)Релаксин повышает инвазивность клеточных линий рака молочной железы in vitro за счет повышения активности матриксных металлопротеаз.Мол Хум Репрод 8: 789–796.
  54. 54. Цзян А., Лехти К., Ван Х., Вайс С.Дж., Кески-Оджа Дж. и др. (2001) Регуляция активности матриксной металлопротеиназы 1 мембранного типа с помощью динамин-опосредованного эндоцитоза. Proc Natl Acad Sci U S A 98: 13693–13698.
  55. 55. Jang JY, Jeon YK, Kim CW (2010)Деградация HER2/neu с помощью ANT2 shRNA подавляет миграцию и инвазивность клеток рака молочной железы. BMC Рак 10: 391.
  56. 56. Резайпур Р., Джон Р., Ади С.Г., Чейни Э.Дж., Марьянович М. и др.(2009)Fc-направленная конъюгация антител с магнитными наночастицами для усиленного молекулярного нацеливания. J Innov Opt Health Sci 2: 387–396.

Продолжайте избегать акций универсальных магазинов Кейси (NASDAQ:CASY). , акции вернули около 19,7% против роста S&P 500 на 28,15%.Будучи таким человеком, как я, если бы я раньше был быком, я бы подчеркнул относительно хорошую доходность. Однако, поскольку я был осторожен, я собираюсь написать об «относительной низкой производительности». Это то поведение, которого друзья и семья привыкли ожидать и с трудом терпят. Однако, если серьезно, я подумал, что сегодня еще раз пересмотрю название, чтобы понять, стоит ли его покупать. Я приму это решение, рассмотрев здесь самую последнюю финансовую историю, уделяя особое внимание устойчивости дивидендов.Я также собираюсь рассматривать акции как вещь, отличную от основного бизнеса. Наконец, в прошлом я торговал опционами на это имя и хочу прокомментировать и их. В своей предыдущей статье я указывал на риск, связанный с торговлей опционами такого типа, и чувствую себя обязанным напомнить об этом инвесторам.

Мое письмо может быть «немного трудным для понимания». Я понимаю. Для тех людей, которые хотят большего, чем они могут почерпнуть из заголовка и трех пунктов выше, но не хотят подвергаться всей моей глупости, я предлагаю этот абзац «тезис».Здесь вы получаете большую часть «аромата» анализа без всех калорий «плохой шутки». На мой взгляд, дивиденды здесь очень надежны, но оценка очень высока, и по этой причине я бы рекомендовал избегать акций. Я также хотел бы напомнить людям, что инвестирование — это релятивистский процесс, а это означает, что если я покупаю X, я по определению избегаю альтернативного использования этого капитала. В этом контексте я бы попросил инвесторов помнить, что доходность 10-летних казначейских облигаций США в настоящее время составляет 2,9%. Учитывая, что вы можете получить безрисковую ставку 2.9% от Мурики, почему вы соглашаетесь на 223 базисных пункта меньше от компании, даже такой прибыльной, как эта? Я думаю, что проблема сводится к одному вопросу: «Какими темпами должны будут расти дивиденды, чтобы инвесторы соответствовали (не говоря уже о превышении) денежным потокам, которые они получат от безрисковых государственных облигаций в течение следующего десятилетия?» Я думаю, что этот вопрос будет становиться все более актуальным для инвесторов в акции в целом, что, на мой взгляд, требует учета текущих оценок. Наконец, я знаю из личного опыта, что некоторые люди в «Земле свободных и на родине храбрых» становятся немного обидчивыми, если я называю их родину «мурикой».«Если это вы, дорогой читатель, то должны знать, что странным артефактом ирландской культуры является то, что мы высмеиваем то, что любим. Признаюсь, иногда я высмеиваю некоторые аспекты американской культуры и внешней политики. Просто знайте, что когда я это делаю, я делаю это из любви. Также знайте, что я не устанавливаю прямой зрительный контакт, я двигаюсь медленно и издаю тихое мурлыканье, чтобы, надеюсь, успокоить большую, красную, белую и синюю гориллу в мире. Надеюсь, у нас все хорошо.

Финансовый обзор

Я думаю, что последние финансовые показатели компании во многих отношениях были неплохими.В частности, как выручка, так и чистая прибыль резко выросли за первые девять месяцев 2022 года по сравнению с тем же периодом 2021 года. Выручка выросла примерно на 50%, а чистая прибыль увеличилась на гораздо менее впечатляющие 3,25%. Акционеры были вознаграждены за это улучшение результатов дополнительными выплатами дивидендов в размере 7,9%.

Если вы были обеспокоены тем, что первые девять месяцев 2022 года выглядели хорошо по сравнению с 2021 годом, потому что последний был однозначно плохим, не беспокойтесь больше. Компания хорошо себя зарекомендовала и по сравнению с тем периодом.В частности, выручка и чистая прибыль за первые девять месяцев 2022 года выросли на 29% и 39% соответственно. Дивиденды также были чуть менее чем на 12% выше в 2022 году по сравнению с тем же периодом в 2019 году. На конец последнего периода у компании был долг примерно на 493 миллиона долларов больше, чем в 2021 году, а процентные платежи были примерно на 17% выше. Причина, по которой я так беспокоюсь о структурах капитала, заключается в том, что в какой-то момент они могут повлиять на устойчивость дивидендов.

Устойчивость к дивидендам

Написание статьи об устойчивости дивидендов, я думаю, было бы целесообразно потратить некоторое время на ее описание по двум причинам. Во-первых, это поддерживает цену, а это означает, что акции компании, которая регулярно выплачивает устойчивые дивиденды, имеют минимальную цену, ниже которой они не упадут. Во-вторых, инвесторам нравится предсказуемость, и нет ничего плохого в предсказуемом вливании дивидендов на ваш счет.

Как известно моим постоянным клиентам, когда дело доходит до дивидендов, я снимаю свою «шапку накопления» и надеваю «шляпу денежного потока», сравнивая размер и сроки будущих денежных обязательств с размером и сроками текущих и вероятных будущих источники денежных средств.Давайте начнем с обязательств, не так ли? Я скопировал следующую таблицу договорных обязательств со страницы 26 последнего 10-К, так что вам не придется. Пожалуйста. Из этого мы видим, что в этом году компания потратит на различные обязательства ~$49,5 млн, а в последующие два года в среднем ~$74,4 млн.

Договорные обязательства Кейси (последние 10-К Кейси)

По этим обязательствам компания в настоящее время имеет около 43,5 миллионов долларов наличными.Кроме того, за последние три года они заработали в среднем около 613 миллионов долларов за счет денежных средств от операционной деятельности. В то же время они потратили в среднем 456 миллионов долларов на финансирование бизнеса через деятельность CFI.

Все это говорит мне о том, что дивиденды здесь довольно хорошо покрываются, и поэтому я был бы готов купить акции по правильной цене.

Casey’s General Stores Financials (отношения с инвесторами Casey’s General Stores)

The Stock

Некоторые из вас, кто следит за мной, почему-то знают, что это тот момент в статье, когда я впадаю, по выражению моей племянницы, в «водяную меланхолию» .По-видимому, это означает «депрессивный». Именно здесь я начинаю писать о доходности с поправкой на риск и о том, что даже акции стабильной дивидендной машины могут быть ужасной инвестицией по неправильной цене. Компания может заработать много денег, но инвестиции все равно могут оказаться ужасными, если цена акций слишком высока. Это связано с тем, что все предприятия — это, по сути, просто организации, которые берут кучу входных данных, повышают ценность этих входных данных, а затем продают продукты или услуги (надеюсь) с прибылью.Акции, с другой стороны, являются прокси, изменение цен которых больше отражает настроение толпы, чем что-либо, связанное с бизнесом. На мой взгляд, изменения цен на акции гораздо больше связаны с ожиданиями относительно будущего компании. Вот почему я смотрю на акции как на нечто отдельное от основного бизнеса.

Простите меня за то, что я потворствую своей склонности «болтать» об одной идее. Я чувствую необходимость продемонстрировать важность рассмотрения акций как вещи, отличной от бизнеса, на примере самих акций Кейси.Компания опубликовала свои последние квартальные результаты 9 марта. Если вы купили эти акции в тот день, с тех пор вы выросли примерно на 12,5%. Если вы ждали до 13 апреля, пока цена акций «докажет», что это хорошая инвестиция, с тех пор вы потеряли примерно 1%. Недостаточно изменений в фирме за этот короткий промежуток времени, чтобы гарантировать 13,5-процентную дисперсию доходности. Различия в доходах сводились исключительно к уплаченной цене. Инвесторы, которые купили практически идентичные акции дешевле, оказались лучше, чем те, кто купил акции по более высокой цене.Поэтому я стараюсь не переплачивать за акции.

Мои постоянные клиенты знают, что я измеряю дешевизну (или нет) акций несколькими способами, от простых до более сложных. С простой стороны, я рассматриваю отношение цены к некоторому показателю экономической ценности, например объему продаж, прибыли, свободному денежному потоку и т.п. В идеале я хочу видеть акции, торгующиеся с дисконтом как к собственной истории, так и к рынку в целом. В моем предыдущем послании я беспокоился о том, что PE составляет около 25,65. На этом фронте мало что изменилось, согласно следующему:

Данные YCharts

Несмотря на то, что акции немного дешевле на основе PE, в настоящее время они оцениваются на высокой стороне по сравнению с историческими данными.Как и следовало ожидать, цены на акции выше, чем за последние несколько лет.

Данные YCharts

В то время, когда инвесторы платят за акции на почти рекордных уровнях, они получают почти рекордно низкую дивидендную доходность, согласно следующему:

Данные YCharts

Не знаю, как вы, дорогой читатель, но Я не сторонник платить больше и получать меньше. Я не думаю, что терпимость к такой динамике способствует долгосрочному инвестиционному успеху.

Помимо простых коэффициентов, я хочу попытаться понять, что рынок в настоящее время «предполагает» относительно будущего этой компании.Если вы регулярно меня читаете, то знаете, что в этом я полагаюсь на работу профессора Стивена Пенмана и его книгу «Учет стоимости». В этой книге Пенман рассказывает инвесторам, как они могут применить магию школьной алгебры к стандартной финансовой формуле, чтобы выяснить, что рынок «думает» о будущем росте данной компании. Это включает в себя выделение переменной «g» (рост) в довольно стандартной финансовой формуле. Применение этого подхода к Casey’s на данный момент предполагает, что рынок предполагает, что эта компания будет расти со скоростью ~ 7.9% бессрочно, что я считаю очень оптимистичным. Учитывая все вышеизложенное, я продолжаю рекомендовать избегать этих акций.

Обзор риска опционов

То, что я не думаю, что есть ценность в $208,50, не означает, что я не захочу купить по правильной цене. Для меня эта цена составляет ~ 125 долларов за акцию. Это значение соответствует дивидендной доходности ~ 1,1%. Прежде чем быки «взбесятся» из-за моего предположения, что эта цена «сумасшедшая», пожалуйста, помните, что казначейские облигации США в настоящее время дают 2.9%. Зачем мне рисковать потерей капитала и меньшим доходом от акций, если я могу спать по ночам с гораздо большим потоком денежных средств?

В любом случае, на данный момент премия, предлагаемая за 125-долларовые страйки, настолько мала, что продавать путы бессмысленно. Я хочу напомнить инвесторам о риске, который я указал в своей предыдущей статье об этом имени. Некоторые опционы пут торгуются довольно тонко, поэтому спред между спросом и предложением довольно велик. Таким образом, когда дело доходит до таких опционов, я бы рекомендовал инвесторам относиться к ним как к опционам в «европейском» стиле и держать их до истечения срока действия.Причина этого в том, что если инвестору нужно закрыть позицию, он будет сбит с толку огромным спредом между спросом и предложением.

Заключение

Хотя я думаю, что дивиденды здесь стабильны, я не думаю, что акции стоят текущей цены. Инвестирование — это релятивистская игра, а это означает, что когда мы покупаем X, мы по определению избегаем Y. В мире, где вы можете получать 2,9% от дяди Сэма, почему вы соглашаетесь на такую ​​маленькую дивидендную доходность? Повторю вопрос, который задавал ранее.«С какой скоростью дивиденды должны будут расти, чтобы даже соответствовать (не говоря уже о превышении) денежных потоков, которые инвесторы могли бы получить от безрисковой ставки в течение следующих 10 лет?» Я думаю, что этот вопрос будет становиться все более актуальным для всех инвесторов в акции, и по этой причине я бы рекомендовал продолжать избегать этих акций.

Фонд CorpNation отмечает годовщину своей годовщины в Такоради

Столица Французской Ривьеры Ницца Ла Бель («Ницца, Прекрасная») издавна славится красотой своего старого города, рынков, пляжей и Замковая гора, с которой открывается захватывающий вид на весь город.

 

Ницца — прекрасный город для пеших прогулок, так как основные достопримечательности находятся очень близко друг к другу.

 

Посетите Ниццу

Ницца, второй по величине город Прованса после Марселя, одновременно шикарен и популярен, праздничен и динамичен, а его население разнообразно и молодо. Посещение Ниццы позволит вам открыть для себя исторический, мультикультурный и гастрономический центр Ривьеры.

 

В программе: прогуляйтесь по улочкам старого города, откройте для себя синее море легендарной Английской набережной, отведайте множество местных деликатесов и полюбуйтесь красивейшими видами залива Ангелов.Посмотрите, чем можно заняться в Ницце, если будете там.

 

День в Ницце: что делать и посмотреть.

1. Бесплатная экскурсия по Ницце и старому городу.

Присоединяйтесь к бесплатной экскурсии по городу от Villa Hostels, чтобы познакомиться с Ниццей и ее историей. Откройте для себя скрытые места и памятники среди извилистых улочек Старого города и узнайте больше об истории города, известных и секретных фактах. Посетив площадь Массена, Оперный театр, рынок Кур-Салейя, Замковую гору и многие другие достопримечательности, вы почувствуете все, что может предложить Ницца.

 

Отличный способ познакомиться с другими путешественниками из хостела и познакомиться с самим городом. Подробности спрашивайте в общежитии.

 

2.   Английская набережная

Английская набережная окружает все пляжи Ниццы, от старого города до аэропорта. Это красивая прогулка по заливу, и вы можете остановиться на любом пляже, который вам подходит. На набережной также расположены рестораны и кафе с террасами, где можно насладиться видом за чашечкой кофе и круассаном.Лучшее место для наблюдения за людьми, поскольку набережная является популярным местом для бегунов, велосипедистов, местных жителей и туристов.

 

Также посетите известные отели вдоль набережной, такие как Negresco и Palais de la Méditerranée, роскошный 5-звездочный отель в стиле ар-деко, который можно забронировать на https://karta.com.

 

3.   Замковая гора, La Colline du Château

В южной части города, в конце Английской набережной и рядом с гаванью, есть большой холм с видом на старый город и гавань, на месте замка, защищавшего город.Вы можете подняться на холм по лестнице, 5-10-минутный подъем, который предлагает несколько смотровых площадок по пути. Кроме того, наверх вас доставит бесплатный лифт.

 

На скалистом холме когда-то располагалась укрепленная цитадель, от которой сегодня можно увидеть лишь некоторые руины. Это красивый лесной парк, идеально подходящий для пикника с красивейшим видом на Ниццу, Средиземное море и гавань. В самой высокой точке находится знаменитый водопад с видом на город — обязательное место для фотографий в Instagram!

 

4.Старый город Ниццы

Старая Ницца похожа на маленькую средневековую деревню: лабиринт мощеных улиц и широких городских площадей. Цвет фасадов зданий варьируется от бледно-желтого до охристо-красного с красочными ставнями, которые оживляют извилистые улочки. Многим постройкам сотни лет. Прогуляйтесь по лабиринту узких улочек, чтобы найти лучшие французские товары: ремесленные магазины, небольшие бакалейные лавки, рестораны и магазины шикарной одежды, а также бесчисленные кафе, кафе-мороженое, винные бары и сувенирные магазины.

 

После шоппинга обратите внимание на знаменитое кафе-мороженое (Fenocchio) на площади Россетти, известную городскую площадь с ресторанами и кафе, а также на собор Святого Репарата, покровителя Ниццы.

 

5.   Овощной и цветочный рынок Кур-Салея

Эта пешеходная улица известна своим оживленным продовольственным и цветочным рынком. Здесь вы найдете фрукты и овощи из региона, а также готовые фирменные блюда, такие как сокка, сковородка и писсаладьер, а также местные продукты, такие как оливковое масло, специи, оливковая паста и паста из анчоусов.

 

Рынок проводится каждый день, кроме понедельника, когда антикварный рынок занимает всю площадь. Мы любим рынок за его динамичную атмосферу, шумные толпы и дискуссии на французском, английском, итальянском и местном диалекте Ниссара.

 

6.   Променад дю Пайон

Променад дю Пайон, также называемый Coulée Verte или Green Splash, представляет собой красивый новый центральный парк площадью 12 гектаров в самом сердце Ниццы, отделяющий старый город от нового города. на пути ныне подземной реки Пайон.Он начинается у Музея современного искусства (MAMAC), проходит мимо площади Массена и заканчивается у Театра де Вердур рядом с Английской набережной.

 

Парк — популярное место отдыха местных жителей и туристов, где можно насладиться зеленью. Есть много удобств для детей, затененных зон и зеленых дорожек, а также большой фонтан, который летом собирает толпы. Зимой рождественский базар и колесо обозрения украшают этот район и обеспечивают прекрасные виды и фотографии.

 

7.   Музей Матисса

До музея Матисса легко добраться на автобусе или пешком в красивом районе Симье. лет. Музей посвящен работам Анри Матисса (1869–1954), который жил в Ницце с 1917 года до своей смерти в 1954 году, и его обязательно нужно посетить, если вы любите искусство. В экспозиции около 70 картин, 200 рисунков, гравюр, скульптур, иллюстрированных книг, фотографий и личных вещей художника.

 

8.   Русский православный собор

Русский православный собор, классифицированный как исторический памятник, расположен недалеко от железнодорожного вокзала. Ваш визит перенесет вас в другую эпоху: эпоху царей на Красной площади в Москве. Свято-Николаевский собор — одно из самых важных православных сооружений за пределами России.

Добавить комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован.