Разное

Москвич 2141 1989 года: Купить Москвич 2141 с пробегом 1989 года по цене от 20 000 рублей

Содержание

Отзывы владельцев Москвич 2141 (Москвич) с фото, плюсы и минусы, достоинства и недостатки

Последовательно владел двумя М-2141 с 1994 по 2008 гг. с двигателями УЗАМ 1.7л. Первый доставлял много хлопот, 2-ой был собран в гараже приятелем на новом кузове. По эксплуатационным качествам ничем…

63 комментария

купил в 2007 году за 25000. поменял пороги и днище за 11 лет не подводил не разу по большому счету(на буксире не таскали) универсальная машина удобная в эксплуатации и ремонте

22 комментария

Отличная машинка для своего времени была! Просторный, вместимый. На трассе, после 100-ки шел как утюг, не шелохнувшись (а Тазы — швыряло из стороны в сторону). В 90-х возил на нем грузы, убирал…

43 комментария

Надежный и долговечный автомобиль,запчасти есть,но их не куда ставить.Хорошая вместимость в кабине,чувствуется просторность сидения и управлением автомобилем.Можно перевозить груз массой около 500 кг…

11 комментарий

Приобрел азлк в 1997г.На ходу до сих пор и ещё не сгнил. конечноблагодаря моим рукам 3 раза его промовилил полностью и заливал в короба, обрабатывал двери внутри салон полностью вынимал и…

8

Учитывая год разработки 10 балов по 5-ти бальной шкале. Просторный проходимость супер да и более обтекаемый от ВАЗ-ов.

3

хороший Советский авто. жаль запчасти с каждым годом всё труднее достать у меня Москвич 2141 1989г.в. до сих пор на ходу.

1

Как больной приверженец АЗЛК ( вылечился в 2005 году с помощью таблетки Х-Элантра), в 2000-2005 г.г. купил второго 2141, уже с названием " Святое горе". Проездил пять лет, в основном по…

3

Мне нравится,степенный,просторный,лёгкий.Машина замечательная, надо было развивать ее производство. От болячек при рождении моя модель практически избавилась. За время эксплуатации с 1999 по 2006гг нареканий не было. Плохо, что не было…

2

Лучше машины для дачи и быть не может! Очень теплый, в морозы отогреет любого. Зап. части все на него пока на рынке есть, и стоят копейки.Просто суперкар. Едет и по асфальту и по грунтовке. Скорости переключаются почти неслышно. Тормоза тормозят. Руль крутится. Вары горят. Бибикалка бибикает.

2

Приобрёл в 2005-м г. Сначала планировал перепродать, но вскоре передумал

96 коментариев

Надежен,устойчив в управлении,всегда чист и спереди и сзади.

41 комментарий

Это была любимая машина . Если машины купленные после неё не давали заглядывать в них месяцами, то эта нуждалась в ремонте еженедельно . В ней не было пезпроблемного места , в ней ломалось все . Была…

14 комментария

Это мой первый автомобиль, куплен через месяц после получения прав в сентябре 2012 года. Купил за 37 тыс., но как выяснилось позже, с убитым двигателем. Поставил на зиму на прикол машину и весной 2013…

63 комментария

Оптимальная машина, во всем…, для городской и сельской эксплуатации.Отличный автомобиль для того у кого руки растут из нужного места

2

Русское бревно. Трудно сломать — легко чинить.

13 комментария

Машина очень надежная ,вместительная,экономичная,не прихотливая.Не дорога в обслуживании.И Общая цена очень даже приемливая,

12 комментария

Каким был настоящий «Москвич-2141» — найден экземпляр 1990 года в идеальном состоянии

Этот автомобиль в конце 1980-х был круче «Волги» и всех «жигулей» со «спутниками»! Автор YouTube-канала Roma Urraco нашел «Москвич» АЗЛК-21412-01 с минимальным пробегом 1996 км и в идеальном состоянии.

Как рассказал Roma Urraco, этот автомобиль был найден в украинском Никополе. По словам прежних владельцев, данная машина принадлежала директору крупного местного промышленного предприятия. «Москвич» был пригнан непосредственно из Москвы в 1990 году и практически не эксплуатировался — владелец в основном пользовался служебными машинами.

До 2014 года автомобиль стоял в гараже безвыездно, лишь последние несколько лет иногда выезжал в хорошую погоду. Гараж был сухим, поэтому кузов вишневого цвета отлично сохранился. Новые владельцы поначалу собирались использовать автомобиль ежедневно, но потом, осознав ценность экземпляра, от этой идеи отказались и решили сделать из него коллекционную машину.

Массовое производство передового (по меркам советского автопрома) 5-местного хэтчбека «Москвич-2141» началось в 1987 году, хотя первая промышленная партия была выпущена в конце 1986-го. Первые годы продаж 41-й (он также носил имя «Алеко») считался очень престижным автомобилем в СССР. По совокупности потребительских характеристик и эргономике эта модель АЗЛК превосходила не только более компактные и тесные ВАЗы, но и ГАЗ-2410 «Волга» — предел мечтаний советского человека (впрочем, рядовому обывателю совершенно недоступный).

Также считается, что «Москвич-2141» имел наиболее высокий уровень пассивной безопасности из всех разработанных в СССР массовых моделей и даже в середине 1990-х был вполне сравним в этом отношении с моделями иностранного производства.

Начали выпускать «Алеко» с двумя типами моторов: модификацию 2141 — с 76-сильным двигателем ВАЗ-2106-70; модификацию 21412 — с 72-сильным двигателем УЗАМ-331.10 уфимского производства (усовершенствованный 412-й мотор).

Поначалу «Москвич-2141» соответствовал всем ожиданиям — качество сборки и надежность автомобиля были на высоте. Найденный экземпляр, выпущенный в 1990 году, лучшее тому подтверждение — машина сохранилась в идеальном состоянии. Но после развала Советского Союза низкое качество сборки и комплектующих, а также плохое качество подготовки металла, антикоррозийной обработки и покраски фактически сгубило «Алеко». Бывали случаи, когда новые, только из салона, 41-е сгнивали чуть ли не за первый год активной эксплуатации. В результате спрос на «москвичи» начал падать, и в конце концов завод обанкротился и закрылся.

Найденный экземпляр — это модификация 21412-01. Правда, в отгрузочном ярлыке, который шел с автомобилем с завода и который чудесным образом сохранился, подчеркнуто другое — АЗЛК-2141-01. Но VIN на кузове (XTB214120L0150597) и заводские таблички говорят о том, что это все же модификация 21412-01. Да и уфимский «движок» в моторном отсеке это подтверждает.

Модификация 21412-01 является первой модернизацией «Алеко». Такие автомобили стали сходить с конвейера к концу 1989 года. Усовершенствования коснулись кузова, двигателя, сцепления, привода ведущих колес, подвески. Появился новый аккумулятор, изготовленный из более легких современных материалов, а также новый радиатор с пластмассовыми бачками вместо латунных. Боковые и заднее стекла стали более тонкими. Все это позволило несколько облегчить машину.

В интерьере появились модернизированные сиденья с новой моющейся обивкой. Ткань обивки могла пропускать воздух и была очень прочной.

Отличить модернизированный вариант можно было по внешним деталям: добавилось второе наружное зеркало на правой двери; за всеми четырьмя колесами появились брызговики.

Audi 80 второго поколения против ВАЗ-2109 и АЗЛК-2141. Машины одного уровня? — Авторевю

Алеко, Спутник? Не прижились у нас экспортные имена первых советских переднеприводников. Пятидверный ­ВАЗ-­2109 окрестили «девяткой», а Москвич звался Азлык — АЗЛК-2141, Автозавод имени Ленинского комсомола.

В те годы сравнительных тестов в прессе не было, а уж с иномарками… И только теперь, три десятка лет спустя, мы не просто свели вместе Москвич и «девятку», но и выставили против них исправный седан Audi 80 второго поколения.

Первую партию «девяток» на ВАЗе выпустили в 1987 году, наш автомобиль как раз из ранних. Коричневый интерьер, мотор 1.3, четырехступенчатая «механика»… До сих пор помню, как смотрелась на «низкой панели» папина магнитола Sharp ­GF-7500. А сколько на длиннющей полке справа от панели приборов умещалось бутылок пива!

Удачный дизайн, неплохие по меркам СССР материалы и хорошая печка. Обратите внимание, сколько здесь света: крупное лобовое и боковые стекла, ажурные стойки

Панель приборов с антибликовым вогнутым стеклом еще с ранними­ оранжевыми­ стрелками. Уровень топлива­ менялся в зависимости от ­направления поворота. Вместо крупной лампы Stop можно было поставить кооперативный цифровой тахометр

Водительское сиденье низкое и мягкое, рычаг переключения передач короткий, его ходы бесконечны, а четкость на троечку. Тогда еще никто не знал, что это растянется как минимум на тридцать лет. Ведь даже у Вес­ты механизм переключения хуже, чем у Жигулей.

• Об угол центральной консоли крупные люди набивали синяки. У вентилятора отопителя три скорости, каждый из дефлекторов можно регулировать и перекрывать. На полочку внизу отлично умещались аудиокассеты
• Передачи в «девятке» переключаются хуже, чем у Жигулей, но не ужасно — в отличие от «десяток» и Приор
• Продольная регулировка меняет еще и высоту мягкого сиденья: чем дальше отодвинешься, тем ниже окажешься. Многие жаловались на ощутимую через наполнитель поперечину над поясницей, но на этой машине она не чувствуется. Пластиковая шестеренка регулировки угла наклона спинки быстро начинала проворачиваться

А сзади в «девятке» тесно. Странно, почему я не чувствовал этого в те годы? Время с подругами на мягком диване летело так незаметно…

Из скольких дорожных передряг­ «девятки» вытаскивали своих­ ­водителей благодаря хорошей управляемости — не сосчитать

На заднем сиденье Москвича куда вольготнее — недаром «сорок первые», наряду с Волгами, работали в такси. Высокий потолок, невиданная ранее роскошь в виде едва заметного центрального тоннеля. А багажник почти на треть крупнее вазовского — но открывается только ключом. Чтобы при этом не глушить мотор, прямо с завода связку скрепляли быстросъемным пластиковым карабином.

Кузов Москвича зализан, но наша собственная продувка в аэродинамической трубе (АР №9, 1998) показала, что реальный коэффициент лобового сопротивления Сx составляет не заявленные заводом 0,35, а 0,47, — даже чуть больше, чем у «девятки»

Основательные передние кресла, крупные и сильно разнесенные педали, которые можно легко нажимать даже в валенках… Сибирский размах! Печка у Москвича, кстати, была не хуже вазовской. А по аэродинамической проработке это лучшая машина в СССР — заднее стекло всегда оставалось чистым (причем без дворника!), да и к боковинам грязь почти не липла. «Девятка» же, напротив, оказалась грязнулей.

Архитектура передней панели Москвича практически повторяет «девяточную», а подрулевые рычажки у них и вовсе одинаковые. Но качество сопряжения деталей удручает

Но собран москвичовский интерьер отвратительно. Качество пластмассы как у одноразовой посуды, в местах сопряжения не зазоры, а настоящие дыры… И все это грохочет и трясется на ходу.

Под огромным козырьком полноценная панель приборов с тахометром, спидометром и массой дополнительных указателей

Вообще, найти сейчас хороший «сорок первый» чуть ли не сложнее, чем куда более древний «четыреста восьмой»: АЗЛК-2141 гнил с пугающей скоростью! Уфимские полуторалитровые моторы гнали масло, ходовая стучала и разваливалась — даже тестовый ухоженный автомобиль 1989 года выпуска с пробегом всего 40 тысяч километров ощущается пожилым. На стыках брякают опоры передней подвески, с характерным звоном детонирует на разгоне 72-сильный УЗАМ. Будто общаешься с обреченным человеком.

Полная версия доступна только подписчикамПодпишитесь прямо сейчас

я уже подписан

Лучшие советские автомобили, которые уважают во всем мире Фото и обзор!

Байс российского автопрома

 

Ну хоть русских медведей подальше от леса и смотреть футбол. Поздравляем, чемпионат мира открыт! Напомним, чемпионат проходит в России с 14 июня по 15 июля. Надеюсь, что гости остановят свой интерес не только к футболу, но и познакомятся с нашей интересной и невероятной культурой.В том числе и наши легендарные автомобили, которых хоть и было немного, но тем не менее, многие отечественные модели автомобилей, несмотря на железный занавес, стали достаточно популярными во многих странах. И что самое интересное, многие старые русские автомобили до сих пор хорошо известны во всем мире.

 

Итак, чтобы отпраздновать крупнейшее в мире событие – 21-й чемпионат мира по футболу, мы хотим показать миру не только открытую и дружелюбную Россию, но и нашу не менее интересную автомобильную историю. Мы собрали самые лучшие и знаковые автомобили в истории советского и российского автомобилестроения.

 

ГАЗ-13 «Чайка»

 

Наша коллекция российских автомобилей начинается с крупнейшего автотриумфа нашей страны времен СССР. Начнем с легендарного автомобиля «Чайка», который выпускался под обозначением ГАЗ-13. Это флагманский советский автомобиль класса люкс, на котором до 1989 года ездило политическое руководство нашей страны. Его без преувеличения можно назвать роскошным во всех смыслах.

 

ГАЗ-13 «Чайка» выпускался в различных модификациях кузовов, в том числе седан и кабриолет.На внутреннем рынке эта модель не была доступна для покупки, в отличие от некоторых западных стран.

Помимо политической элиты «Чайки» состояли в органах КГБ (высшая служба безопасности СССР до 1991 года). В том числе на «Чайке» возили советских послов в ГДР, Северной Корее, Болгарии, Венгрии, Монголии и Финляндии.

 

Кстати, Фидель Кастро получил от Генерального секретаря Коммунистической партии Советского Союза Никиты Хрущева в подарок ГАЗ-13.

«Чайка» (ГАЗ-13) выпускалась на заводе ГАЗ в Горьком (ныне Нижний Новгород) и на Рижском автобусном заводе в Риге (Латвия) в период с 1959 по 1981 год. За это время было выпущено 3 179 автомобилей. . Большинство из них семиместные четырехдверные седаны. Самые редкие экземпляры имеют кузов кабриолет. Еще более редкими были специальные ГАЗ-13, созданные как машины скорой помощи.

 

ГАЗ-24 «Волга»

 

Разумеется, после «Чайки» мы решили включить в наш рейтинг «Волгу», которая выпускалась под обозначением ГАЗ-24.Впервые он был представлен на Лондонском автосалоне в 1970 году. Это еще один российский автомобиль, который мгновенно стал узнаваем во всем мире. Как и «Чайка», «Волга» продавалась во многих странах за пределами СССР. И в том числе страны Западной Европы, Латинской Америки и Индонезии.

 

15 июля 1970 года началось серийное производство ГАЗ-24 «Волга». Помимо Украины, эту модель также собиралась выпускать в Бельгии компания Scaldia. До середины 1980-х годов он был доступен для продажи во многих странах Европы с дизельным двигателем.

К сожалению, большую часть времени на отечественном рынке эта машина была недоступна для широких масс. В то же время «Волга» была самой популярной машиной в нашей стране и в ГДР.

Использование ГАЗ-24 в качестве такси было экономически выгодно, так как эта модель считалась не только надежной. Ведь самое главное это ремонтопригодность и стоимость обслуживания. Например, ГАЗ-24 для использования в такси эта машина подходила идеально.

 

Лада 2104/2105/2107

 

Третье место по популярности наших автомобилей в мире, безусловно, занимает еще один наш легендарный Автомагазин.Речь идет об автомобилях Lada, которые выпускались под обозначением ВАЗ-2104, ВАЗ-2105 и ВАЗ-2107.

Эти модели стали известны во многих странах благодаря прямому экспорту новых автомобилей Lada. Однако в некоторых странах эти автомобили продавались с немного другими названиями. Например, в Великобритании эти автомобили стали называть Lada Riva. В Европе отечественная классика продается под обозначением Lada Nova.

 

Кстати, это модельное семейство является одним из самых популярных не только в нашей стране (в том числе и сегодня), но и в Канаде, Эквадоре, Франции, Германии, Великобритании, Кубе и многих других странах.

 

Напомним, что создание бренда Lada началось в 1966 году, когда компания «АВТОВАЗ» под руководством правительства подписала соглашение с Коммунистической партией Италии о совместной разработке нового советского автомобиля для широких масс. В итоге за несколько лет компания «АВТОВАЗ» разработала ВАЗ-2101 на базе классического итальянского Fiat 124.

Первые шесть предсерийных автомобилей ВАЗ-2101 были собраны 19 апреля 1970 года, а в августе того же года началось их серийное производство.Подробнее о разработке «Копейки» вы можете прочитать в нашей статье «Как Фиат превратился в Жигули».

 

Но Советский Союз на этом не остановился и в последующие годы продолжил совершенствовать итальянские клоны, выпустив ВАЗ-2102, ВАЗ-2103.

В 1979 году на АВТОВАЗе выпускалась модель ВАЗ-2105. Эта модель Lada выпускалась самый продолжительный период с 1979 по 2010 год. То есть модель находилась в производстве 31 год.

Затем, в 1982 году, завод начал выпускать модифицированную версию ВАЗ-2105.Речь идет о модели ВАЗ-2107, которая выпускалась с 1982 по 2012 год.

Не менее популярным был и универсал, разработанный на базе ВАЗ-2105 и ВАЗ-2107. Автомобиль выпускался с 1984 по 2012 год. Примечательно, что параллельно с производством универсала «четверка» АВТОВАЗ выпускал универсал ВАЗ-2102 (с 1971 по 1985 год). То есть с 1984 по 1985 год Тольяттинский завод выпускал в серийное производство два универсала разных поколений.

 

ВАЗ-2104, ВАЗ-2105 и ВАЗ-2107 продавались на Западе вплоть до распада СССР.После распада Союза эти модели помимо внутреннего рынка России продавались на Украине, в Египте и в Казахстане.

Кстати, некоторые экземпляры «Жигулей» выпускались для силовых структур. В том числе и для КГБ. Эти автомобили были оснащены мощным роторным двигателем Ванкеля мощностью 150 л.с.

 

УАЗ-469

 

Это один из самых мощных внедорожников в русском мире советской эпохи. УАЗ-469 разрабатывался как замена армейскому ГАЗ-69, который в советские годы использовался не только российской армией, но и многими военными стран Восточного блока.

Внедорожник

УАЗ-469 был представлен в 1972 году. В Германии эта машина известна как Baijah Automotive, она продавалась в этой стране с 2003 по 2007 год.

 

Также этот автомобиль продавался на Кубе, в Азербайджане, Вьетнаме, Украине и даже в США (1997-2005 гг.).

Но что самое удивительное, на самом деле компания УАЗ (Ульяновский автомобильный завод) до сих пор выпускает старый внедорожник. Речь идет о недавно модернизированной версии, которая по кодовому обозначению УАЗ-469 носит имя «Охотник».

В отличие от большинства современных внедорожников и кроссоверов УАЗ в базовой комплектации имеет невероятно высокий дорожный просвет, который составляет 210 мм. Благодаря своему клиренсу, полноприводный УАЗ Хантер является одним из королей внедорожья, куда складывают популярные внедорожники, такие как Ленд Крузер, Патрол и даже Мерседес G-класса. Не верите? Посмотрите на ютубе заезды по бездорожью и соревнования для членов клуба, где зачастую победителем оказывается тот самый охотник, и вы уже не будете сомневаться в том, что российский внедорожник, несмотря на преклонный возраст, все же способен покорить любое место, где нет асфальта .

 

ЗИЛ-4102

 

ЗИЛ-4102 был разработан как преемник ЗИЛ-41047, который перевозил первых лиц СССР, а также неоднократно использовался для перевозки высокопоставленных лиц нашей страны.

К сожалению, ЗИЛ-4102 так и не был запущен в производство, так как Михаил Горбачев (бывший советский лидер) не был впечатлен этой машиной. То есть его просто не любили. В итоге проект закрыли, несмотря на то, что на его разработку были потрачены огромные средства.

 

Первый прототип ЗИЛ-4102 был выпущен в 1987 году. Две машины были созданы в 1989 и конце 1990 годов соответственно. С тех пор было выпущено не более одного экземпляра.

К сожалению, у нас нет официальной информации о двигателях этой модели. Но, по многим данным, скорее всего, автозавод ЗИЛ планировал на модели 4102 использовать три варианта силовых агрегатов: бензиновый 4,5 л V6, бензиновый 6,0 л V8 и огромный 7,0-литровый дизель V8. Также на этот автомобиль были рассчитаны 5-ступенчатая механическая и 4-ступенчатая автоматическая коробки передач, которые должны были передавать на ЗИЛ-4102 крутящий момент на передние колеса.

 

Учитывая качество и скученность в те годы советского автопрома, ЗИЛ-4102 должен был стать настоящим шедевром отечественного авторынка с технической стороны. Более того, эта машина все еще выглядела фантастически. Вы не поверите, у ЗИЛ-4102 в конструкции кузова даже использованы детали из углепластика (!).

 

Москвич АЗЛК-2141 Алеко

 

Москвич 2141 — новейшая разработка автомобильного завода «Москвич», который после распада СССР был приватизирован и перешел из-под контроля государства в частную собственность в 1991 году.Но, увы, в 2006 году завод был расформирован.

Автомобиль АЗЛК-2141 также известный как АЛЕКО (ALEKO). Именно от этой латинской аббревиатуры Москвич-2141 и поставляется на зарубежные рынки.

Производство АЗЛК-2141 началось в 1986 году. Эта машина была разработана на базе франко-американской модели Simca 1308. Подробнее о том, как создавался Москвич-2141, вы можете прочитать в нашей статье здесь. Из статьи вы узнаете, что Москвич-2141 был разработан на базе автомобиля, который в 1976 году стал Автомобилем года в Европе.

 

Первая серия АЗЛК-2141 выпускалась до 1997 года. Затем модель сменили модернизированные версии. Последний автомобиль сошел с конвейера в 2013 году.

Москвич 2141 — семейный среднеразмерный автомобиль с пятидверным хэтчбеком и передним приводом. На протяжении всего периода производства автомобиль предлагался с разными двигателями, в том числе с 1,5-литровым, 1,6-литровым, 1,7-литровым и 1,8-литровым бензиновым двигателем. Также в некоторых модификациях АЗЛК-2141 устанавливался 1.9-литровые дизельные двигатели Peugeot.

 

ГАЗ-69

 

ГАЗ-69 заменил ГАЗ-67Б. Целью обновления было снижение расхода топлива и улучшение внедорожных возможностей автомобиля. Разработка модели началась в 1946 году, а уже через год появился первый прототип. Производство ГАЗ-69 было запущено 25 августа 1953 года в Горках на заводе ГАЗ.

К концу 1972 года было выпущено более 600 000 автомобилей.

 

ГАЗ-69 был в основном армейским автомобилем.Но его могли себе позволить купить и гражданские лица. Внедорожник имеет характерный рельефный прочный несокрушимый кузов с удивительными углами свесов. Автомобиль был оснащен 2,1-литровым двигателем на базе двигателя, устанавливаемого на седан ГАЗ-М20 «Победа». Мало кто знает, но двигатель «Победы» разрабатывался на базе мотора Доджа 1935 года выпуска. Наша страна купила чертежи этого двигателя всего за 20 000 долларов.

 

Лада Тарзан

 

Что за Жигули? Это модель «Тарзан» — промежуточная модель, созданная в развитие полноприводной Lada Samara.То есть это транспортное средство создавалось между стадиями разработки прототипа и полномасштабной серийной версии (так называемая предсерийная версия малого объема).

Lada Tarzan — компактный полноприводный автомобиль с независимой подвеской обеих колесных осей. Очень интересная концепция. Но, по сути, перед нами компактный кроссовер и внедорожник, которые сегодня бьют все рекорды популярности во всем мире.

Кстати, Лада Тарзан создана уже после развала СССР и падения железного занавеса.

Но, несмотря на это, эту модель можно назвать советской, поскольку в Lada Tarzan использовались технологии автомобилей серии Lada Samara (ВАЗ-2108, ВАЗ-2109). Лада Тарзан выпускалась с 1997 по 2003 год. Всего было выпущено 300 автомобилей.

 

Москвич 402/403/407

 

Основа марки «Москвич» взята из Германии. А точнее, автомобиль «Москвич» тесно связан с маркой Opel. Первые модели «Москвича» были созданы на базе Opel 1946 года.Так родился легендарный Москвич 400-й серии.

Например, в 1956 году на рынок вышел Москвич-402. В 1958 году на рынок была снята модель 407 с 45-сильным двигателем. В 1962 году Москвич-407 стал Москвич-403.

 

Лада-2103 Порше

 

А вы знали, что в истории АВТОВАЗа есть интересный совместный проект с Porsche? В 1970 году председатель правления Porsche Эрнст Фурманн встретился с нашим министром промышленности Виктором Поляковым.Во время их встречи было согласовано трехлетнее сотрудничество на сумму полмиллиона немецких марок. Это соглашение предусматривало разработку компанией Porsche дизайна будущих новых отечественных автомобилей.

 

Первым и, как оказалось, неудачным результатом этого партнерства стала модель Lada-2103 Porsche. В рамках сотрудничества компания Porsche пересмотрела дизайн ВАЗ-2103, сохранив, однако, все основные узнаваемые черты. То есть форма и линии кузова остаются прежними.А вот Порше, чтобы изменить внешний вид автомобиля, использовал бамперы и новую решетку радиатора.

 

В том числе в модели Лада-2103 компания Porsche решила отказаться от всех хромированных деталей экстерьера (за исключением колпаков и дверных ручек).

Porsche также переработал шасси и полностью переработал интерьер «трешки ВАЗ». В итоге ВАЗ-2103 получил руль от Porsche 928 и кожаный салон.

 

К сожалению, Президент отказался от такой машины.Причина в том, что завод в те годы работал над собственной реконструкцией автомобиля ВАЗ-2103, дебютировавшего через два месяца как модель ВАЗ-2106.

Лаура

 

Неизвестная многим эта модель, получившая название «Луара», так и не дошла до серийного производства. Это прототип спортивного автомобиля, который появился на свет в 1980 году. Но проект был завершен в 1982 году.

К сожалению, подробной информации об этой удивительной машине почти нет. Известно, что этот спорткар может разогнаться до 170 км/ч.

Но самое интересное, что «Лауру» разработал не какой-то крупный отечественный автомобильный завод, а два энтузиаста — Дмитрий Парфенов и Геннадий Хино. Они создали настоящий спортивный автомобиль, который в те годы был инновационным и не имел ничего общего с автомобилями российских производителей.

 

По некоторым данным, даже глава государства Михаил Горбачев высоко оценил этот амбициозный проект. Однако до серийного производства Лаура так и не дошла. Макс, то, что сделали создатели, так это продвижение автомобиля на международных выставках.Но это не конец истории.

Когда тандем Дмитрия Парфенова и Геннадия Хайно распался, один из прототипов был продан Русскому музею, а другой разобран. Некоторые его части были использованы в начале 1990-х годов для создания прототипа в рамках проекта Лаура-2.

Этот автомобиль был оснащен двигателем мощностью 240 л.с. от Audi.

 

ЛуАЗ-969

 

ЛуАЗ-969 — полноприводный автомобиль украинского автомобильного завода ЗАЗ (известный как «Казак»), который был разработан в СССР в середине 1960-х годов.В 1971 году началось производство Луизы-969. Первые прототипы появились в 1965 году.

Внешне ЛуАЗ-969 выглядит странно и непропорционально. Но этот автомобиль создавался не для красоты, а для бездорожья. Автомобиль имеет очень компактные размеры. Но несмотря на это, дорожный просвет этого внедорожника составляет 28 дюймов. Это больше, чем у первых поколений американского Jeep Wrangler.

 

Тем не менее, это была ужасная машина, когда вы оставили ее на дороге. ЛуАЗ-969 отличался неповоротливостью, крутизной и плохой управляемостью.Но хуже всего то, что он был небезопасен. Например, в случае аварии людей часто просто выбрасывает из салона. Также у машины были проблемы с выхлопной системой. Так, в некоторых автомобилях угарный газ через систему вентиляции попадал в салон, в результате чего многие люди отравились угарным газом.

 

ЗИС-101 Спорт

 

Это наверное самый красивый русский автомобиль советского времени. У него, пожалуй, лучший дизайн за всю историю российского автомобилестроения.

Автомобиль создан на базе симпатичного седана ЗИС-101, который выпускался с 1936 по 1941 год.

К сожалению, родстер с двигателем V8 ЗИС-101 Спорт выходил всего в нескольких экземплярах. А потом как прототипы.

Этот спортивный автомобиль был довольно большим. Блин! Это было огромно! Его длина составляла 5,75 м, ширина — 1,89 м, а колесная база — 3,60 м.

 

Спортивный автомобиль создан к 20-летию ВЛКСМ (молодежной политической организации СССР).Проект был одобрен лично Сталиным, но сразу же от него отказались после празднования юбилея молодежной организации.

 

Лада-1101 (ВАЗ-Э1101)

 

Был в истории российского автомобилестроения еще один интересный проект – Lada-1101. Но и эта машина так и не дошла до серийного производства. Эта модель существовала в нескольких модификациях. У нас нет информации, сколько прототипов было выпущено. Но скорее всего, было создано не более 5 экземпляров.

Все началось в начале 1970-х годов, когда компания АВТОВАЗ решила разработать совершенно новый автомобиль для внутреннего рынка и для стран Западной Европы на экспорт.

 

В короткие сроки АВТОВАЗ разработал первый прототип, получивший обозначение ВАЗ-1101 и прозвище «Чебурашка». Изначально машина была двухдверной. Он также перенял несколько компонентов от других автомобилей Lada, которые в те годы уже были в серийном производстве. Так, автомобиль получил от первых моделей Лады руль, переднюю и заднюю оптику.

ВАЗ-1101 был переднеприводным и оснащался двигателем от Fiat 127.

 

В 1973 году завершилась разработка второго прототипа ВАЗ-1101 в совершенно другой модификации и компоновке. Новая машина отличалась значительно более изысканным дизайном.

Для тех, кто не в курсе, вдруг узнаю, что хоть этот автомобиль и пошел в серию, благодаря ему, рожденному в последующие годы появилась серия автомобилей Лада Самара (ВАЗ-2108, ВАЗ-2109 и ВАЗ-21099 ).Однако это произошло только через десять лет. Подробнее об этом интересном автомобиле и его истории можно прочитать в статье «Лучший российский автомобиль, о котором вы никогда не слышали».

 

ЗИЛ-112 Спорт

 

После таких роскошных автомобилей, как ЗИЛ-117 и ЗИЛ-4102, эта модель занимает третье место по значимости, красоте и т. д. ЗИЛ-112 Спорт — спортивный автомобиль, который разрабатывался и производился с 1961 по 1967 год. пять всесоюзных рекордов в различных гонках.

Автомобиль спроектирован и построен заводом имени Лихачева (автозавод ЗИЛ).

Спорткар

оснащается двумя типами восьмицилиндровых двигателей (в зависимости от версии). Один имел объем 6,0 литров и выходную мощность 230 л.с., а другой имел объем 7,0 литров и мощность 270 л.с.

 

Также ЗИЛ-112 оснащался регулируемым дифференциалом, дисковыми тормозами на всех четырех колесах и радиальными шинами. Также из-за простоты конструкции вес ЗИЛ-112 составлял всего 1330 килограммов.

В 1962 году благодаря новому аэродинамическому обвесу ЗИЛ 112 Спорт, способный разгоняться до 230 км/ч, совершил пробег по соленому озеру Баскунчак.

 

Но что удивительно, для 112 ЗИЛ это не предел. Как оказалось, еще большему разгону тогда помешали плохие погодные условия. В конце концов, возможности этого российского суперкара были ограничены.

Всего было построено два экземпляра. После последней гонки оба экземпляра остались в стенах завода ЗИЛ. Сегодня одна машина находится в музее в Риге (Латвия), а другая принадлежит частному коллекционеру из Швеции.

Условия образования и кристаллизации протерозойского лейкогранита Харни-Пик, Блэк-Хиллз, Южная Дакота, США: петрологические и геохимические ограничения кислые магмы. Дж Геол 93: 271–291

Google Scholar

  • Брайан В.Б., Фингер Л.В., Чейес Ф. (1969) Оценка пропорций в петрографических уравнениях смешения методом наименьших квадратов.Наука 163:926–927

    Google Scholar

  • Burnham CW, Nekvasil H (1986) Равновесные свойства гранитных пегматитовых магм. Ам Минерал 71:239–263

    Google Scholar

  • Черни П., Мейнцер Р.Е. (1988) Плодородные граниты в архейских и протерозойских полях редкоэлементных пегматитов: коровая среда, геохимия и петрогенетические взаимосвязи. В: Тейлор Р.П., Стронг Д.Ф. (ред.) Последние достижения в геологии месторождений полезных ископаемых, связанных с гранитом.Can Inst Min Metall Spec Publ 39, стр. 170–206

  • ДеВитт Э., Редден Дж. А., Уилсон А. Б., Бушер Д. (1986) Потенциал минеральных ресурсов и геология национального леса Блэк-Хиллз, Южная Дакота и Вайоминг. US Geol Surv Bull 1580

  • Duke EF, Redden JA, Papike JJ (1988) Слоистый гранит-пегматитовый комплекс Calamity Peak, Блэк-Хиллз, Южная Дакота; часть I: структура и размещение. Геол Сок Ам Булл 100: 825–840

    Google Scholar

  • Duke EF, Shearer CK, Redden JA, Papike JJ (1990) Протерозойский гранит-пегматитовый магматизм, Блэк-Хиллз, Южная Дакота: структура и геохимическое зонирование.В: Lewry JF, Stauffer MR (eds) Trans-Hudson Orogen. Geol Assoc Can Spec Pap 37:253–269

  • Duke EF, Papike JJ, Laul JC (1991) Геохимия богатого бором перглиноземистого гранитного массива: слоистый гранитно-пегматитовый комплекс Calamity Peak, Блэк-Хиллз, Южная Дакота. Can Mineral (в печати)

  • Forbes WC, Flower MFJ (1974) Фазовые отношения титан-флогопит, K 2 Mg 4 TiAl 2 Si 6 O 3 : тугоплавкая фаза в верхней мантии? Earth Planet Sci Lett 22:60–66

    Google Scholar

  • France-Lanord C, Le Fort P (1988) Плавление земной коры и генезис гранита во время коллизионного горообразования в Гималаях.Trans R Soc Эдинбург 79: 183–195

    Google Scholar

  • France-Lanord C, Sheppard SMF, Le Fort P (1988) Вариации изотопов водорода и кислорода в высокоглиноземистом лейкограните Манаслу в Высоких Гималаях: свидетельство гетерогенного осадочного источника. Геохим Космохим Акта 52:513–526

    Google Scholar

  • Gwinn R, Hess PC (1989) Свойства растворов железа и титана в перглиноземистых и перщелочных риолитовых жидкостях.Contrib Mineral Petrol 101:326–338

    Google Scholar

  • Ханна А.Г., Брюггер Р.М., Гласкок М.Д. (1981) Установка для анализа активации мгновенных гамма-нейтронов в MURR. Методы Nucl Instrum 188:619

    Google Scholar

  • Хэнсон Г.Н. (1978) Применение микроэлементов к петрогенезу магматических пород гранитного состава. Earth Planet Sci Lett 38:26–43

    Google Scholar

  • Harder H (1974) Бор.В: Wedepohl KH (ed) Handbook of geochemistry 5, BO. Springer Нью-Йорк Берлин Гейдельберг

    Google Scholar

  • Хелмс Т.С., Лаботка Т.С. (1991a) Петрогенез карликовых протерозойских пелитовых сланцев южной части Блэк-Хиллз, Южная Дакота: ограничение регионального метаморфизма при низких давлениях. Геол Сок Ам Булл 103: 1324–1334

    Google Scholar

  • Хелмс Т.С., Лаботка Т.С. (1991b) Тектотермальная история раннепротерозойских пелитовых сланцев Блэк-Хилс, С.D. J Metamorphic Petrol (в печати)

  • Хольц Ф., Йоханнес В. (1991) Генезис перглиноземистых гранитов; I: Экспериментальное исследование составов расплавов от 3 и 5 до 6 и различной активности H 2 O. J Бензин 32:935–958

    Google Scholar

  • Holtz F, Johannes W, Pichavant M (1991a) Влияние избытка алюминия на фазовые отношения в системе Qz-Ab-Or: экспериментальное исследование при 2 кбар и пониженной активности H 2 O.Eur J Mineral (в обзоре)

  • Holtz F, Pichavant M, Barbey P, Johannes W (1991b) Влияние H 2 O на ликвидусные фазовые отношения в гаплогранитной системе при 2 и 5 кбар (в обзоре)

  • Jahns RH, Burnham CW (1969) Экспериментальные исследования генезиса пегматитов; I: модель образования и кристаллизации гранитных пегматитов. Экон Геол 64:843–864

    Google Scholar

  • Jahns RH, Tuttle OF (1963) Слоистые пегматит-аплитовые интрузии.Min Soc Am Spec Pap 1:78–92

    Google Scholar

  • Javoy M, Foucard S, Allegre CJ (1970) Графический метод исследования фракций 18 O/ 16 O в силикатных породах. Earth Planet Sci Lett 1:12–16

    Google Scholar

  • Джоллифф Б.Л., Папике Дж.Дж., Ширер К.К. (1986) Турмалин как регистратор эволюции пегматита, пегматит Боба Ингерсолла, Блэк-Хиллз, Южная Дакота.Ам Минерал 71:472–500

    Google Scholar

  • Купфер Д.Х. (1963) Геология района Пика Бедствия, округ Кастер, Южная Дакота. US Geol Surv Bull 1142-E:1–23

    Google Scholar

  • Ле Бретон Н., Томпсон А.Б. (1988) Плавление биотита в отсутствие флюида (дегидратация) в метапелитах на ранних стадиях анатексиса земной коры. Contrib Mineral Petrol 99:226–237

    Google Scholar

  • Ле Форт П., Куни М., Дениэль С., Франс-Ланорд С., Шеппард С.М.Ф., Упрети Б.Н., Видаль П. (1987) Коровая генерация гималайских лейкогранитов.Тектонофизика 134:39–57

    Google Scholar

  • Le Maitre RW (1982) Численная петрология. Эльзевир, Амстердам, Лондон, Д. (1986) Магматико-гидротермальный переход в редкоэлементном пегматите Танко: данные полевых включений и эксперименты по фазовому равновесию. Ам Минерал 71:376–395

    Google Scholar

  • Luth WC, Jahns RH Tuttle OF (1964) Гранитная система при давлении от 4 до 10 килобар.J Geophys Res 69: 759–773

    Google Scholar

  • Manning DAC (1981) Влияние фтора на ликвидусные фазовые отношения в системе Qz-Ab-Or с избытком воды при 1 кбар. Contrib Mineral Petrol 76:206–215

    Google Scholar

  • Michael PJ (1984) Химическая дифференциация гранита Cordillera Paine (юг Чили) путем фракционной кристаллизации in situ.Contrib Mineral Petrol 87:179–195

    Google Scholar

  • Миллер К.Ф. (1985) Являются ли сильно перглиноземистые магмы образованными из пелитовых осадочных источников? Дж Геол 93: 673–689

    Google Scholar

  • Миллер К.Ф., Стоддарт Э.Ф. (1981) Роль марганца в парагенезисе магматического граната: пример из хребта Старая Женщина-Пьюте, Калифорния. Дж Геол 89: 233–246

    Google Scholar

  • Munoz JL (1984) Обмен F-OH и Cl-OH в слюдах применительно к гидротермальным рудным месторождениям.В: Bailey WS (ed) Микас. Rev. Mineral 13:469–494

  • Munoz JL, Ludington SD (1977) Фторид-гидроксильный обмен в синтетическом мусковите и его применение в комплексах мусковит-биотит. Ам Минерал 62:304–308

    Google Scholar

  • Набелек П.И., Расс-Набелек С. (1990) Роль фтора в петрогенезе магматических выделений в вулкано-плутоническом террейне Сент-Франсуа, юго-восток Миссури. В: Штейн Х.Дж., Ханна Дж.Л. (ред.) Рудоносные гранитные системы, процессы петрогенеза и минерализации.Geol Soc Am Spec Pap 246:71–87

  • Набелек П.И., Денисон Дж.Р., Гласкок М.Д. (1990) Поведение бора во время контактного метаморфизма известково-силикатных пород на Нотч-Пик, Юта. Ам Минерал 75:874–880

    Google Scholar

  • Набелек П.И., Расс-Набелек С., Хеусслер Г.Т. (1992) Стабильные изотопы, подтверждающие петрогенезис и эволюцию флюидов в перглиноземистых лейкогранитах гранита Харни-Пик, Блэк-Хиллз, Южная Дакота.Геохим Космохим Акта (в печати).

  • Norton JJ, Redden JA (1990) Связь зональных пегматитов с другими пегматитами, гранитами и метаморфическими породами в южной части Блэк-Хиллз, Южная Дакота. Ам Минерал 75:631–655

    Google Scholar

  • Пичаван М. (1981) Экспериментальное исследование воздействия бора на водонасыщенный гаплогранит при давлении 1 кбар: геологические приложения. Contrib Mineral Petrol 76:430–439

    Google Scholar

  • Pichavant M (1987) Влияние B и H 2 O на фазовые отношения ликвидуса в гаплогранитной системе при 1 кбар.Ам Минерал 72:1056–1070

    Google Scholar

  • Pichavant M, Manning DAC (1984) Петрогенез турмалиновых гранитов и топазовых гранитов вклад экспериментальных данных. Физ Земля Планета Интер 35:31–50

    Google Scholar

  • Пичавант М., Контак Д.Дж., Эррера Дж.В., Кларк А.Х. (1988) Миоцен-плиоценовые вулканиты Макусани, ЮВ Перу I: минералогия и магматическая эволюция двухслюдяной алюмосиликатной игнимбритовой свиты.Contrib Mineral Petrol 100:300–324

    Google Scholar

  • Редден Дж.А., Нортон Дж.Дж., Маклафлин Р.Дж. (1985) Геология гранита Харни-Пик, Блэк-Хиллз, Южная Дакота. В: Рич Ф.Дж. (ред.) Геология Блэк-Хиллз, Южная Дакота и Вайоминг, 2-е изд. Am Geol Inst, стр. 225–240

  • Redden JA, Peterman ZE, Zartman RE, DeWitt E (1990) U-Th-Pb возраст циркона и монацита и предварительная интерпретация тектонического развития докембрийских пород в Блэк-Хиллз, Северная Дакота.В: Lewry JF, Stauffer MR (eds) Trans-Hudson Orogen. Geol Assoc Can Spec Pap 37:229–251

  • Wiley GH (1970) Изотопные расхождения в зональных пегматитах, Блэк-Хиллз, Южная Дакота. Геохим Космохим Акта 4:713–725

    Google Scholar

  • Роберт Дж.Л. (1976) Растворимость титана в твердых растворах синтетического флогопита. Хим Геол 17:213–227

    Google Scholar

  • Рокхолд Дж.Р., Набелек П.И., Гласкок М.Д. (1987) Происхождение ритмического расслоения в спутниковом плутоне Пик Каламити гранита Харни Пик, Южная Дакота: роль бора.Геохим Космохим Акта 51:487–496

    Google Scholar

  • Scaillet B, France-Lanord C, Le Fort P (1990) Плутоны Badrinath-Gangotri (Garhwal, Индия) петрологическое и геохимическое свидетельство процессов фракционирования в высоком гималайском лейкограните. J Volcanol Geotherm Res 44:163–188

    Google Scholar

  • Скайе Б., Пичаван М., Ру Дж. (1991) Стабильность турмалина, биотита и мусковита в кислых перглиноземистых жидкостях: новые экспериментальные данные.Терра Абстр 3:30

    Google Scholar

  • Ширер К.К., Папике Дж.Дж. (1986) Распределение бора в пегматите Тип Топ, Блэк Хиллс, Южная Дакота. Геология 14:119–123

    Google Scholar

  • Ширер К.К., Папике Дж.Дж., Лаул Дж.К. (1987a) Минералогическая и химическая эволюция редкоэлементной системы гранит-пегматит: гранит Харни-Пик, Блэк-Хиллз, Южная Дакота. Геохим Космохим Акта 51:473–486

    Google Scholar

  • Ширер К.К., Папике Дж.Дж., Редден Дж.А., Саймон С.Б., Уокер Р.Дж., Лаул Дж.К. (1987B) Происхождение выделений пегматитового гранита, Уиллоу-Крик, Блэк-Хиллз, Южная Дакота.Минерал 25:159–171

    Google Scholar

  • Shell MR, Ivey KH (1969) Фторсодержащие слюды. US Bur Mines Bull 647

  • Thompson AB (1982) Дегидратационное плавление пелитовых пород и образование H 2 O недонасыщенных гранитных жидкостей. Am J Sci 282: 1567–1595

    Google Scholar

  • Truscott MG, Shaw DM (1984) Бор в кремнистых и докембрийских образованиях кремнистого железа.Геохим Космохим Акта 48:2313–2320

    Google Scholar

  • Видал П., Кошери А., Ле Форт П. (1982) Геохимические исследования происхождения лейкогранита Манаслу (Гималаи, Непал). Геохим Космохим Акта 46:2279–2292

    Google Scholar

  • Vielzeuf D, Holloway JR (1988) Экспериментальное определение отношений флюид-отсутствие плавления в пелитовой системе.Contrib Mineral Petrol 98:257–276

    Google Scholar

  • Vielzeuf D, Montel JM (1991) Экспериментальное определение бесфлюидного плавления природной богатой кварцем метаграувакки; часть I: фазовые отношения. Терра Абстр 3:30

    Google Scholar

  • Walker RJ, Hanson GN, Papike JJ, O’Neil JR (1986) Изотопные ограничения Nd, O и Sr на происхождение докембрийских пород, южные Блэк-Хиллз, Южная Дакота.Геохим Космохим Акта 50:2833–2846

    Google Scholar

  • Уокер Р.Дж., Хэнсон Г.Н., Папике Дж.Дж. (1989) Ограничения по микроэлементам на генезис пегматита: пегматит Тин-Маунтин, Блэк-Хиллз, Южная Дакота. Contrib Mineral Petrol 101:290–300

    Google Scholar

  • Yurimoto H, Duke EF, Papike JJ, Shearer CK (1990) Являются ли прерывистые спектры REE, нормализованные по хондритам, в пегматитовых гранитных системах результатом фракционирования монацита? Геохим Космохим Акта 54:2141–2145

    Google Scholar

  • Приложения Gale — Технические трудности

    Технические трудности

    Приложение, к которому вы пытаетесь получить доступ, в настоящее время недоступно.Приносим свои извинения за доставленные неудобства. Повторите попытку через несколько секунд.

    Если проблемы с доступом сохраняются, обратитесь за помощью в наш отдел технической поддержки по телефону 1-800-877-4253. Еще раз спасибо, что выбрали Gale, обучающую компанию Cengage.

    org.springframework.remoting.RemoteAccessException: невозможно получить доступ к удаленной службе [[email protected]]; вложенным исключением является Ice.Неизвестное исключение unknown = «java.lang.IndexOutOfBoundsException: индекс 0 выходит за границы для длины 0 в java.base/jdk.internal.util.Preconditions.outOfBounds(Preconditions.java:64) в java.base/jdk.internal.util.Preconditions.outOfBoundsCheckIndex(Preconditions.java:70) в java.base/jdk.internal.util.Preconditions.checkIndex(Preconditions.java:248) в java.base/java.util.Objects.checkIndex(Objects.java:372) на Яве.база/java.util.ArrayList.get(ArrayList.java:458) в com.gale.blis.data.subscription.dao.LazyUserSessionDataLoaderStoredProcedure.populateSessionProperties(LazyUserSessionDataLoaderStoredProcedure.java:60) в com.gale.blis.data.subscription.dao.LazyUserSessionDataLoaderStoredProcedure.reQuery(LazyUserSessionDataLoaderStoredProcedure.java:53) в com.gale.blis.data.model.session.UserGroupEntitlementsManager.reinitializeUserGroupEntitlements(UserGroupEntitlementsManager.ява:30) в com.gale.blis.data.model.session.UserGroupSessionManager.getUserGroupEntitlements(UserGroupSessionManager.java:17) в com.gale.blis.api.authorize.contentmodulefetchers.CrossSearchProductContentModuleFetcher.getProductSubscriptionCriteria(CrossSearchProductContentModuleFetcher.java:244) на com.gale.blis.api.authorize.contentmodulefetchers.CrossSearchProductContentModuleFetcher.getSubscribedCrossSearchProductsForUser(CrossSearchProductContentModuleFetcher.ява:71) на com.gale.blis.api.authorize.contentmodulefetchers.CrossSearchProductContentModuleFetcher.getAvailableContentModulesForProduct(CrossSearchProductContentModuleFetcher.java:52) на com.gale.blis.api.authorize.strategy.productentry.strategy.AbstractProductEntryAuthorizer.getContentModules(AbstractProductEntryAuthorizer.java:130) на com.gale.blis.api.authorize.strategy.productentry.strategy.CrossSearchProductEntryAuthorizer.isAuthorized(CrossSearchProductEntryAuthorizer.ява:82) на com.gale.blis.api.authorize.strategy.productentry.strategy.CrossSearchProductEntryAuthorizer.authorizeProductEntry(CrossSearchProductEntryAuthorizer.java:44) на com.gale.blis.api.authorize.strategy.ProductEntryAuthorizer.authorize(ProductEntryAuthorizer.java:31) в com.gale.blis.api.BLISAuthorizationServiceImpl.authorize_aroundBody0(BLISAuthorizationServiceImpl.java:57) на com.gale.blis.api.BLISAuthorizationServiceImpl.authorize_aroundBody1$advice(BLISAuthorizationServiceImpl.ява: 61) на com.gale.blis.api.BLISAuthorizationServiceImpl.authorize(BLISAuthorizationServiceImpl.java:1) на com.gale.blis.auth._AuthorizationServiceDisp._iceD_authorize(_AuthorizationServiceDisp.java:141) в com.gale.blis.auth._AuthorizationServiceDisp._iceDispatch(_AuthorizationServiceDisp.java:359) в IceInternal.Incoming.invoke(Incoming.java:209) в Ice.ConnectionI.invokeAll(ConnectionI.java:2800) на льду.ConnectionI.dispatch(ConnectionI.java:1385) в Ice.ConnectionI.message(ConnectionI.java:1296) в IceInternal.ThreadPool.run(ThreadPool.java:396) в IceInternal.ThreadPool.access$500(ThreadPool.java:7) в IceInternal.ThreadPool$EventHandlerThread.run(ThreadPool.java:765) в java.base/java.lang.Thread.run(Thread.java:834) » org.springframework.remoting.ice.IceClientInterceptor.convertIceAccessException(IceClientInterceptor.java:365) org.springframework.remoting.ice.IceClientInterceptor.invoke(IceClientInterceptor.java:327) org.springframework.remoting.ice.MonitoringIceProxyFactoryBean.invoke(MonitoringIceProxyFactoryBean.java:71) org.springframework.aop.framework.ReflectiveMethodInvocation.proceed(ReflectiveMethodInvocation.java:186) org.springframework.aop.framework.JdkDynamicAopProxy.invoke(JdkDynamicAopProxy.java:212) com.sun.proxy.$Proxy130.authorize(Неизвестный источник) com.gale.auth.service.BlisService.getAuthorizationResponse(BlisService.java:61) com.gale.apps.service.impl.MetadataResolverService.resolveMetadata(MetadataResolverService.java:65) com.gale.apps.controllers.DiscoveryController.resolveDocument(DiscoveryController.java:57) ком.gale.apps.controllers.DocumentController.redirectToDocument(DocumentController.java:22) jdk.internal.reflect.GeneratedMethodAccessor305.invoke (неизвестный источник) java.base/jdk.internal.reflect.DelegatingMethodAccessorImpl.invoke(DelegatingMethodAccessorImpl.java:43) java.base/java.lang.reflect.Method.invoke(Method.java:566) org.springframework.web.method.support.InvocableHandlerMethod.doInvoke(InvocableHandlerMethod.ява: 215) org.springframework.web.method.support.InvocableHandlerMethod.invokeForRequest(InvocableHandlerMethod.java:142) org.springframework.web.servlet.mvc.method.annotation.ServletInvocableHandlerMethod.invokeAndHandle(ServletInvocableHandlerMethod.java:102) org.springframework.web.servlet.mvc.method.annotation.RequestMappingHandlerAdapter.invokeHandlerMethod (RequestMappingHandlerAdapter.java:895) org.springframework.web.servlet.mvc.method.annotation.RequestMappingHandlerAdapter.handleInternal (RequestMappingHandlerAdapter.java:800) org.springframework.web.servlet.mvc.method.AbstractHandlerMethodAdapter.handle(AbstractHandlerMethodAdapter.java:87) org.springframework.web.servlet.DispatcherServlet.doDispatch(DispatcherServlet.java:1038) org.springframework.web.servlet.DispatcherServlet.doService(DispatcherServlet.java:942) орг.springframework.web.servlet.FrameworkServlet.processRequest(FrameworkServlet.java:998) org.springframework.web.servlet.FrameworkServlet.doGet(FrameworkServlet.java:890) javax.servlet.http.HttpServlet.service(HttpServlet.java:626) org.springframework.web.servlet.FrameworkServlet.service(FrameworkServlet.java:875) javax.servlet.http.HttpServlet.service(HttpServlet.java:733) орг.apache.catalina.core.ApplicationFilterChain.internalDoFilter(ApplicationFilterChain.java:227) org.apache.catalina.core.ApplicationFilterChain.doFilter(ApplicationFilterChain.java:162) org.apache.tomcat.websocket.server.WsFilter.doFilter(WsFilter.java:53) org.apache.catalina.core.ApplicationFilterChain.internalDoFilter(ApplicationFilterChain.java:189) org.apache.catalina.core.ApplicationFilterChain.doFilter(ApplicationFilterChain.ява: 162) org.apache.catalina.filters.HttpHeaderSecurityFilter.doFilter(HttpHeaderSecurityFilter.java:126) org.apache.catalina.core.ApplicationFilterChain.internalDoFilter(ApplicationFilterChain.java:189) org.apache.catalina.core.ApplicationFilterChain.doFilter(ApplicationFilterChain.java:162) org.springframework.web.servlet.resource.ResourceUrlEncodingFilter.doFilter(ResourceUrlEncodingFilter.java:63) орг.apache.catalina.core.ApplicationFilterChain.internalDoFilter(ApplicationFilterChain.java:189) org.apache.catalina.core.ApplicationFilterChain.doFilter(ApplicationFilterChain.java:162) org.springframework.web.filter.OncePerRequestFilter.doFilter(OncePerRequestFilter.java:101) org.apache.catalina.core.ApplicationFilterChain.internalDoFilter(ApplicationFilterChain.java:189) org.apache.catalina.core.ApplicationFilterChain.doFilter(ApplicationFilterChain.java:162) org.springframework.web.filter.OncePerRequestFilter.doFilter(OncePerRequestFilter.java:101) org.apache.catalina.core.ApplicationFilterChain.internalDoFilter(ApplicationFilterChain.java:189) org.apache.catalina.core.ApplicationFilterChain.doFilter(ApplicationFilterChain.java:162) org.springframework.web.filter.OncePerRequestFilter.doFilter(OncePerRequestFilter.java:101) орг.apache.catalina.core.ApplicationFilterChain.internalDoFilter(ApplicationFilterChain.java:189) org.apache.catalina.core.ApplicationFilterChain.doFilter(ApplicationFilterChain.java:162) org.springframework.boot.web.servlet.support.ErrorPageFilter.doFilter(ErrorPageFilter.java:130) org.springframework.boot.web.servlet.support.ErrorPageFilter.access$000(ErrorPageFilter.java:66) org.springframework.boot.web.servlet.support.ErrorPageFilter$1.doFilterInternal(ErrorPageFilter.java:105) org.springframework.web.filter.OncePerRequestFilter.doFilter(OncePerRequestFilter.java:107) org.springframework.boot.web.servlet.support.ErrorPageFilter.doFilter(ErrorPageFilter.java:123) org.apache.catalina.core.ApplicationFilterChain.internalDoFilter(ApplicationFilterChain.java:189) org.apache.catalina.core.ApplicationFilterChain.doFilter(ApplicationFilterChain.ява: 162) org.springframework.boot.actuate.web.trace.servlet.HttpTraceFilter.doFilterInternal(HttpTraceFilter.java:90) org.springframework.web.filter.OncePerRequestFilter.doFilter(OncePerRequestFilter.java:107) org.apache.catalina.core.ApplicationFilterChain.internalDoFilter(ApplicationFilterChain.java:189) org.apache.catalina.core.ApplicationFilterChain.doFilter(ApplicationFilterChain.java:162) орг.springframework.web.filter.RequestContextFilter.doFilterInternal (RequestContextFilter.java: 99) org.springframework.web.filter.OncePerRequestFilter.doFilter(OncePerRequestFilter.java:107) org.apache.catalina.core.ApplicationFilterChain.internalDoFilter(ApplicationFilterChain.java:189) org.apache.catalina.core.ApplicationFilterChain.doFilter(ApplicationFilterChain.java:162) org.springframework.web.filter.FormContentFilter.doFilterInternal (FormContentFilter.java: 92) org.springframework.web.filter.OncePerRequestFilter.doFilter(OncePerRequestFilter.java:107) org.apache.catalina.core.ApplicationFilterChain.internalDoFilter(ApplicationFilterChain.java:189) org.apache.catalina.core.ApplicationFilterChain.doFilter(ApplicationFilterChain.java:162) org.springframework.web.filter.HiddenHttpMethodFilter.doFilterInternal (HiddenHttpMethodFilter.ява:93) org.springframework.web.filter.OncePerRequestFilter.doFilter(OncePerRequestFilter.java:107) org.apache.catalina.core.ApplicationFilterChain.internalDoFilter(ApplicationFilterChain.java:189) org.apache.catalina.core.ApplicationFilterChain.doFilter(ApplicationFilterChain.java:162) org.springframework.boot.actuate.metrics.web.servlet.WebMvcMetricsFilter.filterAndRecordMetrics(WebMvcMetricsFilter.java:154) орг.springframework.boot.actuate.metrics.web.servlet.WebMvcMetricsFilter.filterAndRecordMetrics(WebMvcMetricsFilter.java:122) org.springframework.boot.actuate.metrics.web.servlet.WebMvcMetricsFilter.doFilterInternal(WebMvcMetricsFilter.java:107) org.springframework.web.filter.OncePerRequestFilter.doFilter(OncePerRequestFilter.java:107) org.apache.catalina.core.ApplicationFilterChain.internalDoFilter(ApplicationFilterChain.java:189) орг.apache.catalina.core.ApplicationFilterChain.doFilter(ApplicationFilterChain.java:162) org.springframework.web.filter.CharacterEncodingFilter.doFilterInternal (CharacterEncodingFilter.java:200) org.springframework.web.filter.OncePerRequestFilter.doFilter(OncePerRequestFilter.java:107) org.apache.catalina.core.ApplicationFilterChain.internalDoFilter(ApplicationFilterChain.java:189) org.apache.catalina.core.ApplicationFilterChain.doFilter(ApplicationFilterChain.java:162) org.apache.catalina.core.StandardWrapperValve.invoke(StandardWrapperValve.java:202) org.apache.catalina.core.StandardContextValve.invoke(StandardContextValve.java:97) org.apache.catalina.authenticator.AuthenticatorBase.invoke(AuthenticatorBase.java:542) org.apache.catalina.core.StandardHostValve.invoke(StandardHostValve.java:143) org.apache.каталина.клапаны.ErrorReportValve.invoke(ErrorReportValve.java:92) org.apache.catalina.valves.AbstractAccessLogValve.invoke(AbstractAccessLogValve.java:687) org.apache.catalina.core.StandardEngineValve.invoke(StandardEngineValve.java:78) org.apache.catalina.connector.CoyoteAdapter.service(CoyoteAdapter.java:357) org.apache.coyote.http11.Http11Processor.service(Http11Processor.java:374) орг.apache.койот.AbstractProcessorLight.process(AbstractProcessorLight.java:65) org.apache.coyote.AbstractProtocol$ConnectionHandler.process(AbstractProtocol.java:893) org.apache.tomcat.util.net.NioEndpoint$SocketProcessor.doRun(NioEndpoint.java:1707) org.apache.tomcat.util.net.SocketProcessorBase.run(SocketProcessorBase.java:49) java.base/java.util.concurrent.ThreadPoolExecutor.runWorker(ThreadPoolExecutor.java:1128) Ява.base/java.util.concurrent.ThreadPoolExecutor$Worker.run(ThreadPoolExecutor.java:628) org.apache.tomcat.util.threads.TaskThread$WrappingRunnable.run(TaskThread.java:61) java.base/java.lang.Thread.run(Thread.java:834)

    Механические свойства нуклеопротеиновых комплексов, определенные с помощью спектроскопии наноиндентирования

    РЕФЕРАТ

    Взаимодействие между факторами транскрипции, ремоделираторами хроматина, трехмерной организацией и механическими свойствами хроматинового волокна контролирует функцию генома у эукариот.Помимо канонических гистонов, которые сворачивают большую часть хроматина в нуклеосомы, варианты гистонов создают отличительные домены хроматина, которые, как считается, регулируют транскрипцию, репликацию, репарацию повреждений ДНК и правильное расхождение хромосом. Переносят ли варианты гистонов отличительные биохимические или биофизические свойства в ассоциированные с ними структуры хроматина, и влияют ли эти свойства на динамику хроматина, поскольку геном подвергается множеству транзакций, это важный вопрос в биологии.Здесь мы описываем инструменты наноиндентирования одиночных молекул, которые мы разработали специально для определения механических свойств нуклеосом гистонового варианта и их комплексов. Эти методы дополняют ряд передовых новых методов, которые расширяют наше количественное понимание реакции хроматина на внутренние и внешние силы, действующие на него во время биологических трансакций в ядре.

    КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: Хроматин, нуклеосомы, силовая спектроскопия наноиндентирования, эластичность, эпигенетика

    Введение

    Пространственная организация и механические свойства хроматина, нуклеопротеинового полимера в живых клетках, контролируют доступность ДНК.Хроматин образует характерные бусины на нитке, которые в основном состоят из нуклеосом, которые имеют консервативные компоненты гистонового белка, но разнообразные посттрансляционные модификации (PTM). Однако существуют различные варианты гистонов, и распределение вариантов нуклеосом и PTM связано с локальными функциональными результатами, такими как гетерохроматин, который является рестриктивным для РНК-полимераз, и горячие точки транскрипции, которые легко доступны. Биохимические анализы и компьютерное моделирование показали, что нуклеосомы по своей природе динамичны.В самом деле, было установлено, что ядро ​​проявляет сильную механическую реакцию из-за эластичности хроматиновой сети, которая помогает сбалансировать механическое напряжение ядерной пластинки [-1, -2-]. Это поднимает интригующий вопрос, могут ли варианты гистонов изменять механические свойства индивидуальных нуклеосом, распространяются ли такие индивидуальные механические изменения через массив нуклеосом и как любые возникающие свойства трансформируются в биологический ответ.Однако изучение физических свойств хроматина с разрешением одной молекулы ex vivo является сложной задачей из-за обилия нуклеосом и нуклеопротеинов, что создает переполненную среду [-3-]. Нерешенные вопросы включают правила, по которым геном организован в ядре, и регулирует ли внутренняя или внешняя организация его функции [ 4 ] (или наоборот). Недавняя работа предположила, что механика на основе хроматина может управлять аномальной морфологией и функцией ядер, а также дисфункцией при различных заболеваниях [ 5 7 ].

    В контексте физических сил, связанных с митозом, организация и структура хроматина, связанного с кинетохорами, изучались в течение десятилетий [ 8 , 9 ]. Физические и структурные свойства центромерного и перицентромерного хроматина являются предметом интенсивных исследований. Во время сегрегации хромосом митотические веретена связываются с центромерами через кинетохоры. Чтобы гарантировать правильное биориентированное прикрепление амфителевых микротрубочек, центромеры подвергаются как тянущим, так и толкающим силам.Как только контрольная точка веретена удовлетворена, хромосомы быстро подтягиваются к полюсам веретена. Расшифровка того, вносит ли хроматин структурный вклад в механику центромер, является фундаментальным вопросом биологии хромосом. Препарирование кинетохор цыпленка с помощью иммуноэлектронной микроскопии в присутствии или в отсутствие митотических тянущих сил [ 10 ] прекрасно показало, что внутренние кинетохоры сильно деформируются в присутствии тянущих сил. В той же работе неожиданно было обнаружено, что внешняя кинетохора остается статической.В другом отчете показано, что центромера дрожжей обеспечивает упругость и гибкость при растяжении во время митоза, действуя как амортизатор для демпфирования и рассеивания сил, генерируемых веретеном [-11-, -12-]. В более общем плане эффекты метилирования и ацетилирования гистонов на механическую жесткость митотических хромосом анализировали с помощью измерений силы удвоения длины хромосом с помощью микропипеток. В присутствии либо ингибиторов ацетилирования гистонов, либо ингибиторов метилирования гистонов было показано, что метилирование, а не ацетилирование способствует митотической структуре и жесткости [ 13 16 ].Недавно была разработана элегантная математическая модель, которая предсказала, что фосфорилирование кинетохора, зависящее от конфигурации микротрубочек, зависит от натяжения [-17-]. Действительно, во время сегрегации хромосом эти авторы обнаружили, что хромосомный комплекс-пассажир должен взаимодействовать с микротрубочками, чтобы эффективно фосфорилировать кинетохор [-17-]. В совокупности эти отчеты подтверждают возможность того, что механические свойства центромерного хроматина непосредственно влияют на биологические функции.

    Недавно наша группа исследовала механические свойства центромер-специфических нуклеосом CENP-A и расширила работу, чтобы понять, как такие свойства могут модулироваться его консервативным и важным партнером по связыванию CENP-C с использованием метода силовой спектроскопии наноиндентирования и компьютерного моделирования. [ 18 , 19 ].

    Здесь мы описываем нашу адаптацию силовой спектроскопии наноиндентирования одной молекулы в жидкости для определения модуля Юнга нуклеопротеиновых комплексов.Предыдущие измерения наноэластичности проводились на различных биологических системах, от костей до макромолекулярных комплексов [ 19 27 ]. В этой рукописи мы объясняем, как применять наши модифицированные протоколы к рекомбинантным in vitro восстановленным нуклеосомным комплексам или к хроматиновым комплексам, очищенным от клеток человека. Мы считаем, что этот протокол полезен в этой области, поскольку его можно использовать для исследования биомеханических свойств вариантов и модифицированных нуклеосом в строго контролируемых установках in vitro , а также для извлечения хроматина из клеток.

    АСМ-наноэластичность как инструмент для исследования молекулярной механики

    Обладая чувствительностью к силе пико-ньютона и субнанометровой точностью смещения, атомно-силовая микроскопия (АСМ) является полезным инструментом для измерения модулей упругости биологических образцов с использованием наноиндентирования, создаваемого наконечник АСМ [ 26 , 27 ]. Основными преимуществами наноиндентирования АСМ являются одновременная возможность определять топографию с наноразмерным разрешением и измерять эффективную эластичность в точном местоположении биомолекулы.Более того, способность изучать системы в реальном времени и in vitro в физиологических условиях является основным преимуществом в определении наномеханических свойств биологических молекул.

    Методология

    Образцы АСМ обычно получают методом литья капель [ 28 , 29 ] на мусковитной слюде, поскольку она имеет атомарно плоскую поверхность. В зависимости от типа применения иногда используется золото на слюдяных подложках [ 23 , 30 32 ].Образец должен быть надлежащим образом приклеен к подложке за счет электростатического притяжения или ковалентного связывания, чтобы выдержать растровое сканирование кантилевером. Обычно кантилеверы из нитрида кремния с жесткостью пружины в диапазоне от 0,01 Н/м до 0,5 Н/м используются для биологических приложений АСМ в жидкости, чтобы предотвратить повреждение образца. Этот протокол стандартизирован для АСМ-приборов Asylum research Cypher S и Bruker Multimode 8, но его можно легко адаптировать к другим коммерчески приобретенным или изготовленным на заказ АСМ-системам.

    Помимо визуализации топографии образцов, еще одним важным применением АСМ является силовая спектроскопия. Силовая спектроскопия включает прямое измерение сил между наконечником и поверхностью образца в зависимости от расстояния между ними. Горизонтальная ось силовой кривой представляет относительное перемещение по вертикали между образцом и датчиком АСМ, а вертикальная ось представляет собой отклонение кантилевера, когда наконечник перемещается к поверхности образца, контактирует и давит на поверхность, а затем вдали от поверхности.

    В эксперименте по измерению силы с помощью АСМ образец перемещается в вертикальном направлении относительно зонда АСМ путем подачи напряжения на пьезоэлектрический преобразователь и измеряется отклонение кантилевера. Для получения графика сила-расстояние измеряются два одновременных события – относительное перемещение кантилевера АСМ к (приближение) и от (отвод) от образца и отклонение кантилевера ΔZc. Сила F получается путем умножения прогиба кантилевера на его жесткость.Сила между наконечником и образцом описывается законом Гука F = -Kc∆Zc (уравнение 1), где Kc обозначает жесткость кантилевера [ 26 ]. В экспериментах по наноиндентированию кантилевер прижимается к поверхности образца с усилием в диапазоне от нескольких десятков до сотен наноньютонов, в зависимости от жесткости кантилевера. Образец реагирует на вдавливание в соответствии со своими вязкоупругими свойствами, а полученная кривая сила-смещение (которая преобразуется в данные силы-вдавливания) может быть дополнена соответствующими моделями контактной механики для извлечения механических параметров.Форма зонда является критическим параметром во всех моделях контактной механики. Для анализа кривых сила-смещение были разработаны различные теоретические и эмпирические модели [ 33 35 ]. Все такие модели происходят из оригинальной работы Герца, который впервые проанализировал проблему контакта между двумя сферами [ 36 , 37 ].

    В модели Герца адгезией образца пренебрегают; следовательно, его можно применять, когда сила сцепления намного меньше, чем максимальная приложенная нагрузка.Кроме того, предполагается, что индентор не деформируется и между исследуемым образцом и индентором нет дополнительного взаимодействия. При изучении мягких материалов модель Герца предсказывает, что вдавливание конусом или сферой с нагрузочной силой (F) как функцией вдавливания (δ) может быть выражено как F (конус) = π/2E (1 − ν 2 )tan(α)δ 2 (уравнение 2) и F(сфера) = 4/3E(1 − ν 2 )R 1/2 δ 3/2 ( уравнение 3) соответственно.Точная геометрия индентора вплоть до максимальной глубины вдавливания определяет, какое уравнение следует использовать. В этих уравнениях E — модуль упругости, ν — коэффициент Пуассона, δ — отпечаток, α — угол раскрытия конуса, R — радиус сферы. Коэффициент Пуассона (ν) обычно устанавливается равным 0,5, поскольку большинство биологических образцов почти несжимаемы [ 23 ]. Величина коэффициента Пуассона представляет собой отношение поперечного расширения к осевому сжатию. Большинство материалов имеют значения коэффициента Пуассона в диапазоне от 0 до 0.5. Первоначальная модель Герца рассматривает контакт между двумя сферическими телами, но позже были предприняты несколько расширений для различных геометрий индентора [ 26 ]. Модель Герца предполагает, что вдавливание образца мало по сравнению с толщиной образца. Таким образом, глубина вдавливания должна быть оптимизирована путем модуляции приложенной силы. Некоторые из наиболее часто используемых моделей (Hertz, DMT, JKR, Oliver-Pharr и т. д.) для определения модуля упругости обычно поставляются со встроенным программным обеспечением для анализа АСМ, а инструкции для пользователя доступны в руководстве по программному обеспечению.

    Методы

    Реконструкция нуклеосом

    Мы используем классический протокол солевого диализа Штейна и Симпсона для воспроизводимого восстановления высококачественных нуклеосом [ 38 , 39 ] при близких условиях 2 ) со следующими адаптациями, усовершенствованными за последнее десятилетие в нашей лаборатории [ 40 , 41 ]. Мы протестировали другие протоколы восстановления и обнаружили, что сборка, опосредованная NAP-1/шапероном, одинаково эффективна для получения полностью обернутых октамерных частиц, как было измерено с помощью АСМ и нативного ПААГ.

    1. Все поверхности стерилизуются 70% этанолом перед восстановлением, стеклянная посуда должна быть тщательно очищена и высушена без следов мыла или поверхностно-активных веществ. Автоклавированные наконечники пипеток и стеклянная посуда имеют решающее значение для предотвращения заражения нуклеазами и протеазами. Мы предлагаем поддерживать «чистую» рабочую зону с одной лентой, предназначенную для восстановления. Воду Milli-Q использовали для приготовления всех растворов и буферов. Все компоненты буфера были приобретены у Sigma Aldrich.Мы проверяем качество плазмидной ДНК на агарозном геле после приготовления каждой плазмиды. Мы рекомендуем избегать использования никированных плазмид, так как наилучшее качество реконструкции получается на суперскрученных плазмидах. Концентрацию раствора ДНК измеряют с помощью УФ-спектроскопии перед хранением при -20°С; и аликвоту 20–50 мкг гистонов в 2 М буфере NaCl следует осторожно оттаять на льду за 30 минут до использования. Для повторного использования аликвоты гистонов можно хранить при 4°C, но их необходимо утилизировать в течение 2 недель, если они не используются и если они не содержат глицерин.После размораживания аликвот гистонов проводят диализ тетрамеров h4/h5 или тетрамеров CENP-A/h5 при осторожном перемешивании против 1 л предварительно охлажденного 0,1 М, 0,6 М и 2 М NaCl-TE соответственно в течение 1 часа. Для диализа гистонов объем не должен превышать 200 мкл. Для восстановления 40 мкг возьмите 9 мкг тетрамеров h4/h5 или тетрамеров CENP-A/h5. Измерьте концентрацию димера h3A-h3B и диализированных тетрамеров h4/h5 или тетрамеров CENP-A/h5 с помощью анализа в электрофорезе с использованием 1 мкг BSA в качестве стандарта с последующим окрашиванием Кумасси ()).Измеряя интенсивность полосы гистоновых белков над BSA, определяли концентрацию гистоновых белков.

      (a) Концентрацию гистонового белка определяли окрашиванием Кумасси с использованием стандарта BSA. (b) Результаты BioAnalyzer после 60 сек. Расщепление MNase воссозданного h4 с различным соотношением ДНК и гистонов, демонстрирующее структуру нуклеосомной лестницы. АСМ-изображения (c) замороженных образцов, (d) восстановления низкого качества и восстановления хорошего качества с соотношением ДНК:гистон, равным (e) 1.8 или (е) 3.6.

    [Примечание 1: Этот шаг важен, поскольку после диализа произойдет некоторая потеря гистонов, измерение концентрации гистонов на этом этапе дает уверенность в приготовлении смеси гистонов и ДНК в точной пропорции].

    1. Приготовьте раствор ДНК-плазмиды 601 (pGEM3Z-601 от Addgene), димеров h3A-h3B и диализированного тетрамера h4/h5 или CENP-A/h5 в буфере (2 М NaCl, 10 мМ Трис-Cl pH 8,0, 1 мМ ЭДТА), чтобы получить конечный объем 200 мкл.ДНК и гистоновый белок следует осторожно смешать в соотношении 10:9 для мононуклеосом. Например, в случае восстановления 40 мкг мы берем 9 мкг тетрамеров h4/h5 или тетрамеров CENP-A/h5 и 9 мкг димера h3A-h3B вместе с 20 мкг ДНК. Затем добавьте 3 мкл коктейля ингибиторов протеазы и инкубируйте на льду в течение 30 минут.

    2. Аккуратно поместите пренуклеосомную смесь в смоченную кассету Slide-A-Lyzer (Thermo Fischer, Slide A lyzer 20 K MWCO) и в четыре последовательных этапа, каждый раз осторожно поднимая за край чистым пинцетом, инкубировать при 4ºC против 500 мл предварительно охлажденных и отфильтрованных буферов с использованием мешалки при низкой температуре следующим образом: (а) 2 часа – 1 М NaCl, 10 мМ Трис-CL, рН 8.0, 1 мМ ЭДТА, (б) 2 часа – 0,8 М NaCl, 10 мМ Трис-CL, pH 8,0, 1 мМ ЭДТА, (c) Ночь – 0,6 М NaCl, 10 мМ Трис-CL, pH 8,0, 1 мМ ЭДТА, ( г) 2 часа – 0,15 М NaCl, 10 мМ Трис-CL pH 8,0, 1 мМ ЭДТА. Затем осторожно удалите раствор из диализной кассеты и немедленно используйте.

    [Примечание 2: Этап 0,6 М NaCl-TE является критическим, и его нельзя уменьшать, поскольку это ключевой этап, на котором димеры h3A/h3B будут собираться по обе стороны пренуклеосомной тетрасомы. Общий объем должен оставаться относительно неизменным после извлечения из диализной кассеты.Потеря материала очевидна по сильному истощению объема реконструируемого вещества. Если в пробирке наблюдается помутнение даже после нагревания хроматина до комнатной температуры, это обычно указывает на высокое отношение гистонов к ДНК, что приводит к образованию агрегатов хроматина, которые можно раскручивать с высокой скоростью].

    1. Оценка качества нуклеосом: Для определения качества восстановленных нуклеосом 50% восстановленных нуклеаз расщепляют микрококковой нуклеазой с последующим расщеплением протеиназой К и фенол-хлороформной экстракцией фрагментов ДНК.Затем фрагменты ДНК анализируют с помощью капиллярного электрофореза высокого разрешения (BioAnalyzer). Высококачественная нуклеосомная лестница должна иметь неразмазанные кратные 150 п.н. (или ~ 120 п.н. для большинства вариантов CENP-A), что информирует о качестве и однородности восстановленных массивов хроматина. Примеры высококачественных гистонов и последующей реконструкции нуклеосом приведены в). Хроматин не следует замораживать, но его можно хранить при температуре 4ºC до 48 часов. В наших руках мы наблюдали, что замораживание хроматина приводит к необратимым агрегатам, как визуализируется с помощью АСМ ()).Кроме того, центрифугирование образца в пробирке или промывание образца на слюде не снижает агрегацию. Мы рекомендуем проводить анализ MNase параллельно с AFM-анализом в течение нескольких часов после завершения восстановления, но, конечно же, не позднее 24 часов после восстановления. При желании альтернативным методом является исследование фрагментов нативных нуклеосом после обработки MNase без депротеинизации образцов на нативных гелях. Эти гели традиционно работают как 0,5% гели в 0.5X TBE при 4°C при слабом токе в течение нескольких часов. На нативном геле мононуклеосома будет соответствовать примерно 250–300 п.н., эквивалентным лестнице ДНК [ 42 ].

    Иммунопреципитация нативного хроматина и вестерн-блоттинг

    Клетки HeLa выращивали в среде DMEM (Invitrogen/ThermoFisher Cat #11965) с добавлением 10% FBS и 1X смеси пенициллина и стрептомицина. Эксперименты с N-ChIP проводились без фиксации. После того, как клетки были выращены до ~80% слияния, их собирали, как описано [43].Для достижения наилучших результатов при подготовке хроматина для АСМ осадок, полученный после каждого замедления вращения во время протокола экстракции ядер [ 42 ], разбивается одним легким постукиванием. Ядра расщепляли в течение 6 минут с помощью 0,25 ед. Мназы/мл (Sigma-Aldrich, кат. № N3755-500UN) и добавляли 1,5 мМ CaCl 2 . После гашения (10 мМ EGTA) осадки ядер центрифугировали и осторожно экстрагировали хроматин в течение ночи в ротаторе «конец за концом» в растворе с низким содержанием соли (0.5X ПБС; 0,1 мМ ЭГТА; коктейль ингибиторов протеазы (Roche cat #05056489001)). Хроматин N-ChIP, связанный с гранулами протеина G-сефарозы (GE Healthcare, кат. № 17-0618-02), осторожно дважды промывали охлажденным льдом 0,5X PBS и центрифугировали в течение 1 минуты при 4°C при 800 об/мин. После первого N-ChIP несвязанную фракцию использовали для последующего N-ChIP. Эксперименты с N-ChIP проводились с западными анализами, которые проводились с использованием сканера LiCor Odyssey CLx и Image Studio v2.0.

    Подготовка образцов АСМ и условия сканирования в буфере

    (1) Свежеприготовьте слюду, обработанную 1-(3-аминопропил)силатраном (АПС) (нанесите 50 мкл 166 мкМ водного раствора АПС на подложки слюдяных дисков на 30 мин, с последующим промыванием 5 мл сверхчистой водой и сушкой в ​​токе азота) непосредственно перед каждым экспериментом.Разбавьте восстановленный образец хроматина в буфере 0,5X PBS, 2 мМ MgCl 2 до конечной концентрации ~ 0,01 мкг/мл. Внесите 8–10 мкл разбавленного образца хроматина в центр поверхности APS-слюды. Концы наконечников пипеток следует обрезать, чтобы свести к минимуму повреждение образца хроматина сдвиговым потоком. Накройте образец стерильной крышкой чашки Петри, чтобы защитить его от пыли, и инкубируйте в течение 10 мин при комнатной температуре. Затем промойте образец 400–600 мкл того же буфера, капая по 3–4 капли за раз и осторожно встряхивая, удерживая образец пинцетом.Для получения изображений на воздухе промойте образец 400–600 мкл воды Milli-Q и высушите с помощью мягкого потока газообразного аргона/азота.

    Для измерения эффективных модулей упругости образцов нуклеосом мы использовали как CypherS Asylum (Oxford Instruments), так и наноскоп MultiMode-8 (Bruker), используя различные режимы АСМ, чтобы получить наиболее надежное сравнение между контрольными и экспериментальными образцами. Во всех случаях восстановленный хроматин сначала визуализировали на воздухе в режиме постукивания АСМ, чтобы проверить качество образца () и установить соответствующую концентрацию нуклеосом на слюдяных субстратах ().Для визуализации в воздухе мы обычно использовали рычаги OTESPA или FESP (Bruker).

    (2) Для микроскопа AFM CypherS Asylum подготовьте образцы с желаемой концентрацией, поместите на предметный столик и просканируйте под буфером в режиме постукивания (визуализация в контактном режиме не подходит для таких биологических образцов, поскольку силы сдвига будут повредить образец) с использованием кантилеверов с низкой жесткостью пружины, например Biolever mini от Olympus и MSNL от Bruker с жесткостью пружины в диапазоне 0.01–0,1 Н/м. Эти наконечники зондов имеют радиус кривизны ~ 2–10 нм, что близко к размерам нуклеосом ()). Частота для мини-рычагов biolever находится в диапазоне 20–26 кГц, что является достаточно высокой частотой для получения изображений с высоким разрешением в буфере по сравнению с другими доступными датчиками для визуализации в жидкости. Обычно мы используем 100 мкл буферной капли поверхности слюды, осажденной хроматином, для погружения кантилевера. В буфере при приближении уставка для сканирования должна поддерживаться примерно на половине амплитуды свободных колебаний.Сканирование должно выполняться аккуратно, с низкой скоростью (0,5–1 строка/с), чтобы предотвратить повреждение образца, и изображения, снятые с размерами 2 мкм × 2 мкм, сначала с разрешением 512 × 512 или выше, а затем с увеличением до 1 мкм × 1 мкм. или 500 нм × 500 нм, чтобы увеличить область интереса.

    (a) СЭМ-изображение мини-кантилевера Biolever от Olympus, (b) (i) и (ii), на котором показан снимок экрана, представляющий профиль вдавливания и силы для одной нуклеосомной частицы на слюде, обработанной APS, в буфере 0,5X PBS, 2 мМ MgCl 2 , кривая силы приближения (красная) соответствует модели Герца с использованием сферической геометрии, (c) сила против силы.профиль расстояния, где кривая силы приближения (красная) имеет пик сцепления.

    [Примечание 3: i) слюда должна быть прочно прикреплена к металлическому стержню; ii) использовать не очень тонкую слюду; iii) использовать буфер комнатной температуры, чтобы свести к минимуму дрейф во время визуализации; iv) часто проверяйте частоту кантилевера под буфером, чтобы убедиться, что вы находитесь на правильном частотном пике].

    АСМ-силовая спектроскопия наноиндентирования в буферных условиях (для Cypher)

    (1) Чтобы откалибровать АСМ-зонд для силовой спектроскопии, перед погружением АСМ-зонда в буфер используйте автоматическую калибровку зонда GetReal (бесплатное приложение для всех Cypher Asylum). АСМ).Здесь наконечник никогда не касается образца, что сводит к минимуму риск повреждения или загрязнения. Чувствительность обратного оптического рычага (InvOLS) и жесткость пружины (k) калибруются за один шаг.

    Для других АСМ методы калибровки датчика просты и подробно описаны в руководстве к прибору. Вкратце, чувствительность к отклонению должна быть измерена в контактной области кривой силы, взятой на твердой подложке, например. свежесколотой слюды с последующей термической настройкой кантилевера для оценки жесткости пружины рычага.Всегда рекомендуется использовать новые наконечники для калибровки, и хорошей практикой является повторение калибровки несколько раз, чтобы проверить значение чувствительности к отклонению на твердом основании в разных местах.

    (2) Переведите наконечник в режим переменного тока и начните сканирование образца в буфере. Как только вы получите изображение образца хроматина достойного качества, увеличьте масштаб до 1 мкм × 1 мкм. Измерьте размеры нуклеосом и убедитесь в качестве восстановленного материала. Обычно значения высоты восстановленных in vitro нуклеосом h4 и CENP-A составляют 4–5 нм в буферных условиях.Диаметр должен быть сферическим при ~ 12–14 нм. Теперь вы готовы переключиться в «контактный» режим для получения кривых силы.

    (3) Сначала установите усилие срабатывания 150–200 пН. Для системы Cypher AFM мы обнаружили, что сила ~ 200 пН обеспечивает стабильные измерения. Затем приобретите кривые силы на нуклеосомной частице с помощью инструмента «выбрать точку» (аналогичные инструменты доступны во всех имеющихся в продаже АСМ). Повторите это несколько раз в разных точках нуклеосомы, а также других нуклеосом в той же области сканирования.Точно так же можно получить карты Force для конкретной области, содержащей нуклеосомы. Затем подгоните полученные кривые силы к модели Герца с определенной геометрией наконечника (снимок экрана программного обеспечения Cypher AFM, показывающий подгонку кривой силы к модели Герца (сферическая геометрия) представлен на )). Нуклеосомы имели отступ не более 1,5 нм. Если кривая силы сближения содержит пики адгезии (возникающие из-за липкости образца), эту кривую силы не следует рассматривать для последующего анализа, поскольку модель Герца можно применять только тогда, когда сила адгезии намного меньше максимальной приложенной силы ()).Чтобы объединить точки данных из нескольких экспериментов и создать гистограммы, файлы ascii можно открыть и построить с помощью программного обеспечения «origin» (https://www.originlab.com/).

    Постукивание PeakForce – количественное наномеханическое картирование (PFT-QNM)

    Для наноскопа MultiMode-8 от Bruker наиболее подходящей модальностью АСМ является поколачивание PeakForce – количественное наномеханическое картирование (PFT-QNM). В этом режиме АСМ кантилевер возбуждается на частотах значительно ниже их резонанса (обычно 0.от 5 до 2 кГц, но также доступны более низкие и более высокие частоты), а кривая силы получается при каждом цикле колебаний. Затем программное обеспечение прибора строит топографическое изображение, оценивая точку контакта в каждом цикле колебаний. Одновременно отдельные кривые усилия аппроксимируются соответствующими физическими моделями для получения оценки эффективного модуля упругости образца. Рекомендуется использовать острые зонды из нитрида кремния с жесткостью около 0,1 Н/м (например,г. MSNL-E, Bruker, радиус кривизны которого составляет порядка 3 нм). В результате процедуры будет получено топографическое и эластичное картирование с очень высоким разрешением. Для острых зондов, рекомендованных выше, мы используем модель Снеддона для конического зонда. Максимальное усилие (Peak-Force) при каждом цикле колебаний должно поддерживаться ниже 100 пН, а амплитуда колебаний должна быть снижена до 10–15 нм при частоте колебаний 1 кГц. Во всех случаях максимальное углубление должно быть ограничено 1–1,5 нм, за пределами которого наблюдалось повреждение нуклеосом.

    Первоначально таким образом сканируется большая площадь, чтобы получить общее представление о образце, прежде чем увеличить область до 250–500 нм 2 для получения изображения QNM с высоким разрешением (1–2 нм/пиксель). Полученные данные содержат кривую силы для каждого пикселя топографического изображения. Можно использовать автоматический анализ, обеспечиваемый программным обеспечением прибора, для анализа кривых силы и построения карты эластичности образца, или можно экспортировать кривые силы для автономного подбора пользовательской кривой. Одна проблема с кривыми силы QNM заключается в том, что они могут быть шумными, и может потребоваться прибегнуть к тщательной, индивидуальной подгонке кривой, чтобы обеспечить правильную локализацию точки контакта и извлеченного модуля упругости.Мы обнаружили, что это лучший метод для надежной оценки параметров, и нам нужно проанализировать только небольшое подмножество карты общей силы, выбрав кривые силы вдоль коротких сегментов линии, проходящих через отдельные нуклеосомы. Как правило, на каждой нуклеосоме будет меньше 10 кривых, и эти кривые необходимо тщательно выбирать, используя топографию в качестве ориентира.

    Например, мононуклеосомы были реконструированы на 187 п.н. 601 последовательности Widom с использованием либо канонического h4, либо варианта CENP-A.Поверхности слюды были модифицированы с помощью 0,5 мМ APS, и мы использовали кантилеверы MSNL-E (Bruker), которые были индивидуально откалиброваны с помощью метода теплового шума, предоставленного с программным обеспечением прибора. Кривые силы для отдельных нуклеосом были экспортированы и проанализированы с помощью специального программного обеспечения (MATLAB), которое моделирует зонд в виде конуса (Sneddon). Результаты для мононуклеосом h4 и CENP-A показаны на рис.

    Измерение модуля Юнга на мононуклеосомах; репрезентативные изображения мононуклеосом (а) h4 и (б) CENP-A на слюде.( c ) Модуль Юнга был измерен для отдельных мононуклеосом h4 или CENP-A, чтобы оценить, является ли частица нуклеосомы однородно эластичной, действительно, как внутреннее (красное), так и внешнее (синее) кольцо показали одинаковые значения модуля Юнга.

    АСМ-спектроскопия наноиндентирования ex vivo очищенного хроматина

    Недавно мы успешно использовали описанный выше протокол для измерения эластичности CENP-A, h4 и CENP-C, ассоциированного с CENP-A хроматина ( и ) [ 18 ].Затем мы проанализировали объемный хроматин, очищенный от клеток HeLa.

    Таблица 1.

    Исследования методом наномеханической силовой спектроскопии нуклеосом h4 и CENP-A, а также нуклеосом CENP-A, связанных с CENP-C CD ( in vitro ), нерасфасованные образцы и образцы CENP-C N-ChIP (ex vivo ).

    95 9.4 ± 5,8
    Название образца N Высота (нм) диаметр (нм) диаметр (нм) Модуль молодых (MPA)
    H4 Mononucleosome 5 5.2 ± 0,5 11.5 11,3 ± 1,2 35.4 ± 13,9
    CENP-A Mononucleosome 4 5.7 ± 0,5 11.7 ± 2.3 18.5 ± 15.6
    48 3.8 ± 0.3 14.0 ± 1,2 11.3 ± 4.1
    CENP-A Нуклеосом 46 46 3,7 ± 0,3 13.7 ± 1,0 5.8 ± 3.0
    CENP-A + 2x CENP-C CD 48 4.1 ± 0,5 13,5 ± 0,9 9.4 ± 5.8
    CENP-A + 4x CENP-C CD 50 4,1 ± 0,6 14,0 ± 1,2 15,2 ± 10,5
    Обзорный хроматин 13 13 5.4 ± 0.5 14,3 ± 0,8 14,3 ± 0,8 16,1 ± 5.5
    CENP-C Комплекс (CENP-C N-CHIP) 5 8,3 ± 1,8 36,5 ± 10,5

    Примеры измерения силовых кривых на нуклеосомах в массиве: четыре репрезентативные силовые кривые для нуклеосом h4, нуклеосом CENP-A, нуклеосом CENP-A с двукратным избытком фрагментов CENP-C CD Показаны нуклеосомы с четырехкратным избытком фрагментов CENP-C CD .(Данные воспроизведены с разрешения Melters et al 2019 PNAS [ 18 ]).

    Мы отмечаем, что эти эксперименты нетривиальны в основном из-за сложной природы образца. Существует ряд факторов, которые следует особо отметить для успешной работы с образцом ex vivo . Во-первых, в экспериментах in vitro регулируется точный состав вашего образца, включая концентрацию ()), тогда как образцы ex vivo изначально содержат примеси, полученные из клетки ()).Во-вторых, эти образцы имеют тенденцию слабо прилипать к поверхности слюды, модифицированной АПС, что является важной предпосылкой для получения изображения АСМ хорошего качества в буферных условиях. Несмотря на все эти предостережения, нативные образцы представляют собой настоящие биологические субстраты и, следовательно, заслуживают изучения с целью проверки и функционального анализа свойств, наблюдаемых in vitro . Чтобы преодолеть эти проблемы, мы проверили стабильность объемного хроматина в различных буферных условиях, варьируя концентрации солей.Мы также проверили, насколько хорошо объемный хроматин прилипает к поверхности слюды, используя различные концентрации АПС. Из этих экспериментов мы наблюдали, что двукратное увеличение концентрации АПС (депозит 50 мкл 332 мкМ водного раствора АПС) и буферный раствор, содержащий субфизиологическую концентрацию NaCl (30 мМ), стабилизируют ex vivo образцов хроматина на слюде.

    АСМ-изображения массивов нуклеосом CENP-A в воздухе из (a) воссоздания in vitro, (b) и ex vivo CENP-A ChIP и (c) Массовый хроматин, извлеченный из клеток HeLa.В жидкости (0,25X PBS + 2 мМ MgCl 2 ) изображения АСМ из (d и e) объемного хроматина и (f и g) CENP-C N-ChIP.

    При исследовании механических характеристик хроматинового волокна поддержание физиологической концентрации солей и присутствие ионов Mg 2+ имеют решающее значение для ограничения вращения нуклеосом внутри волокна. Первый отчет о механических свойствах структуры хроматина высшего порядка лаборатории Бустаманте [ 44 ], которая показала переход от свернутых волокон хроматина к развернутым волокнам при снижении концентрации соли до 40 мМ (без MgCl 2 ) .Кроме того, они показывают, что эти взаимодействия белок-волокно зависят от соли и исчезают при низкой концентрации соли (~ 5 мМ) [ 44 ]. Во многих отчетах с оптическим и магнитным пинцетом показаны эксперименты, проведенные с низким содержанием соли и в отсутствие Mg 2+ , т. е. в условиях, при которых можно ожидать сильного влияния на фолдинг более высокого порядка, дающего переменные результаты [ 45 51 ]. Субфизиологические солевые растворы также часто используются для жидкостной АСМ для получения стабильной визуализации нуклеосом [, 52, , , , , 53, ].Стабильность нуклеосом также зависит от концентрации коровых частиц [ 50 , 51 ]. Действительно, нативное нуклеосомное состояние, состоящее из двух копий h3A, h3B, h4 и h5, стабильно связано с ДНК в широком диапазоне концентраций соли (2–750 мМ) в зависимости от плотности нуклеосом [ 54 , 55 ].

    В наших экспериментах ex vivo концентрацию MgCl 2 всегда поддерживали на уровне 4 мМ вместе с субфизиологической концентрацией NaCl (30 мМ) для стабилизации хроматина.Сначала мы визуализировали объемный образец хроматина в режиме постукивания АСМ в воздухе, чтобы проверить качество образца ()). Если мы могли видеть хотя бы несколько массивов нуклеосом в пределах области сканирования 2 мкм × 2 мкм, а высота нуклеосом близка к 2,5 нм, то мы переходили к визуализации образца в буферных условиях. Значения высоты и диаметра массивных нуклеосом (5,4 ± 0,5 нм и 14,3 ± 0,8 нм) в буфере выше, чем у восстановленных in vitro нуклеосом h4 (3,8 нм ± 0,3 нм и 14,0 ± 1,2 нм) [ 18 ] (, ), ).После визуализации в режиме постукивания в жидкости были получены силовые кривые объемных нуклеосом и определен модуль Юнга отдельных частиц. Эти результаты продемонстрировали, что массивные нуклеосомы h4, извлеченные из клеток человека, немного более жесткие по сравнению с нуклеосомами h4, восстановленными in vitro (16,1 ± 5,5 МПа против ~11,3 ± 4,1 МПа, соответственно, см.) [ 18 ].

    Одним правдоподобным и захватывающим объяснением этой интригующей повышенной жесткости нуклеосом ex vivo является связывание линкерного гистона h2 с нуклеосомой h4.Линкерный гистон присутствует в полумолярной эквивалентности с каноническими нуклеосомами у большинства эукариот [ 56 ] и считается связанным с любой другой нуклеосомой [ 57 ]. Альтернативными источниками может быть внутренняя гетерогенность канонических нуклеосом, возникающая из-за различных последовательностей ДНК, модификаций ДНК, модификаций гистонов, белков, связывающих нуклеосомы, и активных процессов на хроматиновых волокнах. Тем не менее, диапазон эластичности объемных нуклеосом находится в пределах диапазона, наблюдаемого in vitro .Таким образом, эти эксперименты служат доказательством того, что наша адаптация анализа наноиндентирования может быть применена к хроматину, извлеченному из ядер клеток человека.

    Для дальнейшего изучения механических характеристик нуклеосом, полученных ex vivo из , связанных со специфическими партнерами, мы экстрагировали хроматин из клеток HeLa, как указано выше [ 18 , 42 ]. Хроматин расщепляли MNase и экстрагировали в течение 6–12 часов при 4°C [ 42 ]. Чтобы количественно оценить количество и качество высвобождаемого таким образом хроматина, 1.5% агарозный гель следует запускать с изолированными фрагментами ДНК. Качественное расщепление и очистка хроматина не должны быть размытыми, но должны иметь поразительную лестницу фрагментов с кратным единичным повтором, как впервые наблюдали Hewish и Burgoyne [ 58 ]. Смазанная лестница обычно отражает расщепленный хроматин, как и большие преципитаты в сольвате. Длина лестницы отражает длину фрагментов хроматина, высвобождаемых из расщепления MNase. Далее для очистки определенной фракции хроматина на этих образцах проводят иммунопреципитацию (ЧИП).В нашем случае, чтобы выделить кинетохорный связанный центромерный хроматин, мы использовали проверенное антитело против внутреннего кинетохорного белка CENP-C. Эффективность ChIP была дополнительно подтверждена вестерн-блоттингом после SDS-PAGE белков в IP (). Следующий эксперимент требует проверки того, что интересующие белки действительно обогащены IP и что хроматин имеет высокое качество. Следует проявлять осторожность, чтобы постоянно поддерживать хроматин в физиологических буферах с минимум 2 мМ MgCl 2 и буфером, содержащим 75 мМ NaCl, а также ингибиторами протеазы и нуклеазы для предотвращения деградации.В наших руках хроматин, хранившийся более нескольких дней при 4°С, обычно имеет худшее качество, чем свежеприготовленный хроматин. Действительно, мы настоятельно рекомендуем работать с протоколом в одном потоке, от извлечения ядер до АСМ-анализа в течение 48 часов.

    (a) Продукты ДНК после расщепления MNase во времени разделяли на 1% агарозном геле. ( b ) Образцы CENP-C N-ChIP, полученные в результате расщепления MNase во времени, были разрешены на 4–20% SDS Page и окрашены общим белком.( c ) Вестерн-блот-анализ CENP-C ChIP после временной динамики MNase показал, что после 6-минутного расщепления MNase CENP-C ChIP почти исключительно вытягивает нуклеосомы CENP-A.

    Затем мы адаптировали наш протокол наноиндентирования для анализа механических характеристик очищенных комплексов CENP-C (CENP-C ChIP). Во-первых, при визуальном анализе мы наблюдали высокие структуры (8,3 ± 1,8 нм), связанные с нуклеосомами (, )). Здесь мы обнаруживаем, что значения модуля Юнга комплексов CENP-C составляют ~ 36 МПа, что более чем в два раза превышает жесткость объемных канонических нуклеосом h4 (16 МПа) ().Ранее мы сообщали, что рекомбинантные нуклеосомы CENP-A in vitro являются достаточно эластичными при 6 МПа по сравнению с нуклеосомами h4 (~11 МПа) или рекомбинантным пептидом CENP-C CD , связанным с нуклеосомами CENP-A (~15 МПа). МПа) (). Эти данные свидетельствуют о том, что комплекс CENP-C является жестким (~ 36 МПа) по сравнению с нативным полимером хроматина.

    Потребуются дополнительные эксперименты с использованием антител и мутаций других белков кинетохор, чтобы расшифровать, какие из 40+ членов кинетохор придают такую ​​жесткость.Еще более интригующе то, что эти данные приводят нас к предположению, что жесткость является эмерджентным и обратимым свойством взаимосвязанной бустрофедоноподобной сети [ 59 ], предложенной Биллом Эрншоу и его коллегами, и пружиноподобной растяжимой природой внутреннего кинетохорного хроматина. волокно, предложенное Керри Блумом и его коллегами [ 10 ].

    Применение в будущем

    Макромолекулярные структуры создают важные свойства механической силы, такие как эластичность, вязкость и тепловое движение [ 59 ].Волокна хроматина обладают уникальными механическими свойствами, которые способствуют его функционированию [ 60 ]. Здесь мы описываем адаптации наших недавно разработанных инструментов наноиндентирования одной молекулы [ 18 ], применяемых к объемному хроматину, очищенному от клеток человека. Интересно, что мы обнаружили, что массивные нуклеосомы были значительно более жесткими по сравнению с , воссозданными in vitro нуклеосомами h4. Это наблюдение может быть вызвано несколькими факторами. В ядре отношение равно 0.5 линкерных гистонов h2 для каждой коровой частицы [ 57 ]. h2 связывается с нуклеосомной диадой, фиксируя входную и выходную цепи ДНК [61, 62]. Вполне возможно, что это взаимодействие делает нуклеосомы ригидными, хотя формально это никогда не демонстрировалось. В отличие от нуклеосом, восстановленных in vitro , экстрагированные нуклеосомы различаются по своему гистоновому составу и репертуару посттрансляционных модификаций. Действительно, давно известно, что массивы нуклеосом могут складываться в 30-нм волокна in vitro [ 63 65 ], но в нескольких недавних исследованиях с использованием криоЭМ томографии на ядрах человека наблюдались цепи хроматина, различающиеся по размеру между 5 и 24 нм [ 66 68 ].Также возможно, что другие связывающие хроматин белки и РНК, которые связываются с хроматином, изменяют его механическую природу неизвестным до сих пор образом. В целом то, как эти факторы изменяют механический ответ хроматинового волокна и как это физически воздействует на динамику хроматина, является захватывающим направлением, которое еще не исследовано в этой области.

    Во-вторых, мы применили наш метод к комплексам CENP-C, очищенным от клеток человека. В этом случае мы наблюдаем, что эти большие комплексы значительно более жесткие по сравнению с нуклеосомами из объемного хроматина.В нашем исследовании in vitro (Melters et al. 2019) фрагмент CENP-C укреплял нуклеосомы CENP-A, что в клетках человека коррелировало со сниженным присутствием РНК-полимеразы 2 в центромерном хроматине, когда CENP-C был сверхэкспрессирован. Вместе эти данные указывают на то, что кинетохора может образовываться на ригидном хроматине CENP-A, тем самым изменяя доступность хроматина. Будет интересно выяснить, как белки, связывающие нуклеосомы, модифицируют индивидуальные нуклеосомы и как эти модификации изменяют доступность хроматиновых волокон.Действительно, изменения доступности хроматина наблюдались как при раке, так и при старении [ 69 72 ]. Мы и другие задокументировали, что при многих типах рака человека CENP-A сверхэкспрессирован и эктопически локализован в неоцентромерных точках разрыва. Один из таких локусов, как мы показали ранее, включает регион 8q24/Myc, давно связанный с нестабильностью генома [73]. Поскольку нуклеосомы CENP-A обладают высокой эластичностью по сравнению с h4, вполне возможно, что в раковом геноме они накапливаются в неподходящих субтеломерных местах в результате неожиданного механического результата; альтернативно, образование слабых кинетохор как такое расположение может сделать их восприимчивыми к повреждению ДНК из-за неожиданной жесткости, придаваемой кинетохорным комплексом.Эти неисследованные изменения в содержании и качестве гистонов в пораженной ткани должны стать обширной областью исследований.

    Другие приложения этой методологии относятся к эволюции хроматиновой механики. Хотя все центромеры способствуют правильному расхождению хромосом, лежащая в основе ДНК и центромерные и кинетохорные белки быстро развиваются [74, 75]. Несмотря на эти эволюционные изменения, уникальная структура хроматина центромер, наблюдаемая с помощью световой микроскопии, в целом хорошо сохранилась.Следовательно, представляет интерес изучить, насколько консервативны механические свойства центромерного хроматина у разных видов. Это поможет понять, как эти эпигенетические стратегии развиваются, и их вклад в биологические функции.

    То, как геномная ДНК становится доступной в нужное время, в нужной клетке и в правильном порядке, жизненно важно для выживания организма. Молекулярный состав хроматина, особенно варианты гистонов, PTM и факторы связывания хроматина, вносят вклад в механобиологические свойства хроматинового волокна.Кроме того, топология ДНК, индуцированная либо молекулярными механизмами, составом последовательности, либо вторгающимися РНК, также может влиять на биомеханические свойства нуклеосом и хроматинового волокна. Следовательно, как подробно описано в этом методе, анализ биомеханических характеристик нуклеопротеиновых комплексов с разрешением одной молекулы обеспечивает широко применимый экспериментальный инструмент, с помощью которого можно расшифровать увлекательный новый уровень регуляции эукариотического генома [76].

    Добавить комментарий

    Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *