Разное

Лада гранта технические характеристика: LADA Granta седан — Официальный сайт LADA

Содержание

Технические характеристики Лада Гранта лифтбек 2022

Ниже представлены основные технические характеристики новой Лада Гранта Лифтбек для российского рынка.

В таблице приведены основные параметры: габаритные размеры, расход топлива (бензина), дорожный просвет (клиренс), масса (вес), объем багажника и бака, двигатели, коробки передач, тип привода, динамические характеристики и т.д.

Кузов

Тип кузовахэтчбек
Класс автомобилякласс B
Длина / ширина / высота, мм4250 / 1700 / 1500
Колесная база, мм2476
Клиренс (дорожный просвет), мм160
Объем багажника, л520
Снаряженная масса, кг1058 — 1100
Объем топливного бака, л50

Двигатель и трансмиссия

Тип двигателябензинбензин
Объем, л1,6
1,6
Мощность, л.с.87106
Крутящий момент, Нм140148
Тип коробки передачмеханикамеханика
Число передач55
Приводпереднийпередний
Разгон 0-100 км/ч, с11,810,6
Макс скорость, км/ч171183
Расход топлива, л  
— город9,18,7
— трасса5,35,2
— смешанный6,86,5
Тип топливаАИ-95АИ-95

Двигатель и трансмиссия

Тип двигателябензинбензин
Объем, л1,61,6
Мощность, л.с.10698
Крутящий момент, Нм
148
145
Тип коробки передачроботавтомат
Число передач54
Приводпереднийпередний
Разгон 0-100 км/ч, с12,113,3
Макс скорость, км/ч183174
Расход топлива, л  
— город8,79,9
— трасса5,26,1
— смешанный6,57,2
Тип топливаАИ-95АИ-95

Дополнительную техническую информацию уточняйте у официальных дилеров.

Технические характеристики Lada Granta

В данной статье приведены технические характеристики для автомобиля Lada Granta в различных комплектациях (стандарт, норма, люкс). На настоящий момент у «АвтоВАЗа» несколько комплектаций в одной группе если так можно сказать. Так для стандарта возможна только одна вариация:

— 1,6 л 8-кл. (82 л.с.), МКПП;
для норма возможно 4 вариации:
-1,6 л 8-кл. (87 л.с.), МКПП
-1,6 л 8-кл., МКПП 2181
-1,6 л 16-кл., МКПП 2181
-1,6 л 16-кл., АКПП;
для люкса 2 вариации:
— 1,6 л 16-кл., МКПП 2181
— 1,6 л 16-кл., АКПП.

 Безопасность  Lada Granta  стандарт  норма  люкс
 Инерционные ремни безопасности  +  +  
 Инерционные ремни с преднатягом      +
 Подушка безопасности водителя  +  +  +
 + подушка безопасности для переднего пассажира      +
 подголовники задних сидений      +
 ABS-BAS      +
 Экстерьер Lada Granta  стандарт  норма   люкс
 Бамперы неокрашенные  +    
 Бамперы окрашенные в цвет кузова    +  +
 Дневной ходовой огонь в фаре  +  +  +
 Диски колес штампованные 13  +    
 Диски колес штампованные 14    +  
 Диски колес литые 14      +
 Колпаки колес  
 +
 
 Молдинг решетки радиатора    +  +
 Зеркала окрашенные в цвет кузова      +
 Рамки дверей черные      +
 Интерьер Lada Granta  стандарт   норма  люкс
 Обивка дверей с вставками    +  +
 Раздельное заднее сидение      +
 Облицовка порогов пола      +
 Уплотнители порогов пола      +
 Контейнер для очков      +
 Комфорт Lada Granta  стандарт  норма  люкс
 Рулевая колонка с регулировкой по высоте    +  +
 Электроусилитель руля    +  +
 Передние электростеклоподъемники    +  +
 Задние элетростеклоподъемники      +
 Стекла бесцветные  +  +  
 Стекла атермальные      +
 Поручни 3 шт.      +
 Воздушный фильтр салона    +  +
 Климатическая система с кондиционером      +
 Приовод и обогрев наружных зеркал      +
 Обогрев передних сидений      +
 Электропривод крышки багажника    +  +
 Электроника Lada Granta  стандарт   норма  люкс
 Центральный замок    +  +
 Бортовой компьютер    +  +
 Охранная сигнализация    +  +
 Дистанционное управление замками дверей и багажника      +
 Аудиосистема      +

Рис 1 Габаритные размеры автомобиля Lada Granta

 Технические характеристики Lada Granta  стандарт
(1,6 л 8 кл. 82 л.с.)
 норма
(1,6 л 8 кл. 87 л.с.)
облегченная
шатунно поршневая группа
 люкс
(1,6 л 16 кл. 98 л.с.)
Двигатель 21126 Лада Приора
 Длина, мм  4260  4260  4260
 Ширина, мм  1700  1700  1700
 Высота, мм  1500  1500  1500
 База, мм  2476  2476  2476
 Колея передняя, мм  1430
 1430
 1430
 Колея задняя, мм  1426  1426  1426
 Передний свес,мм  804  804  804
 Задний свес, мм  980  980  980
 Минимальный дорожный просвет, мм  160  160  160
 Объем багажного отделения, л  480  480  480
 Масса снаряженная, кг  1040  1080  1100
 Распределение снаряженной массы по осям %  59/41  59/41  59/41
 Полезная нагрузка, кг  475  475  475
 Полная масса, кг  1515  1555  1575
 Распределение полной массы по осям %  50/50  50/50  50/50
 Масса прицепа с тормозами /без тормозов, кг  900/450  900/450  900/450
 Коэффициент аэродинамического сопротивления  0,367  0,367  0,353
 Время разгона от 0 до 100 км/час  12,5  11,8  12
 Максимальная скорость км/час  164,5  167  168,5
 Расход топлива л/100 км      
 — в городском  9,3  8,5  8,7
 — в загородном  6,1  5,7  5,8
 — в смешанном  7,3  7,2  7,3
 Размер шин  175/70 R13  175/65 R14  175/65 R14
 Емкость топливного бака, л  50  50  50

Далее приведены характеристики трансмиссии, ходовой части, рулевого управления, тормозной системы и электрооборудования автомобиля Лада Гранта

Технические характеристики ВАЗ (Lada) Granta Cross универсал 5-дв. I Рестайлинг

Кузов

  • Тип кузова
  • Количество мест
  • Длина
  • Ширина
  • Высота
  • Колёсная база
  • Колея передняя
  • Колея задняя
  • Снаряженная масса
  • Дорожный просвет
  • Объем багажника максимальный
  • Объем багажника минимальный
  • Полная масса
  • Нагрузка на переднюю/заднюю ось
  • Грузовой отсек (Длина x Ширина x Высота)
  • Грузоподъёмность
  • Разрешённая масса автопоезда
  • Погрузочная высота
  • Объём грузового отсека

Двигатель

  • Тип двигателя
  • Объем двигателя
  • Мощность двигателя
  • Обороты максимальной мощности
  • Максимальный крутящий момент
  • Тип впуска
    • Непосредственный впрыск
  • Расположение цилиндров
  • Количество цилиндров
  • Количество клапанов на цилиндр
  • Тип наддува
  • Диаметр цилиндра
  • Ход поршня
  • Обороты максимального крутящего момента
  • Наличие интеркулера

Эксплуатационные показатели

  • Марка топлива
  • Максимальная скорость
  • Разгон до 100 км/ч
  • Объём топливного бака
  • Экологический стандарт
  • Расход топлива в городе на 100 км
  • Расход топлива на шоссе на 100 км
  • Расход топлива в смешанном цикле на 100 км
  • Запас хода

Трансмиссия и управление

  • Тип КПП
  • Количество передач
  • Привод
  • Диаметр разворота

Подвеска и тормоза

  • Передние тормоза
    • Дисковые вентилируемые
  • Задние тормоза
  • Передняя подвеска
    • Независимая, пружинная
  • Задняя подвеска
    • Полунезависимая, пружинная

технические характеристики и эксплуатационные преимущества » НаДомкрат

С 2011 года на транспортном рынке появилась новая разработка Волжского автозавода – Лада Гранта. Она привлекает внимание доступной стоимостью, аккуратным внешним видом, комфортным интерьером салона, хорошими техническими характеристиками. Потребителям предлагается широкая линейка моделей ТС. Машины от АвтоВАЗ по праву входят в число наиболее популярной техники отечественного производства.

 

Основные технические характеристики Лада Гранта

 

Чтобы купить Лада Гранта во Владимире, можно воспользоваться услугами официального интернет-сайта производителя.Длина машины составляет 4260 мм, ширина – 1700 мм, а высота – 1500 мм. Ее устойчивость на транспортной магистрали обеспечивается за счет увеличенной колеи. Впереди она составляет 1430 мм, а на задней оси – 1414 мм. Масса автомобиля находится в пределах 900-1160 кг, в зависимости от оснащенности и комплектации.

 

Транспортное средство, созданное на базе Лада-Калина, имеет несколько отличительных особенностей:

 

    • увеличенное багажное отделение с объемом 520 литров;

 

    • наличие складывающейся спинки заднего пассажирского дивана;

 

    • измененные настройки подвески;

 

    • качественное улучшение управляемости машины.

 

Для машины Лада Гранта предлагается несколько вариантов ДВС, что позволяет удовлетворить требования каждого покупателя. Показатели количества лошадиных сил в моторах варьируются в пределах 82-106. Трансмиссия начинается с традиционной механической пятиступенчатой версии и заканчивается роботизированной коробкой передач и гидротрансформаторным автоматом.

 

Преимущества эксплуатации автомобиля Лада Гранта

 

Основное преимущество для автомобилистов – это возможность купить седан LadaGranta по доступной стоимости. Отличные настройки силовых установок и грамотный выбор передаточного числа трансмиссий позволяет добиться экономного расходования топливных ресурсов. В процессе передвижения машины по ровной трассе на 100 км потребуется не более 6,5 литров бензина. В условиях городских улиц количество горючего может увеличиться до 10 литров.

 

Экстерьер автомобиля отличается широким бортом массивной арки, большим капотом, крупными фарами. Высокая крышка багажника способствует увеличению пространства для перевозимых вещей. Автомобили с улучшенной комплектацией дополняются окрашенными в цвет кузова бамперами, зеркалами заднего вида, дверными ручками.

Технические характеристики / LADA Granta Cup / Для кольцевых гонок / Автомобили / TMS Motorsport

Общая информация

Модель гоночного а/м219000-027-01
Модель базового а/м219000-020-00
НазначениеАвтомобильные кольцевые гонки
Зачетная группа«Супер-продакшн»
ОмологацияRAF A 1101
Тип кузоваседан
Число мест1
Снаряженная масса (кг)1030
Полная с пилотом (кг)Min — 1050, max — 1195

Модель гоночного а/м: 219000-027-01

Модель базового а/м: 219000-020-00

Назначение: Автомобильные кольцевые гонки

Зачетная группа: «Супер-продакшн»

Омологация: RAF A 1101

Тип кузова: седан

Снаряженная масса (кг): 1030

Полная с пилотом (кг): Min — 1050, max — 1195

Габаритные размеры

Длина, мм4275
Ширина, мм1810
Ширина над передней осью1810
База, мм2555

Ширина над передней осью: 1810

Двигатель

Модель двигателя211262-045-01
Базовый ДВС21126-081
Рабочий объём1,6 л (1597 см2), рядный, 4 цилиндра
Диаметр цилиндра, мм82.0 мм
Ход поршня, мм75.6 мм
Степень сжатия9,1
Мощность247 лс. при 5700 об/мин.
Максимальный крутящий момент310 н.м. при 5500-6200 об/мин.
Максимальные обороты7000 об/мин.
Топливос октановым числом не менее 100

Модель двигателя: 211262-045-01

Базовый ДВС: 21126-081

Рабочий объём: 1,6 л (1597 см2), рядный, 4 цилиндра

Диаметр цилиндра, мм: 82.0 мм

Ход поршня, мм: 75.6 мм

Степень сжатия: 9,1

Мощность: 247 лс. при 5700 об/мин.

Максимальный крутящий момент: 310 н.м. при 5500-6200 об/мин.

Максимальные обороты: 7000 об/мин.

Топливо: с октановым числом не менее 100

Конструктивные особенности

Поршенькованый из алюминиевого сплава
Шатунстальной L=128,6 мм, мин. Н-образный
Контроллер управления ДВСуправления ДВС — «Корвет» производства АБИТ
Впускной коллекторTMS
Система охлажденияИнтеркуллер
Насос масляныйувеличенной производительности
Картер масляныйстальной сварной
Шестерни насосастальной
Воздушный фильтрнулевого сопротивления
Опоры двигателяжесткие
Топливный бакоригинальный

Поршень: кованый из алюминиевого сплава

Шатун: стальной L=128,6 мм, мин. Н-образный

Контроллер управления ДВС: управления ДВС — «Корвет» производства АБИТ

Впускной коллектор: TMS

Система охлаждения: Интеркуллер

Насос масляный: увеличенной производительности

Картер масляный: стальной сварной

Шестерни насоса: стальной

Воздушный фильтр: нулевого сопротивления

Опоры двигателя: жесткие

Топливный бак: оригинальный

Трансмиссия

КПП7796
Передаточные числаДанные приведены в таблице на фото
Сцеплениеоднодисковое металлокерамическое диаметра 184 мм
Привод переключениясеквентальный с системой Power Shift*
Приводы колесс промежуточным валом и опорой
Дифференциалсамоблокирующийся

Передаточные числа: Данные приведены в таблице на фото

Сцепление: однодисковое металлокерамическое диаметра 184 мм

Привод переключения: секвентальный с системой Power Shift*

Приводы колес: с промежуточным валом и опорой

Дифференциал: самоблокирующийся

Рулевое управление

Рулевое управлениес гидроусилителем

Рулевое управление: с гидроусилителем

Тормозная система

Тормозная системаДвухконтурная без системы АБС
Передний тормоздиск Ø 330х28 мм. вентилируемый плавающий с алюминиевой ступицей, суппорт 4-х поршневой AP
Задний тормоздиск Ø 260х9,5 мм., суппорт 2-х поршневой AP
Регулятор тормозных усилийAP Racing

Тормозная система: Двухконтурная без системы АБС

Передний тормоз: диск Ø 330х28 мм. вентилируемый плавающий с алюминиевой ступицей, суппорт 4-х поршневой AP

Задний тормоз: диск Ø 260х9,5 мм., суппорт 2-х поршневой AP

Регулятор тормозных усилий: AP Racing

Подвеска

Подрамниксварной усиленный
Рычаги передней подвескисварные с регулировкой развала/схождения
Кулаки передней подвескиоригинальные
Ступица передних колесстальная 4 шпилек на Ø98 мм
Рычаги задней подвескис упругой поперечиной с регулировкой развала/схождения
Стабилизаторыоригинальные регулируемые
Амортизаторыс регулировкой усилия; по 2-м скоростям сжатия; по 1-ой скорости отбоя
Пружинысоставные с подпружинником

Подрамник: сварной усиленный

Рычаги передней подвески: сварные с регулировкой развала/схождения

Кулаки передней подвески: оригинальные

Ступица передних колес: стальная 4 шпилек на Ø98 мм

Рычаги задней подвески: с упругой поперечиной с регулировкой развала/схождения

Стабилизаторы: оригинальные регулируемые

Амортизаторы: с регулировкой усилия; по 2-м скоростям сжатия; по 1-ой скорости отбоя

Пружины: составные с подпружинником

Колеса

Колеса9,0 – 17” кованые из алюминиевого сплава РСD 98 мм.; ЕТ 22 мм
Шины245-610-17 типа Слик

Колеса: 9,0 – 17” кованые из алюминиевого сплава РСD 98 мм.; ЕТ 22 мм

Шины: 245-610-17 типа Слик

Кузов

Каркас безопасностивварной из труб стальных 30ХГСА
ОмологацияRAF
Вес48 кг

Каркас безопасности: вварной из труб стальных 30ХГСА

Омологация: RAF

Специальное оборудование

Сиденья омологированные+
Ремни безопасности 6-ти точечные+
Опоры сидений металлические омологированные+
Дополнительные замки капота+
Система пожаротушения+
Травмобезопасные накладки на каркас+
Флокированная панель приборов+ (опционное предложение)
Защитная сетка на окно водителя+
Люк в крышу+
Поликарбонат вместо стекол+
Приборная панель AIM+

Сиденья омологированные: +

Ремни безопасности 6-ти точечные: +

Опоры сидений металлические омологированные: +

Дополнительные замки капота: +

Система пожаротушения: +

Травмобезопасные накладки на каркас: +

Флокированная панель приборов: + (опционное предложение)

Защитная сетка на окно водителя: +

Поликарбонат вместо стекол: +

Приборная панель AIM: +

Технические характеристики Лада Гранта

Технические характеристики Лада Гранта

16

ТХ Лада Гранта: габариты кузова, объём двигателя, расход бензина и другие технические характеристики Lada Granta

280495

Гарантия лучшей цены

Автомобили с ПТС в наличии

Подарок на выбор при покупке

Конфигуратор

Белый «Белое облако» (240)

Черный «Пантера» (672)

Ярко-синий «Голубая планета» (418)

Серебристый «Рислинг» (610)

Серебристо-темно-серый «Борнео» (633)

Золотисто-коричневый «Кориандр» (790)

только до 18 Апреля

Кредит от 2 495 Р/мес

на Granta при покупке с сайта

Ваш персональный менеджер свяжется с вами в течение 5 минут

Кредит от 7.9%

Одобрили 174 946 заявок

Рассрочка от 0%

Ответ за 30 мин

Lada Granta


Технические характеристики
Характеристика1.6 МТ 87 л.с. бензин передний1.6 МТ 106 л.с. бензин передний1.6 AT 98 л.с. бензин передний
Краткая информация
Объем 1.6
Мощность 87 106 98
Коробка механика механика автомат
Топливо АИ-95
Запас хода 0
Разгон 11.6 10.5 13.1
Расход 6.8 6.5 7.2
Общая информация
Страна марки
Класс автомобиля B
Количество дверей 4
Количество мест 5
Безопасность
Оценка безопасности
Название рейтинга
Размеры, мм
Длина 4268
Ширина 1700
Высота 1500
Колёсная база 2476
Клиренс 180 180 165
Ширина передней колеи 1430
Ширина задней колеи 1414
Размер колёс 175/65/R14 185/60/R14 185/55/R15
Объём и масса
Объем багажника мин/макс, л 520/815
Объём топливного бака, л 50
Снаряженная масса, кг 1075
Полная масса, кг 1560
Трансмиссия
Коробка передач механика механика автомат
Количество передач 5 5 4
Тип привода передний
Подвеска и тормоза
Тип передней подвески независимая, пружинная
Тип задней подвески полунезависимая, пружинная
Передние тормоза дисковые вентилируемые
Задние тормоза барабанные
Эксплуатационные показатели
Максимальная скорость, км/ч 172 184 176
Разгон до 100 км/ч, с 11.6 10.5 13.1
Марка топлива АИ-95
Экологический класс Euro 5
Выбросы CO2, г/км 0
Расход топлива, л город/трасса/смешанный
Расход топлива, л смешанный
Расход топлива, л город/смешанный
Расход топлива, л город/трасса
Расход топлива, л город
Расход топлива, л трасса
Расход топлива, л трасса/смешанный
Двигатель
Тип двигателя бензин
Расположение двигателя переднее, поперечное
Объем двигателя, см³ 1596
Тип наддува нет
Максимальная мощность, л.с./кВт при об/мин 87 / 64 при 5100 106 / 78 при 5800 98 / 72 при 5600
Максимальный крутящий момент, Н*м при об/мин 140 при 3800 148 при 4200 145 при 4000
Расположение цилиндров рядное
Количество цилиндров 4
Число клапанов на цилиндр 2 4 4
Система питания двигателя распределенный впрыск (многоточечный)
Степень сжатия 10.5 11 11
Диаметр цилиндра и ход поршня, мм 82 × 75.6
Аккумуляторная батарея
Запас хода на электричестве, км 0
Емкость батареи, кВт⋅ч 0
Время зарядки, ч 0

Другие автомобили Lada

Brilliance

Suzuki

Audi

Dongfeng

Zotye

Opel

Foton

Ford

Gac

Subaru

Cheryexeed

Mazda

Ravon

Toyota

Peugeot

Citroen

Hawtai

Ssangyong

Honda

Datsun

Lada

Hyundai

Renault

Volkswagen

Nissan

Changan

Chery

Chevrolet

Kia

Faw

Geely

Haval

Jac

Lifan

Förster Resonance Energy Transfer (FRET) Microscopy

00:00:12.06 На этом семинаре я подробно расскажу о том, как визуализировать
00:00:15.10 молекулярные взаимодействия в клетках с помощью флуоресценции
00:00:18.22 резонанса передача энергии. Таким образом, этот семинар организован следующим образом:
00:00:24.00. Я начну с принципов резонансной передачи энергии флуоресценции
00:00:27.06. Затем я расскажу о соответствующих параметрах
00:00:30.24, которые важно понимать для измерения
00:00:34.08 специфических молекулярных взаимодействий. Я собираюсь вкратце обсудить
00:00:39.08 хорошие пары флуоресцентных белков для измерения переноса энергии
00:00:43.03 для каждого взаимодействия. А затем я собираюсь обсудить подходы
00:00:47.28 к изображению FRET под микроскопом. И здесь есть определенный порядок
00:00:52.00, где я начинаю с наименее количественного,
00:00:55.05, но самого простого способа измерения, и по мере того, как мы движемся дальше, он становится
00:00:58.09 усложняется, когда мы получаем больше количественной информации
00:01:00.21 о молекулярных взаимодействиях в клетках.
00:01:03.08 Итак, идея использования резонансной передачи энергии флуоресценции
00:01:07.07 для измерения молекулярных взаимодействий основана на обнаружении
00:01:11.02 совпадений молекул. Обычно, что вы делаете, когда хотите
00:01:17.09 обнаружить взаимодействия молекул, скажем, в биохимическом
00:01:19.25 эксперименте, вы тянете вниз одну из молекул и смотрите, что
00:01:23.15 получается вниз. Так что это своего рода прямая мера взаимодействия.
00:01:26.02 В этом случае мы в основном смотрим на взаимодействие, выводящее взаимодействие
00:01:29.26 по совпадению в пространстве. Теперь это можно сделать с помощью микроскопа.
00:01:33.27 И проблема с обычным широкопольным микроскопом заключается в том, что
00:01:38.29 в некотором смысле дифракционные пределы являются наблюдаемыми элементами.
00:01:42.23 Таким образом, типичный объемный элемент, который можно разрешить с помощью широкопольного микроскопа
00:01:46.12, имеет порядок фемтометра, что соответствует
00:01:49.-22. Итак, мы имеем разницу в этих масштабах на несколько порядков
00:02:04.21. Теперь вы можете использовать колокализацию
00:02:09.09, чтобы сделать вывод о взаимодействии, но вероятность того, что у вас есть
00:02:13.28 взаимодействие, когда вы видите колокализацию, очень мала.
00:02:17.09 Итак, как мы можем улучшить его и как мы можем использовать FRET
00:02:19.17, чтобы фактически уменьшить этот объем обнаружения?
00:02:23.17 Итак, сначала позвольте мне обсудить, что такое FRET на самом деле.
00:02:27.16 Итак, флуоресцентный резонансный перенос энергии является безызлучательным
00:02:31.08 передачи, и слово «безызлучательная» имеет важное значение. Это не
00:02:34.13 тривиальное излучение фотона, а реабсорбция акцептором.
00:02:39.18 Это механизм диполь-дипольной связи. Так что это безызлучательный
00:02:42.26 перенос энергии между соседними флуорофорами.
00:02:45.16 Теперь, если вы обычно возбуждаете донора, скажем, синим светом,
00:02:50.08 в данном случае это GFP. Он очень быстро релаксирует из высоковозбужденного состояния
00:02:54,26 путем взаимопревращения или препаративной релаксации к первому электрону
00:02:59.05 возбужденное состояние. Оттуда он может сделать несколько вещей, он может вернуться в основное состояние
00:03:03.03 путем безызлучательного взаимопревращения при распаде. Или
00:03:07.02 он может излучать фотон. Если у вас есть связь с акцептором,
00:03:13.03 диполь-дипольная связь, то у вас есть дополнительный канал
00:03:16.14 безызлучательного распада с меньшим временем жизни состояний. Это означает, что
00:03:22.06 акцептор — простите, донор будет излучать меньше света.
00:03:25.20 Таким образом, вы получаете гашение донора, когда происходит FRET.
00:03:29.03 В то же время акцептор этим процессом возбуждается.
00:03:34.21 Опять же, это не поглощение фотона, это диполь-дипольное взаимодействие
00:03:38.06, и он возбуждается и затем начинает излучать флуоресценцию.
00:03:41.23 Таким образом, вы получаете излучение от акцептора
00:03:46.23 из-за этого процесса. Итак, что мы делаем, так это то, что мы не можем напрямую
00:03:51.04 измерить FRET, это не наблюдаемая величина, но мы можем
00:03:55.06 вывести FRET из изменения фотофизических свойств
00:03:58.22 или излучение донора или акцептора. Итак, вот
00:04:05.04 несколько важных параметров, которые вы можете использовать для количественной оценки FRET. Одним из них является эффективность FRET. А эффективность FRET
00:04:15,22 — это, по сути, число возбужденных доноров, передающих
00:04:19,21 энергию акцептору, деленное на число фотонов
00:04:24,01, поглощенных донором. Это составляет, конечно, число
00:04:29.29 возбужденных доноров. Так что в основном это часть доноров, которые
00:04:34.13 передают энергию акцептору. Вы также можете выразить это на языке скоростей
00:04:39.04, это скорости передачи, секунды минус один.
00:04:42.21 Итак, здесь мы имеем в основном отношение скорости передачи
00:04:46.22 к общей скорости возбуждения донора.
00:04:51,29 Какова скорость передачи, опять же, плюс сумма
00:04:55,20 безызлучательного распада в основное состояние и
00:04:57,24 излучательного распада в основное состояние или перехода в земля
00:05:00.19 штат. Можно показать, что эффективность равна этому соотношению
00:05:06,06, где вы видите два параметра. Единица — это радиус Форстера,
00:05:12,16 или ноль — это важный параметр, он представляет собой расстояние
00:05:16,23, на котором эффективность составляет 50%, то есть половина возбужденного донора
00:05:20,03 молекулы переходят к акцептору. Обычно это порядка
00:05:23,28 нанометров. Таким образом, вы получаете этот процесс, происходящий в нанометровом диапазоне.
00:05:29.18 Он также появляется здесь, и здесь у нас есть в основном расстояние
00:05:33.6 зависимость, что делает ее очень крутой зависимостью.
00:05:40.10 Итак, эффективность — это способ измерения расстояний между
00:05:46.24 донором и акцептором. Итак, здесь я изобразил эффективность FRET
00:05:53,03 как функцию расстояния между донором и акцептором
00:05:56,06 в единицах радиуса Форстера. Итак, если у вас есть радиус Форстера
00:06:00.18 или радиус 1, то здесь должна быть показана передача энергии 50%.
00:06:06.14 Дело в следующем, если у вас есть молекулы, которые не
00:06:12.05 взаимодействуют в растворе, среднее расстояние настолько велико, что вы не можете получить передачу энергии. Например, если у вас есть микромолярный раствор
00:06:21,05, среднее расстояние между молекулами
00:06:24,07 составляет порядка 100 нанометров, что составляет примерно
00:06:27,21 20 единиц. в этой шкале, которая далеко вправо.
00:06:31.06 Так что передачи энергии не будет. Однако, если вы дойдете до концентрации
00:06:35,02 на 1 миллимоляр, среднее расстояние станет чем-то вроде
00:06:38.02 примерно 10 нанометров, и мы приближаемся к этой точке через
00:06:41.14 здесь. Однако, когда мы экспрессируем белки в клетках, мы имеем
00:06:46,13, как правило, порядка 1-10 микромолярной концентрации,
00:06:50,21, и в растворе это не должно быть проблемой. Итак, мы далеко
00:06:53.12 здесь, так что мы не получаем этот тривиальный процесс FRET.
00:06:56.08 Это связано с концентрацией и средними молекулами.
00:06:59.26 Из-за резкой зависимости от расстояния у вас в основном есть
00:07:04.08 ситуация, когда никакое взаимодействие не дает вам FRET,
00:07:06.16 а взаимодействующие молекулы дают вам FRET. Итак, это наши параметры
00:07:14.18, которые определяют наш ноль. А здесь первый множитель
00:07:20.13, называемый квадратом каппа, на самом деле является геометрическим множителем.
00:07:25.15 Он определяется ориентацией переходных моментов,
00:07:29.23, которые являются переходными диполями. Когда две молекулы имеют
00:07:34,14 моментов перехода, процесс переноса становится
00:07:40.04 очень эффективны, у них есть коэффициент 4. Однако, когда они перпендикулярны, этот коэффициент в основном равен 0. Таким образом, вы можете получить ситуацию
00:07:47,08, когда два хромофора кажутся проксимальными, но они в
00:07:52.00 под прямым углом к ​​моментам перехода, так что вы не получите FRET.
00:07:53.21 В целом, этот коэффициент равен 2/3, что означает среднее значение по всем ориентациям. Это означает очень гибкие флуорофоры
00:08:04.02, которые движутся во всех направлениях. В основном во время передачи
00:08:07.09 вы пробуете все ориентации. Можно показать, что этот коэффициент
00:08:11.26 равен 2/3. К сожалению, для флуоресцентных белков хромофоры
00:08:17.27 встроены в ствол и достаточно жесткие. А переориентация
00:08:21.04 ствола довольно медленная по шкале времени передачи.
00:08:24.29 Это означает, что мы не можем выполнить это динамическое усреднение
00:08:28.19 для такого статического усреднения, которое мы получаем.Таким образом,
00:08:32.14 создает проблему, и это фактически мешает нам использовать
00:08:36.19 эффективность для вычисления расстояния между молекулами.
00:08:41.01 Однако все же изменение эффективности в комплексе скажет нам
00:08:45.08 если, например, происходит конформационное изменение.
00:08:48.21 Если вы поставите его на 2/3, мы действительно сможем сравнить различные пары флуоресцентных
00:08:55.09 белков с точки зрения эффективности переноса.
00:08:58.03 Я просто делаю это константой. Второй параметр здесь — это показатель преломления
00:09:04,24, который, скажем, для цитоплазмы установлен на 1,4.
00:09:09.16 Так что это более или менее константа, мы не слишком беспокоимся о
00:09:12.03. Этот коэффициент здесь является интегралом перекрытия.
00:09:19.22 Что представляет собой принцип резонанса, то есть перекрытие между
00:09:25.01 излучением донора и поглощением акцептора.
00:09:30.20 Показывает, насколько совпадают фактические уровни энергии.Чем больше они совпадают
00:09:34.18, тем лучше вы получите перевод. И это определяется интегралом
00:09:39.02, показанным здесь, который снова показывает спектр излучения,
00:09:41.24 спектр поглощения. Итак, здесь следует учитывать две вещи:
00:09:47,28 коэффициент ослабления акцептора является важным параметром. Чем он выше, тем эффективнее передача.
00:09:56.20 Итак, вы хотите иметь молекулы с высокой экстинкцией
00:10:01.05, чтобы увеличить ваш R0. Он представляет собой способность
00:10:05.20 молекулы поглощать фотоны. Другой важный фактор
00:10:09.29 — это лямбда до 4-го числа. Таким образом, интеграл перекрытия
00:10:14,06 становится выше, когда вы перемещаетесь в красную часть спектра
00:10:17,21, что означает, когда вы используете флуоресцентные белки
00:10:20,02, которые более в красной части спектра интеграл перекрытия
00:10:23.03 становится больше. И вы получите больший R0.
00:10:28.21 Квантовые выходы, указанные здесь, квантовые выходы донора.
00:10:35.17 Чем больше фотонов может быть испущено донором
00:10:39.09, когда он находится в возбужденном состоянии, тем лучше процесс переноса.
00:10:41.29 И это может быть максимально 1. Итак, вот некоторые значения R0
00:10:47.12, которые я сделал для нескольких доступных на данный момент флуоресцентных белков
00:10:51.26. И я начал с представления R0
00:10:55.28 для классической пары, голубого флуоресцентного белка и желтого
00:10:59.17 флуоресцентный белок. Эта пара часто использовалась в прошлом, потому что у нас не было выбора для других пар флуоресцентных белков.
00:11:06.11 R0 довольно умеренный, поэтому он близок к 5 нм, но в настоящее время
00:11:12.08 поскольку у нас может быть больше красных флуорофоров, мы можем
00:11:16.09 на самом деле увеличить наше R0, чтобы лучше обнаруживать взаимодействия.
00:11:19.03 Также у нас есть более качественные голубые флуоресцентные белки, например,
00:11:23.14, которые увеличивают квантовый выход, один из параметров которого был
00:11:25.24 важно для нашего R0, а значит увеличьте R0.
00:11:29.06 Так, например, этот лазурный является вариантом голубого флуоресцентного белка,
00:11:32.26 с акцепторным цитрином, который является вариантом желтого
00:11:35.13 флуоресцентного белка, уже имеет R0 из 5.3. Теперь, если мы используем, например,
00:11:40,24, mCitrine в качестве донора вместо акцептора,
00:11:44,05, у нас есть оранжевый флуоресцентный белок в качестве акцептора, мы переходим теперь
00:11:47,25 к почти 5,5 нм. Если мы используем цитрин с красным флуоресцентным белком
00:11:51.26 в качестве акцептора, мы можем приблизиться к 6 нм. Обычно это пары
00:11:58.23, которые мы используем в данный момент для обнаружения FRET, особенно
00:12:01.05 вот эта, цитрин и вишня. Они обладают очень хорошими свойствами складывания
00:12:05,14, и поэтому очень хорошо измеряют взаимодействия
00:12:08,11 в клетках с R0, близким к 6 нм.
00:12:12.09 Итак, вернемся к нашему обнаружению совпадений, если вы просто измерите
00:12:16.29 совпадение молекул путем колокализации с помощью микроскопа,
00:12:20.16 наш обнаруживаемый элемент объема слишком велик по сравнению с
00:12:24.12 для нашего объема, который мы обнаруживаем. Если вы теперь посмотрите на совпадение молекул
00:12:29,18 с помощью FRET, мы получим объем
00:12:32,27, который находится в том же порядке, что и объем молекул, которые
00:12:36,21 мы хотим обнаружить. Итак, мы находимся в области субсептометра или
00:12:40,23 масштаба субсептометра для R0, например, 4,6 нм.
00:12:45.11 Здесь важно отметить, что FRET не является техникой
00:12:49.16 для улучшения разрешения. Это не похоже на технику сверхвысокого разрешения.
00:12:52.07 Он дает вам сигнал о том, сколько молекул в объемном элементе
00:12:57.17 фактически взаимодействует, пропорционально количеству взаимодействующих молекул
00:13:00.08. Это важный момент. Так что нет
00:13:03.06 увеличения разрешения. Так что же мы на самом деле измеряем
00:13:07.29, когда измеряем FRET? Итак, разные подходы, но по факту
00:13:12.11 мы измеряем кажущуюся эффективность.И эта измеренная эффективность,
00:13:15.11, равна реальной эффективности, эффективности передачи, как определено только
00:13:19.26 для комплекса. Так там, где у вас есть ЛАД.
00:13:24.16 На самом деле это геометрический параметр, он дает
00:13:28.00 информацию о расстояниях и углах. В некотором смысле это
00:13:31.07 мера конформации молекулы. Кажущаяся эффективность
00:13:38,03 также пропорциональна доле взаимодействующих молекул
00:13:41.29 на каждый объемный элемент. И это действительно изображение, так что здесь
00:13:45.23 мы можем посмотреть на развитие реакции. Итак, сколько молекул
00:13:50,14 взаимодействует в этом конкретном элементе объема, который у нас есть
00:13:56,00, по сравнению с этим? На самом деле это биологически значимый параметр
00:14:01.00, который является локальным параметром, который дает нам реальную карту
00:14:05.23. В то время как эффективность не является локальным параметром, это на самом деле
00:14:13.09 глобальный параметр, который определяется только свойствами молекулы.
00:14:16.24 Я вернусь к этому дому. Итак, прежде чем я подробно остановлюсь на
00:14:25.06 различных подходах к измерению FRET в микроскопе,
00:14:27.15 необходимо рассмотреть один важный момент, а именно форму
00:14:32.04 спектра. Итак, когда вы смотрите на спектры поглощения,
00:14:35,29 всегда есть хвост в синей части спектра,
00:14:40,04 и крутой в красной части спектра. Это типично.
00:14:45.04 Когда вы посмотрите на спектр излучения, флуоресцентное излучение
00:14:49.13 спектров, они делают ровно наоборот. Они очень крутые
00:14:52.23 в синей части спектра, но тянутся к красной.
00:14:58.03 И поэтому мы можем специально возбуждать акцептор, видите ли
00:15:08.18 когда мы возбуждаем акцептор мы не возбуждаем донора, а
00:15:11.12 мы не можем возбуждают донора, не возбуждая акцептора.
00:15:15.13 Аналогично, мы можем обнаружить донора, не обнаруживая
00:15:21.18 акцептора, но не обнаруживая конкретно акцептора без
00:15:27.23 обнаружение донора. Таким образом, эти два специфических возбуждения акцептора
00:15:34,16, специфическое обнаружение донора, имеют отношение к тому, что я собираюсь
00:15:38,09 уточнить, когда мы будем говорить об измерениях для получения
00:15. :42.20 FRET — к FRET измерению под микроскопом.
00:15:45.27 Итак, это самый прямолинейный и простой подход
00:15:50.14, который часто использовался в прошлом. Это основано исключительно на том факте
00:15:56.11, что если у вас есть FRET, вы гасите донора, но вы
00:15:59.28 увеличивают интенсивность акцептора за счет сенсибилизированного излучения.
00:16:03.00 Таким образом, этим процессом вы возбуждаете акцептор. Итак, что вы делаете,
00:16:06.24 возбуждаете донора и измеряете изображение донора, то есть изображение излучения донора
00:16:14.09. И вы измеряете эмиссию акцептора
00:16:19.12, возбуждая донор. И вы видите, что у вас есть два изображения,
00:16:23,23, которые вы соотносите таким образом. Итак, возбуждение донора и эмиссия акцептора
00:16:26.27, возбуждение донора и эмиссия донора.
00:16:30.18 Теперь, потому что у нас есть проблема, что у нас все еще есть
00:16:34.09 красное возбуждение акцептора, и мы истекаем кровью через
00:16:37.28 донора, это работает только когда донор и акцептор
00:16:42.18 находятся в одной молекуле, то есть в одном и том же полипептиде.
00:16:46.28 Необходимо поддерживать постоянную стехиометрию донора и акцептора
00:16:53.06 в каждом пикселе. Так что это конкретно работает, например,
00:16:57,25 для датчиков типа хамелеона, которые могут измерять изменение
00:17:01.04 по физиологическому параметру, подобно кальцию, но также может измерять фосфорилирование. И снова приведу пример
00:17:05.09. Итак, у нас есть конструкция, которую вы можете измерить
00:17:11,16 логометрическим способом. Итак, это рецептор эпидермального фактора роста, его
00:17:15.05 имя ErbB-1, где у нас теперь в одной цепи донор
00:17:20.28 CFP, у нас есть домен PTB, специфически распознающий фосфотирозины,
00: 17:25.16 и у нас есть желтый флуоресцентный белок в качестве акцептора.
00:17:28.24 Поймите, что в какой бы конформации это уже не имело
00:17:33.14 базального FRET, вы видите только изменение конфигурации. Итак, изменение эффективности FRET на
00:17:37,26. Таким образом, это измерение дает вам относительную меру конформации молекулы.
00:17:46.12 Так что это очень легко реализовать. Можно сделать это на самых разных типах установок
00:17:51.16, таких как конфокальные установки или изображения с широким полем зрения,
00:17:54.08 с правильными наборами фильтров, это очень быстро, потому что вам просто нужно
00:17: 56.26 получают два изображения. Это не количественно, вы можете измерить только
00:17:59,29 различий в состояниях. И вам нужно поддерживать постоянную стехиометрию донора
00:18:04.05 и акцептора. Что в основном означает, что они должны быть одной и той же конструкцией
00:18:07.28. Вот пример того, как выглядит такой эксперимент
00:18:13.13. Итак, мы экспрессировали эту конструкцию в клетках Cos7
00:18:16.18. Вы видите флуоресценцию YFP здесь, где вы видите добавление
00:18:20.18 рецептор на мембранах, а также на везикулах внутри.
00:18:23.17 И здесь мы измеряем, что происходит, когда вы добавляете EGF, вы на самом деле
00:18:26.23 активируете рецептор. Синий цвет представляет собой фосфорилированный рецептор
00:18:29.22. Итак, вы видите, что внутри цитоплазмы есть область
00:18:31.29, которая показывает активный рецептор, но также есть область внутри цитоплазмы
00:18:35.20, где это неактивный рецептор, где он становится
00:18:38.08 неактивный. Итак, здесь мы видим в конце последовательности
00:18:42.14 мы можем на самом деле ингибировать активность киназы, и все это происходит
00:18:45.19 обратно, потому что мы ингибируем активность киназы, которая затем не может
00:18:49.24 самофосфорилироваться или автофосфорилироваться. Итак, давайте продвинемся еще на один шаг вперед и попробуем теперь использовать измерение, которое немного
00:18:59,03 более количественное, чем этот подход. Где мы можем использовать донор
00:19:02.09 и акцептор на отдельных белках. Итак, это подход
00:19:06.26 сенсибилизированное излучение. Теперь в идеальной ситуации, если бы вы могли
00:19:11.22 возбудить донор специально, не возбуждая акцептор,
00:19:16.28 и мы бы следили за флуоресценцией акцептора, и мы бы получили только
00:19:20.00 излучение акцептора при передаче энергии.
00:19:23.25 Таким образом, мы должны создать изображение, в котором мы возбуждаем донора
00:19:27.19 и обнаруживаем акцептор. Проблема, конечно, в том, что
00:19:33.00 мы напрямую возбуждаем акцептор и у нас истекает
00:19:41.23 через донора в акцепторный канал. Таким образом, изображение
00:19:48.01, где вы возбуждаете донора и смотрите на акцептор,
00:19:52.04, не соответствует сенсибилизированному излучению. У нас заражение
00:19:55.11 от прямого возбуждения и протекания. Теперь, прежде чем я
00:20:00.12 пойти немного дальше, посмотреть на спектры. Мы не можем реально посмотреть
00:20:06.15 в нашем примере, где у нас есть донор и акцептор. Мы не можем
00:20:09.27 действительно определить, сколько акцептора проходит.
00:20:12.28 Однако мы можем измерить количество
00:20:16.20, принятое при возбуждении непосредственно на его пике. Потому что там мы не
00:20:19.09 возбуждаем донора, так что это очень специфично. Итак, если мы каким-то образом
00:20:22,27 узнаем, скажем, соотношение между этими двумя, то есть
00:20:26,23 — фиксированное число. Тогда мы могли бы фактически определить, измерив
00:20:30,21 здесь, сколько там. Точно такая же ситуация с прокачкой донора
00:20:34.23.Мы не можем измерить в образце, где у нас есть
00:20:39.00 донор и акцептор, потому что у нас есть излучение акцептора.
00:20:44.00 Но мы можем конкретно измерить донора, так что снова мы знаем, что отношение
00:20:49,13 — это отношение, которое, измеряя здесь, мы можем определить
00:20:53,09, сколько там. Пока спектры, форма неизменна.
00:20:57.01 Так как же нам сделать это исправление? Как определить
00:21:02.22 эти поправочные коэффициенты? Берем пробу только с донором
00:21:07.25 и определяем в основном соотношение между этим и этим, и берем
00:21:14,16 образец с одним акцептором и берем соотношение между этим
00:21:16,27 и этим. И таким образом, измеряя в образце, где у нас есть донор
00:21:22.06 и акцептор, возбуждая акцептор, мы можем определить, насколько сильно мы
00:21:26.01 непосредственно возбуждаем акцептор. Так вот как проходит эксперимент.
00:21:32.23 Сцеживаем донора, в данном случае исправим кровоточивость.
00:21:37.07 Возбуждаем донор, только сейчас имеем спектр донора,
00:21:41.16 потому что нет акцептора, и меряем при излучении
00:21:46.07 акцептора. Другими словами, чтобы скорректировать образец, где у нас есть донор
00:21:53,15 и акцептор, нам нужно знать, как это соотносится с интенсивностью
00:21:58,15. И так измеряем в пике донора
00:22:03.23 и теперь на это отношение нам надо масштабировать наш поправочный коэффициент
00:22:09.06 на который нам нужно подкорректировать изображение где мы возбуждаем донор
00:22:14.06 и измерьте донор, чтобы вычесть его из сенсибилизированного излучения
00:22:18.28 или канала FRET. Очень похож
00:22:25.18 принцип коррекции прямого возбуждения.
00:22:28.01 Теперь возьмем образец, который теперь содержит только акцептор
00:22:31.16. В образце, где у нас есть донор и акцептор,
00:22:37.17, мы не можем определить, сколько их там, потому что это тоже донор.
00:22:41.04 Итак, мы измеряем в образце, где у нас есть донор и
00:22:48.02 акцептор, эта часть, чтобы мы знали, сколько там. Итак, нам нужно
00:22:52.08 получить отношение, и это точно такая же ситуация. Итак,
00:22:55,18 в основном получаем поправочный коэффициент масштабирования, где мы берем изображение
00:22:59,20 только с акцептором и возбуждаем донор,
00:23:02,17 вот где у нас прямое возбуждение, измерение акцептор,
00:23:08.00 разделенное на изображение прямого возбуждения акцептора
00:23:11.05 и измерение акцептора.Тогда сенсибилизированное излучение
00:23:15.16 строится следующим образом. У нас есть возбуждение донора и излучение акцептора
00:23:22.06, в идеальном мире это было бы сенсибилизированное излучение
00:23:26.20, однако у нас есть вклады
00:23:29.00 от донора, просачивающегося и акцептор прямого возбуждения.
00:23:35.04 Потому что вы можете измерить донор в образце, который содержит как
00:23:40.14 донор, так и акцептор, особенно на длине волны донора,
00:23:42.19 вы получите меру этого просачивания, через которую вам нужно скорректировать
00:23:46,28 на этот скалярный коэффициент. Точно такая же ситуация и при прямом
00:23:51.03 возбуждении акцептора. Итак, у нас есть в основном три изображения:
00:23:56.07 мы берем возбуждение донора/излучение акцептора, возбуждение донора
00:24:00.23/излучение донора, возбуждение акцептора/излучение акцептора.
00:24:04.26 А затем в отдельном эксперименте мы определяем эти два
00:24:07.28 скалярных фактора. И делим это на интенсивность акцептора,
00:24:14.27 так возбуждая акцептор и акцепторное излучение, и мы получаем меру
00:24:18,27 кажущейся эффективности, которая пропорциональна реальной эффективности
00:24:22,26 и доле взаимодействующих молекул. Таким образом, это очень легко
00:24:29.03 реализовать на стандартных микроскопах, вы можете сделать это в конфокальном микроскопе
00:24:31.09, вы можете сделать это в широкопольном микроскопе с
00:24:34.22 подходящим наборы фильтров. Это довольно быстро, потому что вы можете переключать
00:24:39.19 ваши фильтры очень быстро на колесе фильтров или на конфокальном микроскопе
00:24:43.15 вы можете сделать это почти одновременно. Или вы можете сделать это
00:24:45.24 одновременно. Он полуколичественный, потому что вы получаете нечто, пропорциональное
00:24:50,07 относительной концентрации взаимодействующих молекул.
00:24:53.12 Проблема здесь конечно зависит от этой внешней калибровки,
00:24:57.05 так что получите скалярные коэффициенты, где вам нужен образец с донором
00:25:00.11 и только акцептор, что делает его очень чувствительным к шуму.
00:25:04.27 И еще одно важное свойство, которое необходимо иметь:
00:25:07.08 спектры в основном инвариантны к окружающей среде,
00:25:11.27 поэтому они не меняют свою форму в зависимости от окружающей среды. .
00:25:15.01 Например, если это липидная среда или цитоплазматическая
00:25:18.01 среда. К счастью, это относится к флуоресцентным белкам
00:25:21.11, потому что хромофор заключен в
00:25:23.29 баррелей. Окружающая среда определяется бочками.
00:25:26.04 Итак, пример здесь, снова мы используем ту же систему,
00:25:31.14 у нас есть рецептор эпидермального фактора роста, который теперь присоединен к донору
00:25:35.12. Теперь у нас есть отдельная экспрессия этого домена PTB
00:25:39.21, который распознает фосфотирозин, помеченный акцептором.
00:25:42.24 Поскольку мы вносим исправления, мы можем иметь их в отдельных конструкциях
00:25:46.13. Нам не нужно их прикреплять. Итак, вот в основном
00:25:50.00 роль, которая представляет распределение в пространстве рецептора
00:25:54.15, у вас есть домен PTB, а здесь у нас есть
00:25:57.18 кажущаяся эффективность. Это очень простой эксперимент,
00:26:00.25 в основном никакой стимуляции, вы можете видеть, что это уже активный
00:26:03.18 рецептор. Здесь уже есть взаимодействие. Когда мы добавляем
00:26:06.16 EGF, вы получаете увеличение взаимодействия, которое активирует больше рецепторов
00:26:09.25. Когда мы добавляем ингибитор киназы, короткое время
00:26:15.
00:26:19.04 действительно фосфорилирует рецептор, но при более длительном времени это взаимодействие снова теряется. Итак, это третий подход, основанный на интенсивности
00:26:29.15, который я опишу. Из подходов на основе интенсивности
00:26:32.28 это самый количественный. Но у него есть большой недостаток
00:26:36.04 по сравнению с предыдущими методами, которые я описывал.
00:26:38.20 Вы можете использовать его только в фиксированных ячейках, что очень сложно сделать в
00:26:42.10 живых систем. Преимущество этого подхода в том, что он
00:26:46.13 очень надежный и достаточно количественный. Так как это работает?
00:26:51.26 Это выглядит следующим образом. Возбуждаем донор и затем смотрим на эмиссию
00:26:58.12 донора. Если FRET продолжается, донор должен быть
00:27:03.02 погашен. И поэтому излучение от него меньше, потому что это
00:27:06.02 фактический канал безызлучательного распада. Что мы хотели бы знать
00:27:13.16, так это то, какова интенсивность донора в отсутствие акцептора?
00:27:17.07 Используя это, очень легко рассчитать эффективность.
00:27:22.17 Сейчас мы не можем провести отдельный эксперимент, где мы будем измерять только донор
00:27:27.07, потому что это будет совсем другая конфигурация,
00:27:28.28 и другая концентрация молекул и так далее.
00:27:30.28 Итак, мы делаем следующее. Мы возбуждаем акцептор
00:27:34.19, и вы можете делать это очень специфично, и в основном возбуждать до тех пор, пока он не станет полностью фотообесцвеченным. Итак, мы уничтожили акцепторные антенны.
00:27:41.20 И после этого перемеряем донора. И тогда
00:27:45.23 донор разомкнется и интенсивность повысится,
00:27:49.01 и у вас ситуация с отсутствием акцептора.
00:27:55.00 Конечно, в ситуации с живой ячейкой, когда все происходит очень быстро, это невозможно. Вы измените взаимодействия, вы измените
00:28:02.01 местонахождение молекул, и это уже не будет хорошей мерой.
00:28:05.03 Вот почему вы хотите сделать это в фиксированных ячейках.Теперь кажущаяся эффективность
00:28:09.09 в основном равна 1 минус донор в ситуации, когда у вас есть погашенный акцептор
00:28:14.10, а затем донор в ситуации
00:28:20.07, где у вас есть фотоотбеленный акцептор. Вот как это выглядит
00:28:25.01 в реальном эксперименте. Здесь снова у нас та же самая система
00:28:30.06 просто для сравнения. Итак, у нас снова есть эпидермальный
00:28:32.25 рецептор фактора роста, и в этом случае мы смотрим на
00:28:35.20 фосфорилирование тирозинов, глядя на антитело
00:28:38.24, которое имеет химический акцептор, маленькую метку в качестве акцептора.
00:28:45.11 Это в фиксированных ячейках перед фотообесцвечиванием или акцепторным
00:28:48.15 фотообесцвечиванием. Лучше всего это делать в фиксированных ячейках, сложно в живых
00:28:51.12 ячейках. И мы в основном инкубировали с этим антителом.
00:28:55.00 Теперь дело в том, что это антитело не специфично
00:28:57.14 для фосфотирозинов EGFR, оно также распознает любой
00:29:01.09 фосфотирозин. Однако, поскольку мы измерили
00:29:04.12 близость этого антитела к этой молекуле с помощью FRET,
00:29:07.01, вы получили высокоспецифичный сигнал для фосфорилирования
00:29:10.21 рецептора. Специально для этого рецептора. Итак, здесь у вас есть
00:29:15.10 в основном только донор, это распределение рецептора,
00:29:18.03 здесь ниже распределение акцептора, это антитело.
00:29:21.21 Это там, где у вас есть фосфорилирование.А потом
00:29:24.15 вы фотообесцвечиваете в этом прямоугольнике акцептор, вы видите, что
00:29:30.12 пропал вот здесь. Мы сделали это в конфокальном микроскопе,
00:29:32.25, так что мы просто взяли интересующую область и фотообесцвечили ее
00:29:35.21 вон там. Это делается в эталонной версии.
00:29:39.00 И то, что вы видите в доноре, вы на самом деле видите его увеличение
00:29:40.28 в интенсивности там, где у вас был FRET, где вы сравните это
00:29:44.14 ситуация здесь, например, к ситуации здесь.
00:29:47.08 Это также очень хорошо видно на этом изображении, где у вас есть
00:29:51.01 разница между этими двумя, и поэтому вы видите в основном
00:29:54.25 негашение по сравнению с эталонной версией, где едва ли есть
00:29:56.29 что-то происходит. Теперь, если вы возьмете 1 минус это изображение
00:30:01.20, разделенное на это изображение, вы получите очевидную эффективность FRET,
00:30:05.03, которая показывает, что у вас есть активный рецептор в основном
00:30:08.03 на плазматической мембране и очень мало активного рецептора
00:30:12.03 на этом внутреннем пузырьке. Так что в основном это дефосфорилировано
00:30:17.00 в этом отсеке. Таким образом, этот подход очень легко реализовать,
00:30:21.24 он очень надежен. На самом деле он используется как стандарт для доказательства того, что
00:30:26.14 происходит FRET. Он очень медленный, и это самый большой недостаток.
00:30:32.05 Не подходит для визуализации живых клеток. Возможно, здесь есть решение
00:30:35.21 с использованием фотохромных красителей или переключаемых красителей, которые вы можете
00:30:39.12 переключаться туда и обратно, включать и выключать, чтобы делать это в живых клетках.
00:30:42.02 Я не буду это обсуждать. Это полуколичественный показатель, но вы получаете
00:30:46,26 что-то, что пропорционально доле комплексного
00:30:49,06 истинной эффективности. Так что в этом смысле это самый количественный
00:30:53,06 с точки зрения методов, основанных на интенсивности. И вам не нужна внешняя калибровка
00:30:56,10, как в случае измерений сенсибилизированного излучения
00:30:59,09. У вас есть внутренний контроль этим отбеливанием.
00:31:02.19 Итак, еще один пример, который я покажу здесь, просто чтобы показать
00:31:08.13, что вы можете использовать этот подход, например, для создания трехмерной карты
00:31:11.28 взаимодействие. В этом случае мы рассмотрели
00:31:14,24 взаимодействие между эпидермальным фактором роста и
00:31:18,24 фосфатазой, называемой PTP1B, которая находится на поверхности ER.
00:31:22.07 И мы использовали специфический следящий мутант, который имеет стабильное взаимодействие
00:31:25.25 со своим субстратом.Итак, мы хотели знать, где
00:31:27.29 фосфатаза действительно действует на эпидермальный фактор роста.
00:31:31.08 Итак, что вы делаете, так это берете
00:31:36.10 полный стек, чтобы получить трехмерное распределение
00:31:38.28 вашего донора. Затем вы подвергаете фотообесцвечиванию акцептора всего лишь
00:31:42,23, сканируя по одной плоскости, потому что дозовый эффект фотообесцвечивания
00:31:45,20 просто остается в одном месте, по крайней мере, при приближении одного фотона.
00:31:49.01 Вы полностью фотообесцвечиваете акцептор, затем повторно снимаете
00:31:52,15 трехмерный стек, и вы просто берете 1 минус соотношение
00:31:55,07 этих двух изображений, и вы получаете кажущуюся эффективность
00:31:59,01 . И теперь вы можете видеть в этой зеленой области, в основном, где происходит это взаимодействие
00:32:02.23. Вы можете ясно видеть, что именно здесь происходит дефосфорилирование рецептора
00:32:05.13, в основном внутри клетки.
00:32:10.15 Итак, это последний подход, который я собираюсь описать.И я собираюсь
00:32:16.23 более подробно остановиться на втором семинаре, посвященном
00:32:19.27 именно этому, потому что это самый количественный
00:32:21.24 подход, но он также включает в себя немного более, я бы сказал, техническое
00:32:25.20 оборудование. Более сложное оборудование, но и более сложные методы анализа. И об этом стоит поговорить отдельно.
00:32:35.11 Основная сила действительно заключается в количественной оценке. Итак, измеряем
00:32:41.00 FRET с помощью флуоресцентной микроскопии времени жизни, что мы делаем здесь
00:32:44.01 измеряется время жизни донора в возбужденном состоянии.
00:32:46.17 Итак, вы возбуждаете донора и измеряете донора, что вы можете сделать
00:32:52.04 специально, не видя акцептора. И вместо
00:32:55,28 измерения интенсивности мы измеряем
00:32:59,14 затухание возбужденного состояния как функцию времени.
00:33:04.14 А если у вас FRET, то у вас есть лишний канал
00:33:07.10 неизлучаемого распада. Таким образом, вы опустошите возбужденное состояние
00:33:09.27 быстрее, а это означает, что вы всегда будете получать более короткое
00:33:12.26 или более быстрое затухание, что означает более короткое время жизни.
00:33:17.27 Теперь, чтобы дать вам представление о том, как это выглядит, у меня есть пример
00:33:22.13, к которому я вернусь на своем втором семинаре.
00:33:24.18 Где мы рассмотрели взаимодействие между Ras, который является
00:33:28.24 центральным в передаче сигнала, к которому присоединена донорная молекула
00:33:32.17 Цитрин. И эта молекула называется PDEd, что равно
00:33:36.20 GDI-подобный солюбилизирующий фактор с прикрепленной к нему Cherry.
00:33:41.04 Нас интересует это взаимодействие, потому что оно имело значение
00:33:44.12 для пространственной организации Ras, и нам нужно знать, где это
00:33:47.23 взаимодействие происходит внутри клеток. Таким образом, мы в основном измерили
00:33:51,09 FRET, и мы делаем это специально, измеряя свойства возбужденного состояния
00:33:53,27 донора. Теперь то, что мы получаем с FLIM
00:33:59.10 в одном эксперименте, является истинной эффективностью в комплексе
00:34:05.21, который является геометрическим параметром, с пространственным вариантом.
00:34:10.00 Это единственное свойство комплекса, которое позволяет нам что-то сказать о
00:34:14.21 конформации. Если вы возьмете каппа в квадрате, игнорируя каппа в квадрате,
00:34:17,21 мы можем фактически сказать, что передача энергии
00:34:20,17 50% эффективности и расстояние передачи примерно 6 нм.
00:34:23.16 Но это очень опасно. Более важным, и что действительно актуально
00:34:28.11 для биологов, на мой взгляд, является этот параметр альфа, который равен
00:34:33.21 доля взаимодействующих молекул в каждом пикселе или пространственный
00:34:39,05 разрешаемый элемент. Это представляет последовательность реакций
00:34:42,16, где происходят взаимодействия, и это действительно карта
00:34:45,07, в отличие от E, которая не карта, а просто скаляр.
00:34:49.14 Это свойство комплекса, это свойство, которое изменяется как функция
00:34:53.29 пространства. Итак, здесь мы получаем долю в нашей таблице ложных цветов
00:34:59.26 долю молекул, которые взаимодействуют.В данном случае Ras
00:35:04.09 взаимодействует с PDEdelta, и тут же видно, что с плазменной
00:35:07.18 мембраной мы взаимодействия не обнаруживаем. И на гольджи мы не находим
00:35:10.12 взаимодействия. А здесь вы видите взаимодействие в цитоплазме
00:35:12.29. И это очень важно для пары, скажем, состояния
00:35:16.27 Ras с его взаимодействием с PDEdelta.
00:35:25.06 Итак, в следующий раз я подробно расскажу об этой флуоресценции
00:35:29.00 всю жизнь представьте себе микроскопию, потому что она заслуживает отдельного
00:35:31.25 обсуждения, потому что это самый количественный подход
00:35:36.05 и позволяет вам количественно оценить биологию и лучше понять
00:35:40.08 как молекулярные реакции, для Например, важны для пространственной организации.

16170957253106 1..69

%PDF-1.3 % 1 0 объект > >> /Страницы 4 0 Р /Тип /Каталог >> эндообъект 5 0 объект > эндообъект 2 0 объект > поток 2021-03-30T10:22:14+01:00Arbortext Advanced Print Publisher 9.0.215/W Unicode2021-04-08T13:22:23+02:002021-04-08T13:22:23+02:00GPL Ghostscript 9.15application/pdf

  • 16170957253106 1..69
  • UUID: 44beb206-1c9e-4ab5-9086-cdfdf9d3027duuid: c453fa6d-8d00-43ed-9247-a08350f46423 конечный поток эндообъект 3 0 объект > эндообъект 4 0 объект > эндообъект 6 0 объект > эндообъект 7 0 объект > эндообъект 8 0 объект > эндообъект 9 0 объект > эндообъект 10 0 объект > эндообъект 11 0 объект > эндообъект 12 0 объект > эндообъект 13 0 объект > эндообъект 14 0 объект > эндообъект 15 0 объект > эндообъект 16 0 объект > эндообъект 17 0 объект > эндообъект 18 0 объект > эндообъект 19 0 объект > эндообъект 20 0 объект > эндообъект 21 0 объект > эндообъект 22 0 объект > эндообъект 23 0 объект > эндообъект 24 0 объект > эндообъект 25 0 объект > эндообъект 26 0 объект > эндообъект 27 0 объект > эндообъект 28 0 объект > эндообъект 29 0 объект > эндообъект 30 0 объект > эндообъект 31 0 объект > эндообъект 32 0 объект > эндообъект 33 0 объект > эндообъект 34 0 объект > эндообъект 35 0 объект > эндообъект 36 0 объект > эндообъект 37 0 объект > эндообъект 38 0 объект > эндообъект 39 0 объект > эндообъект 40 0 объект > эндообъект 41 0 объект > эндообъект 42 0 объект > эндообъект 43 0 объект > эндообъект 44 0 объект > эндообъект 45 0 объект > эндообъект 46 0 объект > эндообъект 47 0 объект > эндообъект 48 0 объект > эндообъект 49 0 объект > эндообъект 50 0 объект > эндообъект 51 0 объект > эндообъект 52 0 объект > эндообъект 53 0 объект > эндообъект 54 0 объект > эндообъект 55 0 объект > эндообъект 56 0 объект > эндообъект 57 0 объект > эндообъект 58 0 объект > эндообъект 59 0 объект > эндообъект 60 0 объект > эндообъект 61 0 объект > эндообъект 62 0 объект > эндообъект 63 0 объект > эндообъект 64 0 объект > эндообъект 65 0 объект > эндообъект 66 0 объект > эндообъект 67 0 объект > эндообъект 68 0 объект > эндообъект 69 0 объект > эндообъект 70 0 объект > эндообъект 71 0 объект > эндообъект 72 0 объект > эндообъект 73 0 объект > эндообъект 74 0 объект > эндообъект 75 0 объект > эндообъект 76 0 объект > эндообъект 77 0 объект > эндообъект 78 0 объект > эндообъект 79 0 объект > эндообъект 80 0 объект > эндообъект 81 0 объект > эндообъект 82 0 объект > эндообъект 83 0 объект > эндообъект 84 0 объект > эндообъект 85 0 объект > эндообъект 86 0 объект > эндообъект 87 0 объект > эндообъект 88 0 объект > эндообъект 89 0 объект > эндообъект 90 0 объект > эндообъект 91 0 объект > эндообъект 92 0 объект > эндообъект 93 0 объект > эндообъект 94 0 объект > эндообъект 95 0 объект > эндообъект 96 0 объект > эндообъект 97 0 объект > эндообъект 98 0 объект > эндообъект 99 0 объект > эндообъект 100 0 объект > эндообъект 101 0 объект > эндообъект 102 0 объект > эндообъект 103 0 объект > эндообъект 104 0 объект > эндообъект 105 0 объект > эндообъект 106 0 объект > эндообъект 107 0 объект > эндообъект 108 0 объект > эндообъект 109 0 объект > эндообъект 110 0 объект > эндообъект 111 0 объект > эндообъект 112 0 объект > эндообъект 113 0 объект > эндообъект 114 0 объект > эндообъект 115 0 объект > эндообъект 116 0 объект > эндообъект 117 0 объект > эндообъект 118 0 объект > эндообъект 119 0 объект > эндообъект 120 0 объект > эндообъект 121 0 объект > эндообъект 122 0 объект > эндообъект 123 0 объект > эндообъект 124 0 объект > эндообъект 125 0 объект > эндообъект 126 0 объект > эндообъект 127 0 объект > эндообъект 128 0 объект > эндообъект 129 0 объект > эндообъект 130 0 объект > эндообъект 131 0 объект > эндообъект 132 0 объект > эндообъект 133 0 объект > эндообъект 134 0 объект > эндообъект 135 0 объект > эндообъект 136 0 объект > эндообъект 137 0 объект > эндообъект 138 0 объект > эндообъект 139 0 объект > эндообъект 140 0 объект > эндообъект 141 0 объект > эндообъект 142 0 объект > эндообъект 143 0 объект > эндообъект 144 0 объект > эндообъект 145 0 объект > эндообъект 146 0 объект > эндообъект 147 0 объект > эндообъект 148 0 объект > эндообъект 149 0 объект > эндообъект 150 0 объект > эндообъект 151 0 объект > эндообъект 152 0 объект > эндообъект 153 0 объект > эндообъект 154 0 объект > эндообъект 155 0 объект > эндообъект 156 0 объект > эндообъект 157 0 объект > эндообъект 158 0 объект > эндообъект 159 0 объект > эндообъект 160 0 объект > эндообъект 161 0 объект > эндообъект 162 0 объект > эндообъект 163 0 объект > эндообъект 164 0 объект > эндообъект 165 0 объект > эндообъект 166 0 объект > эндообъект 167 0 объект > эндообъект 168 0 объект > эндообъект 169 0 объект > эндообъект 170 0 объект > эндообъект 171 0 объект > эндообъект 172 0 объект > эндообъект 173 0 объект > эндообъект 174 0 объект > эндообъект 175 0 объект > эндообъект 176 0 объект > эндообъект 177 0 объект > эндообъект 178 0 объект > эндообъект 179 0 объект > эндообъект 180 0 объект > эндообъект 181 0 объект > эндообъект 182 0 объект > эндообъект 183 0 объект > эндообъект 184 0 объект > эндообъект 185 0 объект > эндообъект 186 0 объект > эндообъект 187 0 объект > эндообъект 188 0 объект > эндообъект 189 0 объект > эндообъект 190 0 объект > эндообъект 191 0 объект > эндообъект 192 0 объект > эндообъект 193 0 объект > эндообъект 194 0 объект > эндообъект 195 0 объект > эндообъект 196 0 объект > эндообъект 197 0 объект > эндообъект 198 0 объект > эндообъект 199 0 объект > эндообъект 200 0 объект > эндообъект 201 0 объект > эндообъект 202 0 объект > эндообъект 203 0 объект > эндообъект 204 0 объект > эндообъект 205 0 объект > эндообъект 206 0 объект > эндообъект 207 0 объект > эндообъект 208 0 объект > эндообъект 209 0 объект > эндообъект 210 0 объект > эндообъект 211 0 объект > эндообъект 212 0 объект > эндообъект 213 0 объект > эндообъект 214 0 объект > эндообъект 215 0 объект > эндообъект 216 0 объект > эндообъект 217 0 объект > эндообъект 218 0 объект > эндообъект 219 0 объект > эндообъект 220 0 объект > эндообъект 221 0 объект > эндообъект 222 0 объект > эндообъект 223 0 объект > эндообъект 224 0 объект > эндообъект 225 0 объект > эндообъект 226 0 объект > эндообъект 227 0 объект > эндообъект 228 0 объект > эндообъект 229 0 объект > эндообъект 230 0 объект > эндообъект 231 0 объект > эндообъект 232 0 объект > эндообъект 233 0 объект > эндообъект 234 0 объект > эндообъект 235 0 объект > эндообъект 236 0 объект > эндообъект 237 0 объект > эндообъект 238 0 объект > эндообъект 239 0 объект > эндообъект 240 0 объект > эндообъект 241 0 объект > эндообъект 242 0 объект > эндообъект 243 0 объект > эндообъект 244 0 объект > эндообъект 245 0 объект > эндообъект 246 0 объект > эндообъект 247 0 объект > эндообъект 248 0 объект > эндообъект 249 0 объект > эндообъект 250 0 объект > эндообъект 251 0 объект > эндообъект 252 0 объект > эндообъект 253 0 объект > эндообъект 254 0 объект > эндообъект 255 0 объект > эндообъект 256 0 объект > эндообъект 257 0 объект > эндообъект 258 0 объект > эндообъект 259 0 объект > эндообъект 260 0 объект > эндообъект 261 0 объект > эндообъект 262 0 объект > эндообъект 263 0 объект > эндообъект 264 0 объект > эндообъект 265 0 объект > эндообъект 266 0 объект > эндообъект 267 0 объект > эндообъект 268 0 объект > эндообъект 269 ​​0 объект > эндообъект 270 0 объект > эндообъект 271 0 объект > эндообъект 272 0 объект > эндообъект 273 0 объект > эндообъект 274 0 объект > эндообъект 275 0 объект > эндообъект 276 0 объект > эндообъект 277 0 объект > эндообъект 278 0 объект > эндообъект 279 0 объект > эндообъект 280 0 объект > эндообъект 281 0 объект > эндообъект 282 0 объект > эндообъект 283 0 объект > эндообъект 284 0 объект > эндообъект 285 0 объект > эндообъект 286 0 объект > эндообъект 287 0 объект > эндообъект 288 0 объект > эндообъект 289 0 объект > эндообъект 290 0 объект > эндообъект 291 0 объект > эндообъект 292 0 объект > эндообъект 293 0 объект > эндообъект 294 0 объект > эндообъект 295 0 объект > эндообъект 296 0 объект > эндообъект 297 0 объект > эндообъект 298 0 объект > эндообъект 299 0 объект > эндообъект 300 0 объект > эндообъект 301 0 объект > эндообъект 302 0 объект > эндообъект 303 0 объект > эндообъект 304 0 объект > эндообъект 305 0 объект > эндообъект 306 0 объект > эндообъект 307 0 объект > эндообъект 308 0 объект > эндообъект 309 0 объект > эндообъект 310 0 объект > эндообъект 311 0 объект > эндообъект 312 0 объект > эндообъект 313 0 объект > эндообъект 314 0 объект > эндообъект 315 0 объект > эндообъект 316 0 объект > эндообъект 317 0 объект > эндообъект 318 0 объект > эндообъект 319 0 объект > эндообъект 320 0 объект > эндообъект 321 0 объект > эндообъект 322 0 объект > эндообъект 323 0 объект > эндообъект 324 0 объект > эндообъект 325 0 объект > эндообъект 326 0 объект > эндообъект 327 0 объект > эндообъект 328 0 объект > эндообъект 329 0 объект > эндообъект 330 0 объект > эндообъект 331 0 объект > эндообъект 332 0 объект > эндообъект 333 0 объект > эндообъект 334 0 объект > эндообъект 335 0 объект > эндообъект 336 0 объект > эндообъект 337 0 объект > эндообъект 338 0 объект > эндообъект 339 0 объект > эндообъект 340 0 объект > эндообъект 341 0 объект > эндообъект 342 0 объект > эндообъект 343 0 объект > эндообъект 344 0 объект > эндообъект 345 0 объект > эндообъект 346 0 объект > эндообъект 347 0 объект > эндообъект 348 0 объект > эндообъект 349 0 объект > эндообъект 350 0 объект > эндообъект 351 0 объект > эндообъект 352 0 объект > эндообъект 353 0 объект > эндообъект 354 0 объект > эндообъект 355 0 объект > эндообъект 356 0 объект > эндообъект 357 0 объект > эндообъект 358 0 объект > эндообъект 359 0 объект > эндообъект 360 0 объект > эндообъект 361 0 объект > эндообъект 362 0 объект > эндообъект 363 0 объект > эндообъект 364 0 объект > эндообъект 365 0 объект > эндообъект 366 0 объект > эндообъект 367 0 объект > эндообъект 368 0 объект > эндообъект 369 0 объект > эндообъект 370 0 объект > эндообъект 371 0 объект > эндообъект 372 0 объект > эндообъект 373 0 объект > эндообъект 374 0 объект > эндообъект 375 0 объект > эндообъект 376 0 объект > эндообъект 377 0 объект > эндообъект 378 0 объект > эндообъект 379 0 объект > эндообъект 380 0 объект > эндообъект 381 0 объект > эндообъект 382 0 объект > эндообъект 383 0 объект > эндообъект 384 0 объект > эндообъект 385 0 объект > эндообъект 386 0 объект > эндообъект 387 0 объект > эндообъект 388 0 объект > эндообъект 389 0 объект > эндообъект 390 0 объект > эндообъект 391 0 объект > эндообъект 392 0 объект > эндообъект 393 0 объект > эндообъект 394 0 объект > эндообъект 395 0 объект > эндообъект 396 0 объект > эндообъект 397 0 объект > эндообъект 398 0 объект > эндообъект 399 0 объект > эндообъект 400 0 объект > эндообъект 401 0 объект > эндообъект 402 0 объект > эндообъект 403 0 объект > эндообъект 404 0 объект > эндообъект 405 0 объект > эндообъект 406 0 объект > эндообъект 407 0 объект > эндообъект 408 0 объект > эндообъект 409 0 объект > эндообъект 410 0 объект > эндообъект 411 0 объект > эндообъект 412 0 объект > эндообъект 413 0 объект > эндообъект 414 0 объект > эндообъект 415 0 объект > эндообъект 416 0 объект > эндообъект 417 0 объект > эндообъект 418 0 объект > эндообъект 419 0 объект > эндообъект 420 0 объект > эндообъект 421 0 объект > эндообъект 422 0 объект > эндообъект 423 0 объект > эндообъект 424 0 объект > эндообъект 425 0 объект > эндообъект 426 0 объект > эндообъект 427 0 объект > эндообъект 428 0 объект > эндообъект 429 0 объект > эндообъект 430 0 объект > эндообъект 431 0 объект > эндообъект 432 0 объект > эндообъект 433 0 объект > эндообъект 434 0 объект > эндообъект 435 0 объект > эндообъект 436 0 объект > эндообъект 437 0 объект > эндообъект 438 0 объект > эндообъект 439 0 объект > эндообъект 440 0 объект > эндообъект 441 0 объект > эндообъект 442 0 объект > эндообъект 443 0 объект > эндообъект 444 0 объект > эндообъект 445 0 объект > эндообъект 446 0 объект > эндообъект 447 0 объект > эндообъект 448 0 объект > эндообъект 449 0 объект > эндообъект 450 0 объект > эндообъект 451 0 объект > эндообъект 452 0 объект > эндообъект 453 0 объект > эндообъект 454 0 объект > эндообъект 455 0 объект > эндообъект 456 0 объект > эндообъект 457 0 объект > эндообъект 458 0 объект > эндообъект 459 0 объект > эндообъект 460 0 объект > эндообъект 461 0 объект > эндообъект 462 0 объект > эндообъект 463 0 объект > эндообъект 464 0 объект > эндообъект 465 0 объект > эндообъект 466 0 объект > эндообъект 467 0 объект > эндообъект 468 0 объект > эндообъект 469 0 объект > эндообъект 470 0 объект > эндообъект 471 0 объект > эндообъект 472 0 объект > эндообъект 473 0 объект > эндообъект 474 0 объект > эндообъект 475 0 объект > эндообъект 476 0 объект > эндообъект 477 0 объект > эндообъект 478 0 объект > эндообъект 479 0 объект > эндообъект 480 0 объект > эндообъект 481 0 объект > эндообъект 482 0 объект > эндообъект 483 0 объект > эндообъект 484 0 объект > эндообъект 485 0 объект > эндообъект 486 0 объект > эндообъект 487 0 объект > эндообъект 488 0 объект > эндообъект 489 0 объект > эндообъект 490 0 объект > эндообъект 491 0 объект > эндообъект 492 0 объект > эндообъект 493 0 объект > эндообъект 494 0 объект > эндообъект 495 0 объект > эндообъект 496 0 объект > эндообъект 497 0 объект > эндообъект 498 0 объект > эндообъект 499 0 объект > эндообъект 500 0 объект > эндообъект 501 0 объект > эндообъект 502 0 объект > эндообъект 503 0 объект > эндообъект 504 0 объект > эндообъект 505 0 объект > эндообъект 506 0 объект > эндообъект 507 0 объект > эндообъект 508 0 объект > эндообъект 509 0 объект > эндообъект 510 0 объект > эндообъект 511 0 объект > эндообъект 512 0 объект > эндообъект 513 0 объект > эндообъект 514 0 объект > эндообъект 515 0 объект > эндообъект 516 0 объект > эндообъект 517 0 объект > эндообъект 518 0 объект > эндообъект 519 0 объект > эндообъект 520 0 объект > эндообъект 521 0 объект > эндообъект 522 0 объект > эндообъект 523 0 объект > эндообъект 524 0 объект > эндообъект 525 0 объект > эндообъект 526 0 объект > эндообъект 527 0 объект > эндообъект 528 0 объект > эндообъект 529 0 объект > эндообъект 530 0 объект > эндообъект 531 0 объект > эндообъект 532 0 объект > эндообъект 533 0 объект > эндообъект 534 0 объект > эндообъект 535 0 объект > эндообъект 536 0 объект > эндообъект 537 0 объект > эндообъект 538 0 объект > эндообъект 539 0 объект > эндообъект 540 0 объект > эндообъект 541 0 объект > эндообъект 542 0 объект > эндообъект 543 0 объект > эндообъект 544 0 объект > эндообъект 545 0 объект > эндообъект 546 0 объект > эндообъект 547 0 объект > эндообъект 548 0 объект > эндообъект 549 0 объект > эндообъект 550 0 объект > эндообъект 551 0 объект > эндообъект 552 0 объект > эндообъект 553 0 объект > эндообъект 554 0 объект > эндообъект 555 0 объект > эндообъект 556 0 объект > эндообъект 557 0 объект > эндообъект 558 0 объект > эндообъект 559 0 объект > эндообъект 560 0 объект > эндообъект 561 0 объект > эндообъект 562 0 объект > эндообъект 563 0 объект > эндообъект 564 0 объект > эндообъект 565 0 объект > эндообъект 566 0 объект > эндообъект 567 0 объект > эндообъект 568 0 объект > эндообъект 569 0 объект > эндообъект 570 0 объект > эндообъект 571 0 объект > эндообъект 572 0 объект > эндообъект 573 0 объект > эндообъект 574 0 объект > эндообъект 575 0 объект > эндообъект 576 0 объект > эндообъект 577 0 объект > эндообъект 578 0 объект > эндообъект 579 0 объект > эндообъект 580 0 объект > эндообъект 581 0 объект > /XОбъект > >> /Анноты [654 0 R 655 0 R] /Родитель 4 0 Р /MediaBox [0 0 595 842] >> эндообъект 582 0 объект > /Повернуть 0 /Тип /Страница >> эндообъект 583 0 объект > /Повернуть 0 /Тип /Страница >> эндообъект 584 0 объект > /Повернуть 0 /Тип /Страница >> эндообъект 585 0 объект > /Повернуть 0 /Тип /Страница >> эндообъект 586 0 объект > /Повернуть 0 /Тип /Страница >> эндообъект 587 0 объект > /Повернуть 0 /Тип /Страница >> эндообъект 588 0 объект > /Повернуть 0 /Тип /Страница >> эндообъект 589 0 объект > /Повернуть 0 /Тип /Страница >> эндообъект 590 0 объект > /Повернуть 0 /Тип /Страница >> эндообъект 591 0 объект > /Повернуть 0 /Тип /Страница >> эндообъект 592 0 объект > /Повернуть 0 /Тип /Страница >> эндообъект 593 0 объект > /Повернуть 0 /Тип /Страница >> эндообъект 594 0 объект > /Повернуть 0 /Тип /Страница >> эндообъект 595 0 объект > /Повернуть 0 /Тип /Страница >> эндообъект 596 0 объект > /Повернуть 0 /Тип /Страница >> эндообъект 597 0 объект > /Повернуть 0 /Тип /Страница >> эндообъект 598 0 объект > /Повернуть 0 /Тип /Страница >> эндообъект 599 0 объект > /Повернуть 0 /Тип /Страница >> эндообъект 600 0 объект > /Повернуть 0 /Тип /Страница >> эндообъект 601 0 объект > /Повернуть 0 /Тип /Страница >> эндообъект 602 0 объект > /Повернуть 0 /Тип /Страница >> эндообъект 603 0 объект > /Повернуть 0 /Тип /Страница >> эндообъект 604 0 объект > /Повернуть 0 /Тип /Страница >> эндообъект 605 0 объект > /Повернуть 0 /Тип /Страница >> эндообъект 606 0 объект > /Повернуть 0 /Тип /Страница >> эндообъект 607 0 объект > /Повернуть 0 /Тип /Страница >> эндообъект 608 0 объект > /Повернуть 0 /Тип /Страница >> эндообъект 609 0 объект > /Повернуть 0 /Тип /Страница >> эндообъект 610 0 объект > /Повернуть 0 /Тип /Страница >> эндообъект 611 0 объект > /Повернуть 0 /Тип /Страница >> эндообъект 612 0 объект > /Повернуть 0 /Тип /Страница >> эндообъект 613 0 объект > /Повернуть 0 /Тип /Страница >> эндообъект 614 0 объект > /Повернуть 0 /Тип /Страница >> эндообъект 615 0 объект > /Повернуть 0 /Тип /Страница >> эндообъект 616 0 объект > /Повернуть 0 /Тип /Страница >> эндообъект 617 0 объект > /Повернуть 0 /Тип /Страница >> эндообъект 618 0 объект > /Повернуть 0 /Тип /Страница >> эндообъект 619 0 объект > /Повернуть 0 /Тип /Страница >> эндообъект 620 0 объект > /Повернуть 0 /Тип /Страница >> эндообъект 621 0 объект > /Повернуть 0 /Тип /Страница >> эндообъект 622 0 объект > /Повернуть 0 /Тип /Страница >> эндообъект 623 0 объект > /Повернуть 0 /Тип /Страница >> эндообъект 624 0 объект > /Повернуть 0 /Тип /Страница >> эндообъект 625 0 объект > /Повернуть 0 /Тип /Страница >> эндообъект 626 0 объект > /Повернуть 0 /Тип /Страница >> эндообъект 627 0 объект > /Повернуть 0 /Тип /Страница >> эндообъект 628 0 объект > /Повернуть 0 /Тип /Страница >> эндообъект 629 0 объект > /Повернуть 0 /Тип /Страница >> эндообъект 630 0 объект > /Повернуть 0 /Тип /Страница >> эндообъект 631 0 объект > /Повернуть 0 /Тип /Страница >> эндообъект 632 0 объект > /Повернуть 0 /Тип /Страница >> эндообъект 633 0 объект > /Повернуть 0 /Тип /Страница >> эндообъект 634 0 объект > /Повернуть 0 /Тип /Страница >> эндообъект 635 0 объект > /Повернуть 0 /Тип /Страница >> эндообъект 636 0 объект > /Повернуть 0 /Тип /Страница >> эндообъект 637 0 объект > /Повернуть 0 /Тип /Страница >> эндообъект 638 0 объект > /Повернуть 0 /Тип /Страница >> эндообъект 639 0 объект > /Повернуть 0 /Тип /Страница >> эндообъект 640 0 объект > /Повернуть 0 /Тип /Страница >> эндообъект 641 0 объект > /Повернуть 0 /Тип /Страница >> эндообъект 642 0 объект > /Повернуть 0 /Тип /Страница >> эндообъект 643 0 объект > /Повернуть 0 /Тип /Страница >> эндообъект 644 0 объект > /Повернуть 0 /Тип /Страница >> эндообъект 645 0 объект > /Повернуть 0 /Тип /Страница >> эндообъект 646 0 объект > /Повернуть 0 /Тип /Страница >> эндообъект 647 0 объект > /Повернуть 0 /Тип /Страница >> эндообъект 648 0 объект > /Повернуть 0 /Тип /Страница >> эндообъект 649 0 объект > /Повернуть 0 /Тип /Страница >> эндообъект 650 0 объект > /Повернуть 0 /Тип /Страница >> эндообъект 651 0 объект > поток xX][email protected]>TU64歕#U*GzeYv-cIJ;ss?Y?ZnG_ ͺXɻ_y}^ ;^k-͹,9)_u!!jUuVZmXs嗺;˧;RJ%Kf5b8RcXkL_ ]@ @Б м, ڼj2RC 9fa •Z>u)[email protected][0Xf>WhWb+»W+i2Vr#n\ 9S!+x$kPdژ@#+Kz2″j)qE «9TjS |

    Услуги | Высокопроизводительный досмотровый комплекс

    Vanderbilt HTS Facility предоставляет различные услуги исследовательскому сообществу.Доступны консультации по проектированию, оптимизации, разработке и валидации тестов, а также по интеграции автоматизированного HTS и анализа данных.

    Доступ к коллекции соединений можно получить независимо от скрининга, также доступны расходные материалы, совместимые с HTS, для тестирования и проверки. Также предоставляются услуги по обучению, позволяющие использовать самые современные инструменты на ходу. Чтобы связаться с персоналом HTS для обсуждения конкретных потребностей, заполните форму приема. Персонал будет оценивать запросы и предоставлять информацию с описанием предлагаемых необходимых ресурсов.

    Обучение независимых пользователей      Скрининг соединений     Составное распространение

     

    ПРОЕКТ И ВАЛИДАЦИЯ

    Благодаря усовершенствованным HTS-совместимым приборам установка HTS поддерживает широкий спектр методов обнаружения для аналитических измерений, включая: поглощение, флуоресценцию, флуоресценцию с временным разрешением, поляризацию флуоресценции, резонансный перенос энергии флуоресценции (FRET), FRET с временным разрешением, люминесценция, биолюминесцентный резонансный перенос энергии (BRET) и сцинтилляционный анализ близости (SPA).Клеточные и бесклеточные анализы в экспериментальных системах, которые использовались в предыдущих моделях, включали, но не ограничивались ими; рекомбинантные белки, мембранные фракции, клеточные изоляты, клеточные лизаты, клеточные линии и целые модельные организмы (например, рыбки данио, C. elegans и дрожжи).

    Центр HTS помогает исследователям разрабатывать HTS-совместимые анализы, получать предварительные данные для получения грантов и возможностей финансирования, а также проводить скрининг для выявления и исследования новых соединений для фундаментальных исследований и фармакологических открытий.Открытия включают новые модуляторы рецепторов, связанных с G-белком, ионных каналов, транспортеров, протеаз, оксидоредуктаз, белков клеточной адгезии, липаз, рецепторов факторов роста, протоонкогенов, белок-белковых взаимодействий, ДНК-белковых взаимодействий и других молекулярных мишеней. и пути, которые важны при многочисленных заболеваниях, таких как нейродегенеративные заболевания, сердечно-сосудистые заболевания, малярия, бактериальные и вирусные заболевания/заболевания, диабет, рак и ВИЧ.

    Мишени для анализа:

    • Модуляторы GPCR
    • Модуляторы ионных каналов
    • Сердечно-сосудистые модели рыбок данио
    • Цели диабета
    • Противомалярийные мишени
    • Цели болезней пищевого происхождения
    • Ингибиторы коагуляции
    • Модуляторы транскрипции
    • Ингибиторы ЦОГ
    • Транспортеры холина
    • Цель регулирования ожирения и кахексии
    • Цели рака толстой кишки
    • Цели рака поджелудочной железы
    • Цели рака легких
    • Цели рака молочной железы

    Проект начинается с заполнения формы приема.После получения сотрудники HTS назначат консультацию, чтобы обсудить адаптацию и внедрение анализа в учреждении HTS. Как правило, тесты проверяются вручную отдельными лабораториями и оцениваются для определения уровня автоматизации и инструментов, необходимых для услуг HTS. После подтверждения анализа положительным и отрицательным контролями и определения надежности анализа (Z-фактор/Z’) анализ готов к автоматизации. Во время валидации автоматизации ручные операции систематически заменяются инструментами для обеспечения точности и прецизионности/достоверности анализа, наблюдаемого в ручном процессе.Например, ручное пипетирование в 384-луночный планшет можно заменить использованием Thermo Multidrop, который равномерно и точно распределяет жидкость по всему планшету за считанные секунды. Другим примером является обработчик жидкости Velocity11 Bravo, это устройство может аспирировать жидкость из всей тарелки, промыть ее и очень точно добавить раствор в тарелку за считанные минуты. После определения последовательности событий и инструментов для анализа создается роботизированная последовательность, называемая графиком, для интеграции этих процедур анализа в автоматизированный режим.

    Программное обеспечение

    определяет количество времени, которое потребуется каждому образцу во время отдельных движений робота, и общее время для всех анализируемых образцов. Тестирование расписания начинается с запуска расписаний для отдельных инструментов, затем следует тестирование всех инструментов без реагентов и, наконец, тестирование всех инструментов с водой. Далее проводится эксперимент с использованием всех инструментов и робототехники, интегрированных по графику с экспериментальными элементами управления. После проверки биологической процедуры и инструментов анализ готов к скринингу соединений.Растущая библиотека, доступная для скрининга, включает более 160 000 соединений.

    HTS может генерировать большое количество данных, и наш специализированный персонал HTS по информатике может помочь с заказным программным обеспечением, помогающим ассимилировать, анализировать и приводить данные к соответствующим спецификациям для выбора попаданий, последующего анализа и проверки совпадений.

    СОЕДИНИТЕЛЬНЫЙ ПРОСЕТ

     

     

    РАСПРЕДЕЛЕНИЕ СОЕДИНЕНИЙ

    Сбор соединений на объекте HTS состоит из нескольких коммерческих и частных источников.В зависимости от интересов исследователя подмножества или вся коллекция могут быть запрошены для тестирования с использованием онлайн-запроса на распределение соединений, который позволяет адаптировать тип планшета, объем и концентрацию к потребностям исследователя. HTS стремится постоянно обогащать библиотеку новыми каркасами и активно поощряет исследователей размещать соединения в библиотеке для распространения и проверки. Химикам синтетических и натуральных продуктов также рекомендуется связаться с предприятием по поводу возможностей осаждения.

    БИБЛИОТЕКА КОЛ-ВО СОЕДИНЕНИЙ СОСТАВ
    Коллекция Vanderbilt Discovery 100 632 Выбрано из коллекции Life Chemicals для HTS. Соединения в этой коллекции были выбраны химиками Вандербильта в области медицины и вычислительной техники, чтобы обеспечить свинцовые мотивы, минимальное вмешательство во все анализы и максимальное разнообразие.
    Коллекция VICB 145 150 Разнообразный набор малых молекул, похожий на лекарство, от Chembridge и ChemDiv.
    Молекулярные библиотеки Репозиторий малых молекул (MLSMR)* 76 575 Недавнее приобретение для экранов MLPCN; требует депонирования результатов скрининга в Pubchem.
    Коллекция спектров 2400 2 400 Широкий спектр биологически активных и структурно разнообразных соединений. 50% лекарственных компонентов, 30% натуральных продуктов, 20% других биоактивных компонентов.
    Клиническая коллекция NIH I и II 727 Небольшие молекулы, которые уже использовались в клинических испытаниях на людях.
    Библиотека липидов Каймана 847 Широкий спектр биоактивных липидов.
    Библиотека фрагментов Фесика** 16 000 Разнообразная коллекция молекул-фрагментов от 8 поставщиков, соответствующая правилу 3 и отфильтрованная от неспецифических и мешающих молекул.
    Коллекция Marnett 212 Производные НПВП, содержащие ингибиторы циклооксигеназы, активаторы PPARгамма и индукторы апоптоза.
    Ионный канал 6248 Коллекция Life Chemicals, ориентированная на ионные каналы, составленная с использованием методологии сходства 2D-отпечатков пальцев.
    Коллекция эпигенетики 57 Группа низкомолекулярных модуляторов с биологической активностью для использования в эпигенетических исследованиях.
    Библиотека ингибиторов Enzo Kinase 80 Библиотека ингибиторов киназ Screen-Well™ содержит 80 известных ингибиторов киназ с четко определенной активностью.Включает ингибиторы следующих важных киназ: рецепторов инсулина/ИФР, PI-3-киназы, CaM-киназы II, JAK, PKA, CDK, JNK, PKC, CKI II, MAPK, RAF, EGFR, MEK, SAPK, GSK, MLCK, Src- семья, IKK, PDGFR, VEGFR и многие другие.
    Коллекция натуральных продуктов NCI 936 Чистые соединения, приобретенные NCI у Analytical и MerLion.
    Одобренный NCI онкологический набор VI 248 Содержит большинство современных противораковых препаратов, одобренных FDA.Текущий набор (AOD VI) состоит из 119 агентов и предназначен для исследования рака, открытия новых лекарств и изучения комбинированных препаратов.
    Набор для разнесения NCI V 1593 Во время создания набора разнообразия фармакофоры для любого соединения-кандидата сравниваются с набором всех фармакофоров, найденных в структурах, уже принятых в набор. Если текущая структура имеет более 5 новых фармакофоров, она добавляется в набор. Дополнительной целью NCI Diversity Set III было создание разнообразного набора соединений, которые можно было бы использовать для формирования гипотез на основе структуры.
    Механический набор NCI III 813 Получено из 37 836 открытых соединений, которые были протестированы в ходе скрининга 60 клеточных линий опухоли человека NCI. В отличие от исходного разнообразия набор из 1990 соединений, который был выбран на основе структурного разнообразия.
    Набор натуральных продуктов NCI III 117 Этот набор был создан в ответ на многочисленные исследовательские группы по поиску лекарств, которые выразили желание изучить различные каркасные структуры, имеющие несколько функциональных групп.
    Коллекция лекарств, одобренная FDA 1184 Набор из 978 одобренных FDA препаратов, поставляемых в виде предварительно растворенных растворов ДМСО; куплены в SelleckChem.
    Библиотека Уивера 295
    Библиотека ингибиторов киназ 2017 429 Уникальная коллекция из 429 ингибиторов киназ для высокопроизводительного скрининга и скрининга высокого содержания. Поставляется в виде предварительно растворенных растворов ДМСО: приобретается у SelleckChem.
    Библиотека противораковых соединений 422 Уникальная коллекция из 422 противораковых препаратов, проходящих клинические испытания. Поставляется в виде предварительно растворенных растворов ДМСО: приобретается у SelleckChem.

     

    * Требуется хранение данных в PubChem
    ** Требуется одобрение доктора Фесика
    *** Требуется соглашение о сотрудничестве с поставщиком

     

    ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ИНСТРУМЕНТА ДЛЯ ОБУЧЕНИЯ И ПРОГУЛКИ

    Большинство инструментов HTS доступны для использования на ходу.Инструменты можно зарезервировать онлайн всего на 15 минут за раз, а доступ к инструментам возможен 24 часа в сутки, семь дней в неделю. Короткое обучение работе с каждым прибором HTS и автоматикой требуется для использования и для резервирования времени работы с прибором. Обучение включает в себя понимание возможностей прибора, ограничений, функций и безопасности прибора, сбора данных, анализа, доступа и хранения, а также политик и процедур HTS для доступа к прибору и его использования. Время обучения будет взиматься со счета следователя и обычно длится от 30 до 60 минут, в зависимости от используемого оборудования.После обучения будет предоставлен доступ к объекту HTS, а также к резервированию и использованию инструментов. Наши инструменты можно найти здесь.

    ПРЕДОСТАВЛЕНИЕ ПИСЬМЕННОЙ ИНФОРМАЦИИ

    Сотрудники HTS могут помочь исследователям в написании грантов и возможностях финансирования, связанных с HTS. Персонал HTS будет рад предоставить смету расходов, описание объектов, а также рекомендательные письма и письма поддержки. Всем новым пользователям необходимо заполнить форму приема для получения помощи с грантами. Если вы уже являетесь пользователем или у вас есть вопросы, свяжитесь с Пейдж Винсон по электронной почте или позвоните по телефону (615) 322-0342 для получения дополнительной информации.

    ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ТЕКСТ ПРЕДОСТАВЛЕНИЯ

    Пожалуйста, свяжитесь с персоналом HTS для получения содержания гранта, отвечающего вашим конкретным потребностям: [email protected]

    ИНФОРМАЦИЯ О ФИНАНСИРОВАНИИ

    Ниже перечислены несколько ресурсов с информацией о финансировании проектов HTS.

     

    Одновременное считывание нескольких пар FRET с использованием фотохромизма

    Введение

    Резонансная передача энергии Фёрстера (FRET) является мощным механизмом для исследования ассоциаций in situ .Эксперименты FRET выполняются путем мечения интересующей системы донорными и акцепторными флуорофорами, а затем с использованием степени передачи энергии для определения расстояний между и относительной ориентации обоих флуорофоров [1]. Подходы на основе FRET приобрели огромную популярность для ассоциативных исследований и могут быть выполнены как с использованием генетически кодируемых флуорофоров, так и с органическими красителями [2]. Это также ключевой механизм, лежащий в основе класса генетически кодируемых биосенсоров, которые преобразуют присутствие определенного химического стимула в изменение FRET [3–6].

    В большинстве экспериментов FRET используются флуоресцентные донор и акцептор, преимущество которых состоит в том, что эффективность FRET можно оценить по соотношению возбуждаемой донором эмиссии обоих флуорофоров [7–10]. Точность этой оценки зависит от легкости, с которой донор и акцептор могут быть спектрально отделены друг от друга. Выбор конкретных пар FRET обычно определяется компромиссом между достижением четко наблюдаемой эффективности FRET, что требует достаточного спектрального перекрытия, и поддержанием низкого уровня перекрестных помех между каналами, что упрощается, когда датчики более спектрально разделены.В результате донор и акцептор имеют тенденцию занимать широкие области визуального спектра, что усложняет комбинацию измерений FRET с использованием других датчиков. Измерение нескольких конструкций на основе FRET еще более усложняется, если эти конструкции имеют общие флуорофоры, излучающие в одной и той же спектральной полосе. Например, многие биосенсоры FRET состоят из голубого и желтого флуоресцентных белков, что затрудняет объединение нескольких биосенсоров для отслеживания, например. перекрестные помехи между сигнальными путями.Использование более чем одного из этих датчиков обычно требует проведения отдельных измерений для каждого датчика, возможно, с высокой пропускной способностью [11].

    Ряд стратегий может облегчить мультиплексирование FRET [12]. Концептуально самый простой подход состоит в том, чтобы выбрать две или более пар FRET с минимальным спектральным перекрытием, хотя это ограничено доступными зондами и используемым спектральным диапазоном [13]. Возможно, удастся разделить один флуорофор на две пары FRET, уменьшив общее количество флуорофоров с четырех до трех [14].Другие подходы включают использование нефлуоресцентных акцепторов в сочетании с визуализацией времени жизни флуоресценции [15–17], использование гомо-FRET в сочетании с альтернативными считываниями, такими как анизотропия флуоресценции [18], и разделение спектрально перекрывающихся пар на основе ортогональной информации. , такие как пространственная локализация зондов внутри клетки [19].

    Несколько стратегий мультиплексирования зондов основаны на использовании фотохимии флуорофоров. Фотохромные метки, например, демонстрируют индуцированное светом и обратимое «включение-выключение» переключения их флуоресцентного излучения [20, 21].При возбуждении эти зонды демонстрируют яркое флуоресцентное излучение, которое со временем исчезает, хотя первоначальную флуоресценцию можно быстро восстановить, облучая светом с более короткой длиной волны. Эту динамику можно использовать для отделения сигнала фотохромной метки от сигнала нефотохромной метки или от автофлуоресценции, а также для разделения двух или более фотохромных меток, которые переключаются с разной кинетикой [22–26]. Однако было проведено сравнительно мало работ по оценке таких стратегий для одновременного измерения нескольких пар FRET.Напротив, фотохромизм акцептора использовался как способ обеспечения более точной количественной оценки FRET [27, 28] или для измерения нескольких расстояний между донором и акцептором одной молекулы в одном комплексе [29]. Предыдущая работа также исследовала использование фотохромного донора, где эффективность FRET можно оценить путем определения скорости фотохромизма [30], или для облегчения считывания гомо-FRET на основе анизотропии [31]. Ассоциативно-индуцированная динамика флуоресценции также использовалась для обеспечения неограниченных по дифракции изображений биосенсоров [32].

    В этом вкладе мы описываем использование донорного фотохромизма для одновременного измерения более чем одной пары FRET, даже когда доноры и акцепторы демонстрируют полное спектральное перекрытие. Мы начинаем с разработки теории, лежащей в основе нашего метода, и подтверждаем его эффективность с помощью численного моделирования. Затем мы разрабатываем фотохромный биосенсор для цАМФ-зависимой протеинкиназы (PKA), который мы называем rsAKARev, и используем его для демонстрации нашего подхода путем одновременного измерения активности PKA и внеклеточной регулируемой сигналом киназы (ERK) в живых клетках.Наконец, мы демонстрируем универсальность нашего подхода, комбинируя эти датчики со спектрально-разделенным биосенсором кальция для одновременного биосенсорного анализа трех различных сигнальных активностей в живых клетках.

    Теория

    Количественная оценка сигнала FRET

    Целью измерения FRET является количественная оценка передачи энергии между донорным и акцепторным флуорофором. Мы предполагаем, что это измерение выполняется с использованием сенсибилизированной визуализации, при которой донор возбуждается, а эмиссия донора ( S DD ) и акцептора ( S DA ) измеряется одновременно или быстро. преемственность.В качестве контроля и для оценки эффектов фотодеструкции обычно также измеряют излучение акцептора при прямом возбуждении ( S AA ). Таким образом, полное получение FRET состоит из трех измерений { S DD , S DA , S детектора AA } и в каждой точке времени детектора AA

    8}.

    Сигнал S DA обычно загрязнен просачиванием донора и прямым перекрестным возбуждением акцептора.Эти вклады можно количественно оценить, используя явные поправочные коэффициенты α и δ [9]:

    Эти поправочные коэффициенты можно определить с помощью контрольных измерений или оценить, зная спектры флуорофоров и спектральную чувствительность прибора. Как правило, прямые контрольные измерения предпочтительнее, поскольку они затем будут адаптированы к специфике прибора. Мы предполагаем, что прямое возбуждение акцептора не приводит к заметной эмиссии донорного флуорофора в акцепторном канале.

    Не все экспериментаторы предпочитают определять эти поправочные коэффициенты вместо количественного определения передачи энергии с использованием «сырого» коэффициента излучения R что уже позволит обнаруживать относительные изменения эффективности FRET. Однако, если они доступны, мы можем использовать поправочные коэффициенты для расчета сенсибилизированного излучения F c , которое представляет собой возбужденное донором излучение акцептора с поправкой на перекрестные помехи:

    Учитывая F c , отклик FRET можно оценить с помощью коэффициента сенсибилизированного излучения R c : R c можно сравнивать на разных инструментах, и он более чувствителен к изменениям FRET, чем коэффициент эмиссии R .Однако это не связано однозначно с абсолютной эффективностью FRET (Θ), поскольку не учитывает разную яркость донорных и акцепторных флуорофоров и/или разную эффективность сбора прибора. Введение дополнительного поправочного коэффициента γ [9] позволяет рассчитать эффективность FRET с помощью как указано в разделе 1 дополнительной информации. γ можно оценить по модельным спектрам или, что более надежно, по дополнительным контрольным экспериментам [10].

    Для некоторых систем, таких как биосенсоры с генетическим кодированием, изменения наблюдаемой эффективности FRET возникают в результате взаимного преобразования системы между состоянием низкого и высокого FRET, а не в результате непрерывного изменения эффективности FRET. По этой причине мы будем называть результат уравнения (6) «кажущейся эффективностью FRET» при обсуждении измерений биосенсоров FRET.

    Представляем фотохромный донор

    Основная идея нашего метода заключается в том, что две разные пары FRET можно различить на основе фотохромизма доноров, концептуально показанного на рисунке 1a.Поэтому мы расширяем нашу модель на случай, когда донором является фотохромный флуорофор. Чтобы исследовать этот фотохромизм, мы расширили нашу схему измерения двумя периодами облучения, которые служат для переключения донорного флуорофора между флуоресцентным и нефлуоресцентным состояниями (рис. 1b). Он состоит из коротковолнового светового импульса и регистрации флуоресценции для регистрации флуоресцентного состояния, за которым следует более длинноволновый световой импульс и еще одна регистрация флуоресценции для регистрации степени выключения.Конечным результатом является то, что каждое измерение FRET теперь заменено двумя измерениями, выполняемыми в конце каждого периода облучения, всего шесть измерений для каждой временной точки FRET (по два измерения для S DD , S DA и S AA ). S AA обычно изменяется медленно, поскольку на него влияет только фотодеструкция или большие структурные изменения в образце, и поэтому его можно измерять с пониженной частотой.

    Рисунок 1:

    (a) Обзор концепции: две пары FRET можно различить, исследуя фотохромизм доноров, поскольку только фотохромные доноры реагируют на включение и выключение света. ( б ) Пример схемы облучения голубого фотохромного белка, показывающий популяцию донора в состоянии «включено» (пунктирная линия) во время облучения фиолетовым и синим светом (цветные столбцы). Красные точки показывают выполненные измерения флуоресценции. На вставке показаны репрезентативные флуоресцентные изображения клетки HeLa, полученные во всех трех каналах измерения.Масштабная линейка, 20 мкм. На практике светоиндуцированное отключение не обязательно должно быть таким полным, как показано здесь.

    Off-переключение донорского флюорофора приводит к снижению S DD , S DA и F C . Мы определяем это количественно, используя коэффициенты фотопереключения ρ D и ρ A , полученные как где сбор данных «включено» и «выключено» показан на рисунке 1b.Мы предлагаем два альтернативных определения ρ A в уравнении (8) в зависимости от того, доступны ли поправочные коэффициенты для перекрестных помех. Наша методология остается в силе для обоих подходов до тех пор, пока эти определения используются последовательно.

    Коэффициенты фотопереключения ρ D и ρ A , таким образом, являются фракциями исходной флуоресценции, оставшейся после применения отключающего облучения. -переключение.Они зависят от специфики донорного флуорофора и от общей доставляемой световой дозы, а также от эффективности FRET, поскольку этот процесс конкурирует с фотохромизмом. Этот аспект был использован при разработке psFRET [30], и его также необходимо учитывать при разделении двух пар FRET на основе фотохромизма.

    В общем случае FRET-зависимость коэффициентов фотопереключения ρ D и ρ A должна быть определена экспериментально путем их измерения для различных (сенсибилизированных) коэффициентов излучения FRET.Это можно сделать, просто выполнив эксперимент, в котором выражена пара FRET, а ρ D и ρ A отслеживаются как функция коэффициента эмиссии или эффективности FRET. Этот подход будет работать и в более общем случае, когда эмиссионный контраст возникает не только за счет переноса энергии, но и за счет других вкладов, таких как изменение яркости донора.

    Этот процесс можно упростить, если сделать соответствующие предположения о системе.Для простого процесса FRET с незначительными или идеально скорректированными перекрестными помехами, в котором присутствует только один вид, поскольку эмиссия акцептора пропорциональна количеству донора в флуоресцентном состоянии. Если мы далее предположим, что переключение может быть описано внутренним квантовым выходом, то коэффициент фотопереключения определяется выражением как указано в разделе 2 дополнительной информации. Уравнение (10) показывает, что полная зависимость известна, если просто измерить ρ 0 коэффициент фотопереключения в отсутствие FRET, используя те же настройки прибора.Как мы показываем в дополнительной информации, это соображение может быть распространено на фотохромные молекулы, которые не демонстрируют полного отключения, а вместо этого достигают уровня равновесия или плато.

    Хотя эти результаты могут упростить характеристику пар FRET, наш метод все равно будет работать, если эти предположения не могут быть сделаны. Остаточные перекрестные помехи прямого возбуждения акцептора в канале S DA , например, увеличат ρ A , поскольку этот вклад не показывает модуляции флуоресценции.Производные модели также не применимы к биосенсорам на основе FRET, которые существуют как два взаимопревращающихся вида (активная и неактивная формы сенсора). Если никакие упрощающие предположения не могут быть сделаны, зависимость ρ A и ρ D от (сенсибилизированного) коэффициента эмиссии или эффективности FRET необходимо будет определить во всем диапазоне значений, для каждой пары FRET и дозы выключающего света, использованной в эксперименте.

    Разделение фотохромных пар FRET

    Теперь предположим, что образец помечен двумя парами FRET, где спектры поглощения и испускания очень похожи, но доноры различаются по своему фотохромизму.Эта ситуация также может возникнуть, когда исследуются два разных взаимодействия с использованием двух доноров и одного общего акцептора. Записанные сигналы флуоресценции представляют собой просто сумму сигналов от отдельных компонентов. где «1» и «2» обозначают первую и вторую пару FRET. После облучения выключенным светом также получаем

    Наши измерения обеспечивают сигналы S DD и S DA до и после выключения.Если предположить, что все четыре коэффициента фотопереключения ρ A и ρ D известны, то эти уравнения представляют собой систему из четырех уравнений и четырех неизвестных, из решения которой можно получить S DD , на и S DA , на для обоих видов. Затем эти значения можно легко использовать для получения коэффициентов эмиссии (сенсибилизированных) для каждой пары, используя уравнения (3) или (5), или эффективность FRET, используя уравнение (6).В принципе, тот же подход можно использовать и для разделения двух пар FRET, состоящих из одного фотохромного донора и флуоресцентного и темного (нефлуоресцентного) акцептора.

    На практике нам неизвестны четыре значения ρ D и ρ A , поскольку они зависят от искомого (сенсибилизированного) коэффициента эмиссии или эффективности FRET. Однако в предыдущем разделе рассматривалось, как определить взаимосвязь между этими параметрами.Учитывая эту информацию, мы рекомендуем использовать итеративную процедуру, в которой (сенсибилизированный) коэффициент излучения или эффективность FRET рассчитывается, исходя из первоначальных предположений для коэффициентов фотопереключения. Затем это значение используется для получения более точных оценок коэффициентов фотопереключения, и эта процедура повторяется до тех пор, пока эти значения не сойдутся, что на практике происходит быстро. Более подробное обсуждение алгоритма, использованного в данной работе, можно найти в разделе 3 дополнительной информации.

    Мы разработали серию численных симуляций, чтобы проверить правильность нашего подхода. Мы предположили образец, меченный двумя спектрально неразличимыми парами FRET, где один из доноров является фотохромным и может быть описан уравнением (10), а другой не проявляет заметного фотохромизма. Кроме того, мы предполагали разные уровни яркости, отраженные в количестве фотонов, которые были бы получены при сборе данных «включено», если бы не произошло FRET. Шум был включен в наши измерения путем имитации шума Пуассона, характерного для процесса обнаружения фотонов.Для каждого условия мы провели 5000 симуляций, в которых мы выбрали случайную эффективность FRET от 0 до 0,6 для каждой пары FRET и сгенерировали два смоделированных сбора данных флуоресценции до и после выключения (см. схему измерения, показанную на рисунке 1b). . Затем эти данные были проанализированы с использованием нашей методологии, в результате чего были получены оценки эффективности FRET для каждой из пар. Затем точность этих результатов была количественно определена с использованием среднего абсолютного отклонения, определяемого как где Θ i — эффективность FRET, полученная на основании данных, и эффективность FRET, оцененная нашим методом.В качестве отрицательного контроля мы также включили результат анализа, который просто генерировал случайную эффективность FRET.

    Моделирование показывает, что наш анализ хорошо работает уже при низких уровнях освещенности, обеспечивая точные результаты при обнаружении 1000 или более фотонов, и менее точные, но полезные результаты уже при уровнях сигнала всего 250 фотонов (рис. 2а). Мы также исследовали, в какой степени разница в характеристиках фотохромизма доноров FRET (Δ ρ ) определяет точность анализа (рисунок 2b и дополнительный рисунок 1).Мы обнаружили, что это зависит от ожидаемой эффективности FRET и коэффициента фотопереключения донора при отсутствии FRET ( ρ 0 ). Однако ρ 0 0,3 или ниже легко достижимо, например, с помощью фотохромные флуоресцентные белки хорошо работают в широком диапазоне эффективности FRET. Кроме того, ρ 0 можно увеличивать или уменьшать, регулируя продолжительность или интенсивность выключающего освещения, что позволяет адаптировать условия к измерению.Наконец, мы отмечаем, что дальнейшее повышение точности возможно за счет включения большего количества приобретений флуоресценции как части выключения (добавление дополнительных приобретений флуоресценции в каждый из циклов измерения, показанных на рисунке 1b).

    Рисунок 2:

    Производительность нашего метода на смоделированных данных. (а) Комбинированная скрипка и диаграмма среднего абсолютного отклонения (MAD) нашего подхода к анализу для различного количества обнаруженных фотонов. Данные были получены путем выполнения 5000 независимых симуляций для каждой категории.(b) Диаграмма рассеяния, показывающая эффективность анализа для различных значений эффективности FRET и коэффициентов фотопереключения (в отсутствие FRET) для фотохромных ( ρ 0, p ) и нефотохромных ( ρ 0, ) np ) донор. 2D-проекции этих данных показаны на дополнительном рисунке 1.

    В принципе, нашу методологию можно использовать для разделения более чем двух перекрывающихся пар FRET путем добавления дополнительных членов к уравнениям (11)–(14).Для каждой дополнительной пары потребуется одно дополнительное измерение флуоресценции за цикл переключения.

    Результаты и обсуждение

    rsAKARev: фотохромный биосенсор для ПКА

    Мы решили экспериментально проверить наш метод, разработав фотохромный биосенсор на основе FRET для активности цАМФ-зависимой протеинкиназы (ПКА), названный rsAKARev (обратимо переключаемая А-киназа). репортер активности с EV-линкером). Мы получили этот биосенсор, заменив донор и акцептор у AKAR3ev [33] на голубой флуоресцентный белок mTFP0.7 и желтый флуоресцентный белок cpVenus172. mTFP0.7 представляет собой вариант яркого и фотостабильного mTFP1 [34], который демонстрирует эффективный фотохромизм с небольшой утомляемостью [35]. cpVenus172 представляет собой круговой пермутант Venus, который, как сообщается, приводит к улучшению контраста FRET [36–38]. Чтобы оценить нашу стратегию разделения, мы решили объединить rsAKARev с нефотохромным биосенсором EKARev [33], который сообщает об активности киназы, регулируемой внеклеточным сигналом (ERK), и состоит из голубого донора ECFP и желтого акцептора YPet.Наш выбор сенсоров отражает фундаментальный интерес к взаимодействиям между консервативными сигнальными путями cAMP/PKA и MAPK/ERK, которые регулируют различные физиологические процессы, включая пролиферацию и рост клеток [39, 40].

    Чтобы охарактеризовать работу наших биосенсоров, мы выполнили измерения на клетках, экспрессирующих либо rsAKARev, либо EKARev, и представили их по схеме измерения, показанной на рисунке 1b. Как и ожидалось, мы обнаружили, что флуоресцентное состояние донорского флуорофора rsAKARev, mTFP0.7, легко исчезает при облучении синим светом и может быть эффективно восстановлено при слабом облучении фиолетовым светом (рис. 3а). Этот фотохромизм донора приводит к большому и обратимому контрасту флуоресценции в эмиссии донора и акцептора с минимальной потерей интенсивности флуоресценции (рис. 3b). Напротив, донор EKARev, ECFP, демонстрирует гораздо более ограниченную модуляцию сигнала флуоресценции (рис. 3c).

    Рисунок 3:

    Поведение фотохромизма rsAKARev и EKARev, экспрессированных в клетках HeLa.( а ) Репрезентативные флуоресцентные изображения донора ( S DD ) и акцептора ( S DA ) флуоресценции rsAKARev до и после выключения. Масштабная линейка, 40 мкм (b, c) Динамика излучения донора и сенсибилизированного акцептора rsAKARev (b) и EKARev (c) во время нескольких циклов облучения. (d, e) Репрезентативные ответы клеток HeLa, экспрессирующих rsAKARev (d) или EKARev (e), во время стимуляции активности PKA или ERK. Временные дорожки окрашены, как указано.Активность PKA стимулировали форсколином (Fsk, 50 мкМ) и IBMX (100 мкМ), активность ERK — PMA (1 мкМ).

    Затем мы оценили, как состояние активации каждого биосенсора влияет на его флуоресцентное излучение. Клетки обрабатывали фармакологическими соединениями, чтобы вызвать активность киназы PKA или ERK, и отслеживали реакцию FRET соответствующего биосенсора с течением времени (рис. 3d, e). Этот ответ был определен с помощью обычного FRET-анализа с использованием только «включенной» флуоресценции, полученной после каждого этапа фиолетового облучения на рисунке 1b.

    Повышение уровня внутриклеточного цАМФ, опосредованное форсколином (Fsk) и 3-изобутил-1-метилксантином (IBMX), сильно увеличивало FRET-ответ rsAKARev. Сходным образом стимуляция клеток форбол-12-миристат-13-ацетатом (PMA), который действует на ERK через вышестоящие киназы [41, 42], вызывала сильный ответ EKARev. Как и ожидалось, наши данные дополнительно показали, что изменения активности PKA также приводят к изменениям коэффициентов фотопереключения ρ D и ρ A (рис. 3d).Напротив, на рисунке 3e показано, что динамика флуоресценции EKARev, вызванная облучением, невелика и в значительной степени не зависит от состояния активации датчика, что согласуется с фотостатической природой ECFP.

    Как мы обсуждали в теории, разделение перекрывающихся пар FRET на основе их фотохромизма требует знания взаимосвязи между коэффициентом фотопереключения и эффективностью FRET. Для нормально функционирующих процессов FRET это можно сделать, используя только одно эталонное измерение и аналитическое выражение зависимости (например,грамм. Уравнение (10)). Однако системы, которые состоят из равновесия между несколькими дискретными состояниями, такими как активное и неактивное состояние биосенсора, не могут быть описаны с использованием этой зависимости. Кроме того, голубые флуоресцентные белки обычно демонстрируют сложное спектроскопическое поведение, такое как мультиэкспоненциальное затухание времени жизни в возбужденном состоянии [43]. Поэтому мы прибегли к прямому измерению полной зависимости в клетках, экспрессирующих либо rsAKARev, либо EKARev (рис. 4). Мы обнаружили, что искомая зависимость может быть эмпирически описана с использованием двойной экспоненты (rsAKARev) или прямой линии (EKARev), обеспечивая модель, которая использовалась в последующем анализе.Рисунок 4b действительно показывает, что коэффициент фотопереключения увеличивается с уменьшением кажущейся эффективности FRET, что противоречит тому, что можно было бы ожидать для системы FRET с двумя состояниями. Вероятно, это связано с неоптимальным значением коррекции просачивания акцептора, хотя это не влияет на последующий анализ разделения, поскольку его влияние автоматически учитывается посредством калибровки in situ .

    Рисунок 4:

    Взаимосвязь между кажущейся эффективностью FRET и коэффициентом фотопереключения эмиссии донора (a, c) и эмиссии акцептора, возбужденной донором (b, d), как определено в экспериментах с одним датчиком на клетках COS-7, экспрессирующих rsAKARev (оранжевый) или Клетки HeLa, экспрессирующие EKARev (синие). n =99 (rsAKARev) или 41 (EKARev) клеток из 1 опыта. Сплошные линии представляют собой эмпирические подгоночные функции для rsAKARev (двойная экспонента) или EKARev (прямая линия), которые использовались для последующего анализа.

    Одновременное измерение двух перекрывающихся биосенсоров FRET

    Затем мы сосредоточились на одновременном измерении экспрессии rsAKARev и EKARev в одних и тех же клетках. Поскольку спектры излучения обоих биосенсоров по существу неразличимы, их ответы было бы трудно разделить на основе классической визуализации FRET.Чтобы создать предсказуемые профили ответа для rsAKARev и EKARev, мы последовательно обработали клетки PMA, Fsk/IBMX, U0126 и H-89. U0126 и H-89 являются ингибиторами, которые реверсируют ответы сигнальных путей MAPK/ERK и PKA соответственно [17]. В идеале эта последовательность манипуляций должна привести к различимым профилям ответов для rsAKARev и EKARev.

    Первоначально мы проводили эти эксперименты на клетках, экспрессирующих один биосенсор, либо rsAKARev, EKARev, либо неактивных мутантах, в которых треонин-мишень киназы был мутирован в аланин, обозначаемый суффиксом «(T/A)».Мы подвергли эти клетки схеме измерения, показанной на рисунке 1b, но проанализировали полученные ответы двумя различными способами: либо с помощью обычного анализа на основе интенсивности, используя только флуоресцентные изображения «включено», полученные после каждого шага фиолетового облучения (рисунок 5a, d, g) или с помощью нашего полного подхода, основанного на фотохромизме (рис. 5b, e, h). Применение обеих методологий анализа к одним и тем же данным позволяет обнаружить любые расхождения между полученными результатами. Подробности процедуры анализа приведены в разделе 3 дополнительной информации.

    Рисунок 5: Сигнальные ответы

    PKA и/или ERK в клетках HeLa, экспрессирующих один (левая, средняя панели) или два (правые панели) биосенсора FRET. Ответы rsAKARev, rsAKARev(T/A), EKARev и EKARev(T/A) представлены в столбцах в соответствии с методом анализа. Темные штриховые линии указывают на результаты, полученные с использованием обычного анализа на основе сенсибилизированного излучения, а сплошные светлые линии указывают на результаты, полученные с использованием представленного здесь анализа на основе фотохромизма. Все кривые представляют собой среднюю кажущуюся эффективность FRET плюс стандартное отклонение (заштрихованная область). n =75 (rsAKARev), 132 (EKARev), 12 (rsAKARev(T/A)), 42 (EKARev(T/A)) клеток для односенсорных экспериментов и 80 (rsAKARev+EKARev), 50 (rsAKARev (T/A)+EKARev), 22 (rsAKARev+EKARev(T/A)) клеток для двухсенсорных экспериментов, из 3, 2, 1, 1 и 2, 1, 1 независимых опытов соответственно. Клетки стимулировали PMA (1 мкМ), форсколином (Fsk, 50 мкМ) и IBMX (100 мкМ), U0126 (20 мкМ) и Н-89 (20 мкМ).

    Традиционный анализ показывает, что биосенсоры реагируют на фармакологическую обработку, как и ожидалось (рис. 5а).Мы действительно наблюдали ингибирование сигнала EKARev при добавлении Fsk/IBMX, что напоминает предыдущие отчеты, в которых было обнаружено, что форсколин мешает EGF-опосредованной активации ERK [17]. Это говорит о том, что аналогичный механизм также действует при стимуляции активности ERK с помощью PMA. Как и ожидалось, реакция биосенсоров мутантов Т/А оставалась нечувствительной к применяемой последовательности манипуляций. Добавление Fsk/IBMX индуцировало снижение ответа EKARev(T/A), подобное наблюдаемому для EKARev, демонстрируя, что этот ответ возникает из-за процесса, отличного от фосфорилирования целевого остатка.Мы также наблюдали более слабое, чем ожидалось, ингибирование сигнала rsAKARev при добавлении H-89. Однако дополнительные эксперименты с использованием свежего образца H-89 показали ожидаемую обратимость реакции биосенсора (дополнительная фигура 2), демонстрируя, что обнаруженная здесь ограниченная обратимость была связана с плохо работающей партией H-89.

    Результаты традиционного анализа и нашей новой стратегии разделения полностью совпадают для экспериментов с одним датчиком, воспроизводящих те же характеристики и отклики.В совокупности различия между основанным на фотохромизме и обычным анализом невелики и вряд ли будут важны для всех, кроме самых требовательных количественных экспериментов.

    Подтвердив нашу стратегию на уровне отдельных биосенсоров, мы перешли к клеткам, одновременно экспрессирующим как rsAKARev, так и EKARev. Наш анализ воспроизводит по существу те же тенденции, что и для случая с одним датчиком (рис. 5c,f,i), демонстрируя, что мы действительно можем разделить две пары FRET, которые демонстрируют практически полное спектральное перекрытие.Мы обнаружили, что одновременное изображение двух биосенсоров приводит к снижению отношения сигнал-шум разделенных ответов (дополнительные рисунки 3 и 4), что согласуется с дополнительной обработкой, необходимой для разделения сигналов, хотя клеточные ответы могут еще легко проверить.

    Мультиплексное обнаружение трех сигнальных активностей

    Наша стратегия разделения может быть напрямую объединена с другими спектрально-различными флуорофорами или сенсорами. В качестве доказательства концепции мы одновременно экспрессировали rsAKARev и EKARev вместе с кальциевым сенсором RCaMP с красным смещением [44].Известно, что кальций модулирует сигнальную активность белков как в сигнальных путях цАМФ/ПКА [45, 46], так и в сигнальных путях МАРК/ERK [47]. Кроме того, было показано, что PKA-опосредованная активация фактора транскрипции CREB происходит через MAPK/ERK и опосредована высвобождением кальция из внутриклеточных запасов [48]. Такие зависимости между путями иллюстрируют потенциал многопараметрического биосенсора.

    Мы последовательно стимулировали клетки с помощью Fsk/IBMX, эпидермального фактора роста (EGF), иономицина и CaCl 2 , чтобы вызвать различимые профили ответа.Иономицин представляет собой ионофор, который транспортирует ионы Ca 2+ по липидным бислоям, что приводит как к высвобождению кальция из внутриклеточных запасов, так и к поглощению кальция из внешней среды или утечке его во внешнюю среду. CaCl 2 добавляли в качестве внутреннего контроля реакции RCaMP. Схематический обзор стимулированных сигнальных путей можно найти на дополнительном рисунке 5.

    Используя нашу стратегию, ответы rsAKARev и EKARev можно было бы различить на основе их фотохромизма, в то время как ответ RCaMP со смещением в красную область можно было бы разделить на основе его различных длины волн возбуждения и излучения.На рис. 6а показаны ответы трех биосенсоров для всех 129 проанализированных клеток. Графики для каждого отдельного биосенсора можно найти на дополнительном рисунке 6 вместе с изображениями репрезентативных клеток (дополнительный рисунок 7) и их соответствующими ответами (дополнительный рисунок 8). Чтобы упростить последующее обсуждение, мы также визуально указываем три разных временных интервала во время нашего измерения в верхней части рисунка 6а.

    Рисунок 6:

    Эксперимент по разделению трех биосенсоров на клетках HEK293T, одновременно экспрессирующих биосенсоры rsAKARev, EKARev и RCaMP.( а ) Цветные ответы RCaMP (красный), EKARev (зеленый) и rsAKARev (синий). (b) 3D-диаграмма рассеяния максимального ответа, окрашенная кластеризацией каждой клетки. (c, d, e) диаграммы максимального ответа, наблюдаемого для rsAKARev (c), RCaMP (d) и EKARev (e) в течение указанных интервалов времени. «*» указывает на значительную разницу (p<0,01, двухвыборочный t-критерий после F-критерия для равных дисперсий (p<0,05)). n =129 клеток из 1 опыта. Клетки стимулировали форсколином (Fsk, 50 мкМ) и IBMX (100 мкМ), EGF (1 мкг/мл), иономицином (Iono, 10 мкМ) и CaCl 2 (2 мМ).

    Как и ожидалось, стимуляция Fsk/IBMX (интервал 1) сильно увеличивает активность PKA во всех клетках, дополнительно показывая, что повышение уровня цАМФ также опосредует временный кальциевый ответ. Это согласуется с предыдущей работой, описывающей перекрестные помехи, происходящие через PKA-опосредованное высвобождение кальция из ER-хранилищ [49, 50]. Затем стимуляция EGF приводит ко второму высвобождению кальция (интервал 2) [51, 52] и к задержке активности ERK (интервал 3) с различной реакцией в разных клетках. Начало ответа ERK несколько перекрывается с добавлением иономицина, хотя этот ответ уже инициируется до добавления в большинстве клеток и достигает плато к тому времени, когда становится очевидным вызванное иономицином высвобождение кальция (дополнительные рисунки 6 и 8).В совокупности это свидетельствует о том, что иономицин оказывает незначительное влияние или не оказывает никакого влияния на активность ERK.

    Визуальный анализ данных показал неоднородность клеточных ответов (рис. 6а). Мы количественно оценили максимальный ответ и время ответов биосенсора в каждом интервале (см. Методы, дополнительная фигура 9) и обнаружили, что кластеризация k-средних может разделить клеточные ответы на три класса на основе их максимальных ответов, визуально показанных на рисунке 6b и подтверждено с помощью частичного дискриминантного анализа методом наименьших квадратов (дополнительная фигура 10).

    Максимальный отклик различных датчиков показал значительные различия между классами (рис. 6c-e). Стимуляция Fsk/IBMX, по-видимому, оказывает несколько более сильное влияние на активность PKA в клетках класса 2, хотя это, по-видимому, не приводит к более высокому переходному уровню кальция, который в целом был очень изменчивым. Наиболее поразительны межклассовые различия в передаче сигналов кальция (интервал 2) и ERK (интервал 3) при стимуляции EGF. В частности, клетки классов 1 и 2 сильно реагируют на активацию ERK, опосредованную EGF, тогда как эффект на клетки класса 3 довольно слабый и происходит с дополнительной задержкой (дополнительная фигура 9h).Кроме того, размеры ответов ERK, по-видимому, не связаны с увеличением предшествующего высвобождения кальция.

    Эти результаты показывают возможность классификации клеток на основе гетерогенности их ответов, хотя из данных не сразу ясно, откуда возникает эта гетерогенность, или если различия в сигнальной активности трех путей биологически коррелируют в контексте этого эксперимента.

    Плохая экспрессия рецепторов EGF [53, 54] или Fsk/IBMX-индуцированные опосредованные эффекты цАМФ [55] могут сделать некоторые клетки менее чувствительными к стимуляции EGF, в то время как дальнейшая гетерогенность также может быть обусловлена ​​высоким уровнем изменчивости, связанной с клетки НЕК293 [56].

    В совокупности наши данные еще раз подтверждают идею о том, что одновременная визуализация нескольких биосенсоров может легко выявить гетерогенность даже в хорошо зарекомендовавших себя системах, демонстрируя при этом, что нашу схему можно легко комбинировать со спектрально-ортогональными биосенсорами для дальнейшего расширения диапазона ответов. что можно измерить.

    Выводы

    В этой работе мы решили разделить вклады двух или более спектрально перекрывающихся пар FRET на основе фотохромизма донорных флуорофоров, наблюдая за их реакцией на облучение выключенным светом.Мы разработали основу для проведения анализа и подтвердили ее применимость с помощью численного моделирования. Мы обнаружили, что наш метод может давать точные результаты уже при низких уровнях освещенности, хотя конкуренция между процессом FRET и фотохромизмом должна быть охарактеризована для каждой из пар FRET.

    Затем мы применили нашу методологию к биосенсорам на основе FRET, многие из которых используют голубые и желтые флуоресцентные белки. Мы показали, что голубой флуоресцентный белок mTFP0.7 можно использовать для создания фотохромного биосенсора активности PKA, который мы назвали rsAKARev.Мы объединили этот сенсор со спектрально перекрывающимся биосенсором EKARev, репортером активности киназы ERK, и показали, что вклад обоих сенсоров можно легко разделить при одновременной экспрессии в живых клетках. Наконец, мы расширили эти эксперименты, включив дополнительный репортер для Ca 2+ , и показали, что этот подход может обнаруживать клеточную гетерогенность в ответ на фармакологическую стимуляцию. Наш метод дополнительно иллюстрирует потенциал одновременного получения нескольких сигналов сигналов для исследования сложных биологических сетей.

    Наш метод легко совместим с существующими конвейерами измерения или анализа, которые могут использовать исходный коэффициент эмиссии, сенсибилизированный коэффициент эмиссии или расчетную эффективность FRET при условии, что он характеризует зависимость между этим показателем и коэффициентом фотопереключения. На практике это, вероятно, потребует отдельного измерения для каждой пары FRET, где коэффициент фотопереключения отслеживается при различных коэффициентах излучения или эффективности FRET. Такое измерение должно выполняться только один раз для каждой пары FRET и дозы выключения света.Этот метод можно легко интегрировать с установленными приборами, требуя только возможности включения и выключения облучения между двумя сборами FRET.

    В принципе, наша процедура может быть использована для разделения вкладов более чем двух пар FRET при условии, что доноры достаточно разделены с точки зрения их фотохромизма. Наше использование двух биосенсоров также отражает ограниченную доступность фотохромных голубых флуоресцентных белков, хотя гораздо больше возможностей доступно при рассмотрении также фотохромных зеленых и красных флуоресцентных белков, которые были бы напрямую совместимы с нашим методом.

    Таким образом, мы показали, что фотохромизм донора можно использовать для достижения FRET-мультиплексирования с использованием простой схемы линейного разделения при условии, что ответы пар FRET хорошо охарактеризованы. Наша стратегия может быть легко использована как часть экспериментов, которые требуют мультиплексного зондирования взаимодействия и биозондирования.

    Методы

    Конструкция биосенсора

    Экспрессионные плазмиды были созданы с использованием комбинации полимеразной цепной реакции (ПЦР), расщепления рестрикционными ферментами и методов молекулярного клонирования Gibson Assembly.Для реакций сборки Гибсона векторную ДНК расщепляли ферментами рестрикции, разрезающими сайт множественного клонирования. Все остальные фрагменты ДНК были получены методом ПЦР с Q5-полимеразой с использованием последовательностей праймеров с оптимальной температурой отжига 72°C, рассчитанной с помощью калькулятора NEB Tm (https://tmcalculator.neb.com), и с минимальным перекрытием 20 -пар оснований между соседними фрагментами. Затем все фрагменты очищали с помощью гель-экстракции и впоследствии объединяли в реакции сборки Гибсона в соответствии с инструкциями производителя.rsAKARev был получен путем замены кДНК для YPet и ECFP в AKAR3EV (вектор pcDNA3.1+) на кДНК для mTFP0.7 и cpVenus172 соответственно. Для rsAKARev(T/A) праймеры для ПЦР модифицировали для введения мутации T/A в область субстрата PKA. Для получения EKARev(T/A) были разработаны праймеры для ПЦР для введения мутации T/A в область субстрата ERK.

    Культура клеток и трансфекция

    Клетки HeLa, COS-7 и HEK293T культивировали в среде Игла, модифицированной Дульбекко (DMEM; Gibco, #31053028), с добавлением 10% (об./об.) эмбриональной бычьей сыворотки (FBS; Gibco, #70011036). ), 1X Glutamax (Gibco, #35050061) и 50 мкг/мл гентамицина (GM; Sigma-Aldrich, #15750060) и выдерживали во влажном инкубаторе (37°C, 5% CO 2 ).За 24 ч до трансфекции клетки высевали на стерильные 35-мм чашки со стеклянным дном (MatTek) и выращивали до 30-70% слияния. Затем клетки трансфицировали за 24–48 часов до визуализации с использованием реагента для трансфекции FuGENE6 (Promega) и плазмидной ДНК в соответствии с протоколом производителя. Для достижения оптимальных результатов трансфекции 90 мкл DMEM, содержащей 3 мкл FuGENE6, тщательно пипетировали в 10 мкл сверхчистой воды, содержащей в общей сложности 1 мкг ДНК, и каждую смесь оставляли не менее чем на 20 минут перед добавлением в каждую чашку по каплям.Для экспериментов с несколькими биосенсорами относительные количества плазмидной ДНК оптимизировали для получения сравнимой экспрессии всех конструкций. Затем клетки выращивали еще в течение 24 часов (HeLa) или 48 часов (HEK293T, COS-7) перед визуализацией. Наконец, клетки были переведены на среду со сниженным содержанием сыворотки, содержащую DMEM (HEK293T, COS-7) или FluoroBrite DMEM (Gibco, № A1896702) (HeLa), дополненную 0,5% (об./об.) FBS, 1X Glutamax и 50 мкг/мл GM. 4–6 ч (HEK293T) или 16–20 ч (COS-7, HeLa) до визуализации.

    Покадровая флуоресцентная визуализация

    Обработка клеток

    Перед визуализацией 35-мм чашки со стеклянным дном дважды осторожно промывали фосфатно-солевым буфером (PBS; Gibco, #70011036), а затем визуализировали в темноте в сбалансированный солевой раствор (HBSS; Gibco, № 14185052) с добавлением 0.2% (масс./об.) бычьего сывороточного альбумина (BSA; Gibco, #10270106) (HEK293T, COS-7) при комнатной температуре или в FluoroBrite DMEM с добавлением 0,5% (об./об.) FBS и 1X Glutamax (HeLa) при 37°C, 5% CO 2 . Клетки обрабатывали в указанные моменты времени, используя конечную концентрацию 50 мкМ форсколина (Fsk) (Sigma-Aldrich, #93049), 100 мкМ 3-изобутил-1-метилксантина (IBMX) (Sigma-Aldrich, #410957), 1 мкг/мл. мл эпидермального фактора роста (EGF) (R&D Systems, #236-EG10), 10 мкМ иономицина (Iono) (Sigma-Aldrich, #407950), 2 мМ CaCl 2 (Chem-Lab Analytical, #CL05.0371), 1 мкМ форбол-12-миристат-13-ацетата (PMA) (Sigma-Aldrich, #P1585), 20 мкМ U0126 (Sigma-Aldrich, #662005) и 20 мкМ H-89 (Sigma-Aldrich, #B1427). ), путем смешивания 5-кратного концентрированного раствора, приготовленного в буфере для визуализации из свежеразмороженных запасов ДМСО (Fsk, IBMX, PMA, U0126, H-89) или HBSS (CaCl 2 ), в чашку для визуализации.

    Оборудование

    Изображения были получены с помощью инвертированного микроскопа Olympus IX-71, соединенного со световым двигателем Spectra X (Lumencor), объективом 10× UplanSApo (Olympus), ORCA-Flash5.0 LT (Hamamatsu), моторизованная флуоресцентная кубическая турель IX2-RFACA (Olympus), устройство смены оптических фильтров Lambda 10-B (Sutter) и высокоточный моторизованный столик h217 (Prior). Все оборудование управлялось с помощью собственного программного обеспечения. Эксперименты проводились при 37°C, 5% CO 2 с использованием инкубатора со столиком (h401-NIKON-TI-S-ER, OKOLAB), соединенного с цифровым блоком управления CO2 (CO2-UNIT-BL, OKOLAB). .

    Приобретение изображения

    После обозначения из теории, S DD , S , S S и S S AA Каналы обнаружения АА были приобретены с помощью T455LP ( с DD , S DR DA ) или ZT514RDC ( S S AA ) Дихроическое зеркало и A AT480 / 40M ( S DD ) или ET545 / 40M ( S DA , S AA ) эмиссионный фильтр (все Chroma).Каждый образец был возбужден синим светом (438/29 нм, 35,6 мВт; с , , S DA DA ) или светлый свет (513/22 нм, 2,45 мВт; S AA ). Интенсивность RCaMP была получена с использованием дихроичного фильтра ZT561rdc и эмиссионного фильтра HQ572lp (все Chroma) с возбуждением зеленым светом (542/33 нм, 39,0 мВт). Все изображения были получены во время экспозиции камеры 50 мс. Каждое измерение выполнялось в течение постоянных интервалов времени каждые 10-30 секунд в нескольких положениях образца.

    Параметры облучения для фотохромизма определяли как минимальную дозу света, необходимую для достижения стационарной флуоресценции во время включения и выключения mTFP0.7, что было достигнуто путем облучения 0,2 с фиолетовым светом (390/22 нм, 26,7 мВт) и 0,2 с. с синим светом (438/29 нм, 78,35 мВт) соответственно. S DD и S DA флуоресценцию получали после каждого этапа облучения; S AA флуоресценция была получена только для подмножества временных точек, чтобы свести к минимуму фотообесцвечивание акцептора.

    FRET-анализ

    Анализ временных рядов флуоресценции был выполнен с использованием собственного программного обеспечения для анализа, работающего на Igor Pro 8 (WaveMetrics). Для каждого положения образца определяли несколько областей интереса (ROI), соответствующих отдельным клеткам, и определяли среднюю интенсивность по форме клетки в каждый момент времени. Затем интенсивность корректировали с учетом фона путем вычитания среднего сигнала области за пределами границ ячейки. Эту поправку можно улучшить, вычитая вместо этого сигнал, наблюдаемый для нетрансфицированных клеток, хотя мы не преследовали этого здесь, поскольку излучение от нетрансфицированных клеток было намного меньше, чем как фон, так и излучение от трансфицированных клеток.Полученные средние значения интенсивности использовались для дальнейшего анализа.

    Для обычного FRET-анализа экспериментов с одним датчиком эффективность FRET впоследствии рассчитывалась в соответствии с уравнением (6) с использованием только флуоресценции с поправкой на фон, обнаруженной после каждого этапа фиолетового облучения в схеме измерения, показанной на рисунке 1b. Анализ фотопереключения в экспериментах с одним и двумя биосенсорами выполняли, как подробно описано в теории, с использованием уравнений (11)-(14). Процедура анализа более подробно описана в дополнительном разделе 3.

    Из экспериментов с одним датчиком зависимости ρ (Θ) были определены эмпирически путем подгонки двойной экспоненциальной функции (rsAKARev) или прямой линии (EKARev) по объединенным данным ячеек, представленным на рисунке 4, с использованием регрессии ортогонального расстояния.

    Коэффициенты α , δ и γ (дополнительная таблица 1) были рассчитаны на основе опубликованных значений квантовых выходов флуоресценции (QY), параметров прибора и доступных спектральных данных в базе данных флуоресцентных белков FPbase [57] , как описано в разделе 4 дополнительной информации.

    Эксперимент с разделением трех биосенсоров

    Эффективность FRET для rsAKARev и EKARev была получена, как описано выше. Необработанные интенсивности RCaMP были получены путем усреднения соответствующего излучения по тем же интересующим областям, а также включали удаление фона путем вычитания сигнала из интересующей области, которая не включала никаких клеток.

    Мы обнаружили, что как кривые FRET, так и RCaMP демонстрируют постепенное уменьшение амплитуды, что мы приписываем фотообесцвечиванию флуорофоров.Мы исправим это, используя базовый уровень, который определяется для каждой трассы.

    Для измерений FRET базовая линия определяется путем подгонки кривой с помощью функции где множитель в скобках — стандартная сигмоидальная функция. Тогда базовая линия определяется как b e т/τ . τ обычно намного больше продолжительности эксперимента.

    Для измерений RCaMP мы оценили базовый уровень, используя биэкспоненциальную функцию для тех частей кривой, которые не показывают повышенный сигнал кальция.

    Затем мы рассчитали ответы как где «сигнал» — эффективность FRET для rsAKARev и EKARev и интенсивность флуоресценции для RCaMP. Полученные ответы показаны на рисунке 6а, где мы вручную оптимизировали цветовую шкалу, чтобы выделить клеточные ответы. Мы дополнительно показываем примерные следы, их соответствующие базовые уровни и рассчитанные ответы на дополнительных рисунках с 11 по 13. Ответы клеток на фармакологическую стимуляцию определяли количественно, принимая значение максимального ответа, наблюдаемого в течение интервала времени после стимуляции.

    Время начала откликов биосенсора FRET определяли как время, за которое сигмоидальная аппроксимация отклика увеличивается до 7,6% от своего максимального значения, а время начала данных RCaMP определяли как момент времени, в который вторая производная ответ достиг своего максимального значения.

    Частичная кластеризация k-средних была выполнена в Matlab R2019b на основе ответов, определенных для rsAKARev за временной интервал 1, для RCaMP за временной интервал 2 и для EKARev за временной интервал 3.Чтобы проверить результаты классификации кластеризации K-средних, был выполнен частичный дискриминантный анализ методом наименьших квадратов (PLS-DA) для наборов данных полной трассировки (% увеличения), предполагая три класса, полученные кластеризацией K-средних. Впоследствии результаты кластеризации были перекрестно проверены с помощью модели PLS-DA с использованием доверительного интервала 95%. Дополнительная информация доступна в разделе 5 дополнительной информации.

    Статистика и воспроизводимость

    Все статистические тесты проводились в GraphPad Prism 5 (программное обеспечение GraphPad).Все данные были проверены на нормальность с помощью комплексного теста Д’Агостино и Пирсона. Затем было проведено попарное сравнение с использованием непарного двустороннего t-критерия Стьюдента или критерия неравной дисперсии Уэлча для гауссовских данных или с использованием U-критерия Манна-Уитни для негауссовых данных со значением, установленным на уровне P <0,01.

    Произошла ошибка при настройке пользовательского файла cookie

    Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности. Если ваш браузер не принимает файлы cookie, вы не можете просматривать этот сайт.


    Настройка браузера на прием файлов cookie

    Существует множество причин, по которым файл cookie не может быть установлен правильно. Ниже приведены наиболее распространенные причины:

    • В вашем браузере отключены файлы cookie. Вам необходимо сбросить настройки браузера, чтобы принять файлы cookie, или спросить вас, хотите ли вы принимать файлы cookie.
    • Ваш браузер спрашивает, хотите ли вы принимать файлы cookie, и вы отказались. Чтобы принять файлы cookie с этого сайта, нажмите кнопку «Назад» и примите файл cookie.
    • Ваш браузер не поддерживает файлы cookie. Попробуйте другой браузер, если вы подозреваете это.
    • Дата на вашем компьютере в прошлом. Если часы вашего компьютера показывают дату до 1 января 1970 г., браузер автоматически забудет файл cookie. Чтобы это исправить, установите правильное время и дату на своем компьютере.
    • Вы установили приложение, которое отслеживает или блокирует установку файлов cookie. Вы должны отключить приложение при входе в систему или проконсультироваться с системным администратором.

    Почему этому сайту требуются файлы cookie?

    Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности, запоминая, что вы вошли в систему, когда переходите со страницы на страницу. Предоставить доступ без файлов cookie потребует от сайта создания нового сеанса для каждой посещаемой вами страницы, что замедляет работу системы до неприемлемого уровня.


    Что сохраняется в файле cookie?

    Этот сайт не хранит ничего, кроме автоматически сгенерированного идентификатора сеанса в файле cookie; никакая другая информация не фиксируется.

    Как правило, в файле cookie может храниться только та информация, которую вы предоставляете, или выбор, который вы делаете при посещении веб-сайта. Например, сайт не может определить ваше имя электронной почты, если вы не решите ввести его. Разрешение веб-сайту создавать файлы cookie не дает этому или любому другому сайту доступ к остальной части вашего компьютера, и только сайт, создавший файл cookie, может его прочитать.

    Рекомендации по разработке анализов FRET

    Это техническое примечание было предоставлено ProZyme, участником выставки DrugDiscovery ’99 в Бостоне.

    Введение

    Анализы FRET обеспечивают надежную платформу анализа для высокопроизводительного скрининга и стали предпочтительным методом анализа благодаря своим многочисленным преимуществам, в том числе:

    • Гибкий формат анализа (анализы могут быть количественными или кинетическими, прямыми или непрямыми [ингибирование или конкуренция]
    • Анализы могут измерять взаимодействия белок-белок, белок-нуклеиновая кислота, рецептор-лиганд и иммунохимические взаимодействия [иммуноанализы], гибридизацию нуклеиновых кислот и ферментативную активность).
    • Однородный (просто пипетировать, инкубировать и измерить)
    • Быстрый, высокочувствительный и автоматизированный
    • Миниатюризируемый
    • Стабильные реагенты
    • Может быть конъюгирован с известным белком.

    Резонансный перенос энергии флуоресценции (FRET) происходит между двумя парными красителями, когда донорный краситель поглощает фотон, переводя электрон в более высокое энергетическое состояние, и через резонанс возбуждение этого электрона передается другому электрону во втором красителе, акцептор.Эта энергия затем переизлучается в виде фотона, который менее энергичен и, следовательно, имеет другой цвет (с большей длиной волны), чем первоначально поглощенный фотон. FRET происходит только тогда, когда красители находятся в непосредственной близости (рис. 1).

    Поскольку FRET может происходить только тогда, когда участвующие красители находятся очень близко друг к другу, его можно использовать в качестве индикатора близости между парами молекул, например, участвующих в реакциях связывания, помеченных парами подходящих красителей. Когда близость, основанная на связывании, вызывает FRET, флуоресценция смеси красителей изменяется двояко: снижается флуоресценция молекулы донора, поскольку энергия, которая должна была бы высвобождаться в виде фотонов, вместо этого передается через резонанс к акцептору, и флуоресценция акцептора увеличивается из-за высвобождения в виде фотонов энергии, полученной в результате переноса энергии.

    Многие анализы на основе FRET включают измерение обоих этих изменений, обеспечивая усиленный сигнал.

    Анализы FRET могут быть либо прямыми, когда краситель присоединяют к анализируемому реагенту, либо непрямыми, когда неизвестный тестируется на предмет его ингибирующего или конкурентного действия на реакцию связывания между двумя известными мечеными молекулами.

    В настоящее время в FRET используются два основных класса красителей: фикобилипротеины и производные лантанидов.Фикобилипротеины представляют собой водорастворимые белковые вспомогательные пигменты, обнаруженные во многих видах водорослей (TechNote TNPB100, Обзор фикобилипротеинов). Уже более десяти лет они широко используются в проточной цитометрии, где обычно считаются самыми яркими из доступных флуоресцентных меток. Их яркость достигается за счет присутствия нескольких флуорофоров (отдельных флуоресцентных фрагментов) в каждой молекуле в сочетании с квантовой эффективностью, одной из самых высоких среди всех красителей.

    В природе фикобилипротеины участвуют в FRET в качестве вспомогательных фотосинтетических пигментов.Энергия передается по цепи фикобилипротеинов от фикоэритрина -> фикоцианина -> аллофикоцианина и далее к хлорофиллу а. Близость между фикобилипротеинами поддерживается в молекулярном ансамбле, называемом фикобилисомой, которая сама по себе может использоваться в качестве флуоресцентной метки (TechNote PB100.2 Phycobilisomes). Таким образом, фикобилипротеины превратились в чрезвычайно эффективные средства для поглощения и передачи световой энергии, что делает их особенно подходящими для использования в тестах FRET (TechNote TNPJ100.2 Фикобилипротеины в анализе FRET).

    Из-за особых свойств красителей на основе лантанидов их часто сочетают с фикобилипротеинами в анализах, называемых FRET с временным разрешением (TR-FRET). При изолировании в виде хелатов или криптатов лантаноиды могут использоваться в качестве донора FRET. Длительное время жизни флуоресценции этих комплексов лантанидов используется, чтобы избежать определенных проблем с дизайном анализа, касающихся фоновой флуоресценции (TechNote TNPJ100.1, FRET против TR-FRET). Аллофикоцианин фикобилипротеина (APC, иногда называемый XL655) обычно сочетается с этими донорами с длительным сроком жизни.Множественные флуорофоры APC повышают его способность успешно получать передачу энергии, а пик его излучения удобно попадает между множественными пиками излучения наиболее распространенного донора TR-FRET, европия (рис. 2).

    Разработка тестов

    Разработка анализов FRET требует внимания к нескольким аспектам системы анализа. По большей части эти же соображения применимы независимо от того, разрабатывается ли анализ FRET или TR-FRET. См. техническое примечание TNPJ100.10 для примера разработки анализа для фикобилипротеина FRET.

    Выбор пары близости

    Основная функция молекулы-донора — световая антенна, собирающая световую энергию, которая может быть передана акцептору. Желателен донор с большим стоксовым сдвигом, допускающий возбуждение на длине волны, значительно меньшей длины волны акцепторного возбуждения. Акцептор выбирают на основе его способности соответствовать колебательному уровню донорных флуорофоров, что следует из перекрытия между спектром излучения донора и спектром возбуждения акцептора.Однако из-за других факторов, таких как выравнивание диполей и расстояние между молекулами в экспериментальной системе, пригодность конкретной пары близости всегда должна быть подтверждена эмпирически. Предсказание пригодности для FRET особенно сложно для фикобилипротеинов, где присутствие нескольких флуорофоров в одной молекуле усложняет прогнозирование. В некоторых случаях высокая эффективность фикобилипротеина FRET может быть достигнута даже при умеренном спектральном перекрытии (TechNote TNPJ100.1 FRET против TR-FRET).

    Окна подсветки и обнаружения

    Длины волн освещения для анализа FRET следует устанавливать на основе понимания характеристик возбуждения как донора, так и акцептора. Полезным в этом отношении может быть расчет отношения возбуждения донора к возбуждению акцептора в зависимости от длины волны (TechNote TNPJ100.6 Окна освещения и обнаружения в анализах FRET). Непиковое возбуждение донора часто является приемлемой альтернативой из-за превосходной яркости фикобилипротеиновых реагентов.При выборе длин волн обнаружения следует учитывать аналогичное сравнение спектров излучения донора и акцептора. Самогашение (см. ниже) также следует учитывать при выборе окна обнаружения.

    Самозатухающий

    Акцепторные красители с небольшим стоксовым сдвигом, в том числе популярный краситель аллофикоцианин, следует добавлять в анализы FRET в умеренных количествах из-за потенциальной возможности значительного повторного поглощения испускаемых фотонов самим красителем.Если краситель присутствует в значительном избытке, это может существенно уменьшить кажущийся сигнал FRET (TechNote TNPJ100.3 Самогашение в анализах Fret)

    Сигнал, фон и шум

    В любом анализе конечной целью является максимальное соотношение сигнал/шум результатов. В TR-FRET одним из преимуществ обнаружения с временной задержкой является уменьшение фонового сигнала из-за излучения акцептора, возникающего в результате непикового возбуждения акцептора источником освещения.Поскольку фон уменьшается, изменчивость фона обычно также уменьшается, что приводит к уменьшению изменчивости расчетного чистого сигнала.

    Однако не следует путать сигнал-фон и сигнал-шум; преимущества снижения шума из-за низкого фона получаются за счет более слабого сигнала, из-за:

    • плохих антенных свойств лантаноидов и
    • ограничения обнаружения флуоресценции как во времени (из-за обнаружения в ограниченное временное окно) и по длине волны (из-за узкого окна между множественными пиками излучения лантаноидов).

    Этот более слабый сигнал более подвержен изменчивости (шуму).

    В FRET фикобилипротеина могут быть предприняты шаги для уменьшения фона за счет соответствующего выбора красителей и окон обнаружения (см. Выше), но более сильный сигнал может быть более чем достаточным, чтобы компенсировать недостатки несколько более высокого фона.

    Сбор и интерпретация данных

    В имеющихся в продаже приборах TR-FRET флуоресценция акцептора и донора измеряется в двух отдельных окнах обнаружения, часто называемых каналом A и каналом B соответственно.Результаты обычно представляются как отношение канала А к каналу В, которое усиливает кажущийся ответный сигнал, поскольку FRET обычно приводит как к увеличению в канале А, так и к уменьшению в канале В, поскольку флуоресценция донора заменяется флуоресценцией акцептора.

    Однако исследователи все чаще обнаруживают, что значительная информация теряется при изучении только соотношения A:B и что изменения обоих значений следует рассматривать совместно. Те же соображения применимы к анализу данных фикобилипротеина FRET (TechNote TNPJ100.8 Сбор и интерпретация данных в тестах FRET).

    Влияние на сигнал, не зависящее от анализа

    Несколько процессов, происходящих в смесях для анализа, приводят к изменениям сигнала, которые могут быть неверно истолкованы как активность анализа или могут маскировать активность анализа:

    Гашение – когда анализируемый образец содержит светопоглощающие вещества, сигнал в одном из каналов или в обоих каналах может быть снижен. Это служит для компенсации кажущегося отклика канала А и усиления кажущегося отклика канала В.Изучение сигналов А и В, а не только их соотношения, во многих случаях может позволить идентифицировать образцы со значительным гашением.

    Автофлуоресценция. Флуоресценция анализируемого образца может проявляться в любом канале или в обоих. В TR-FRET большая часть аутофлуоресценции затухает до проведения измерений. В FRET эффекты автофлуоресценции можно свести к минимуму путем:

    • выбора акцептора с длиной волны излучения более 600 нм, при которой автофлуоресценция минимальна, и
    • соответствующего анализа сигналов A и B.

    Неспецифический перенос энергии. Многие флуоресцентные реагенты благодаря присущим им свойствам или свойствам, приобретенным в результате конъюгации, могут напрямую связываться с другими флуоресцентными реагентами. Хотя аффинность такого связывания, как правило, намного ниже, чем наблюдаемая в анализах, результирующая флуоресценция, тем не менее, может быть значительной по сравнению с сигналом анализа, и это не редкость для некоторых коммерчески доступных реагентов TR-FRET. План анализа должен включать соответствующие бланки для взаимодействий реагентов и, предпочтительно, использовать реагенты, специально разработанные для минимизации этого источника ложного сигнала (TechNote TNPJ100.5 Неспецифический перенос энергии в анализах FRET).

    Для получения дополнительной информации: Ким Грейнджер, Prozyme, 1933 Davis Street, Suite 207 San Leandro, CA 94577-1258. Тел.: 510-638-6900. Факс: 510-638-6919.


    Глоссарий

    Акцептор — При резонансной передаче энергии молекула, которая получает передачу энергии и испускает фотон.

    Фон — необработанный сигнал, когда активность анализа равна нулю.

    Канал А — флуоресценция, измеренная через фильтр, выбранный для измерения флуоресценции акцептора; увеличивается, когда происходит FRET.

    Канал B — флуоресценция, измеренная через фильтр, выбранный для измерения флуоресценции донора; уменьшается, когда происходит FRET.

    Донор — При резонансной передаче энергии молекула, которая поглощает фотон и инициирует передачу энергии акцептору.

    Флуоресценция — Энергия, испускаемая в виде фотонов, когда возбужденные молекулы возвращаются в свое основное состояние.

    Флуорофор (хромофор) — химическая часть молекулы красителя, которая поглощает свет и, в случае флуорофора, излучает свет посредством флуоресценции.

    FRET — Резонансная передача энергии флуоресценции. В двух соседних красителях энергия возбужденного электрона одного красителя (донора) передается электрону соседнего красителя (акцептора) через резонанс, а затем высвобождается в виде фотона.

    HTRF — гомогенная флуоресценция с временным разрешением, торговая марка Packard Instruments.

    Шум — статистическая изменчивость отклика анализа из всех источников, включая: вариации фактических количеств добавленных реагентов или их концентрации, вариабельность выходных данных прибора, геометрию планшетов, неопределенность или вариабельность фона и т. д.

    Фикобилипротеины — вспомогательные фотосинтетические пигменты, обнаруженные у цианобактерий, красных водорослей и криптомонад, которые поглощают свет в областях спектра, где хлорофилл плохо поглощает и передает энергию хлорофиллу для использования в фотосинтезе. Хромофоры (линейные тетрапирролы, называемые билинами) прикреплены к белковому каркасу.

    Пара близости — два флуоресцентных красителя, выбранных из-за их способности успешно достигать FRET, когда они находятся в непосредственной близости в анализе FRET или в тандемном красителе.

    Квантовая эффективность — доля поглощенных фотонов, выпущенных в виде флуоресценции.

    Гашение – поглощение света в аналитической смеси либо реагентами, либо примесями.

    Необработанный сигнал — сигнал до коррекции фона.

    Самогашение — тенденция флуорофоров с небольшими стоксовыми сдвигами поглощать фотоны на тех же длинах волн, на которых они излучают.

    Сигнал — «реальный» ответ анализа на активность в образце, не зависящий от всех источников ошибок и статистической изменчивости, с поправкой на любой фон.

    Стоксовский сдвиг — разница в длине волны между пиками флуоресцентного излучения и возбуждения данного красителя.

    Тандемный флуоресцентный краситель (тандемный краситель, тандемный конъюгат) — Два флуоресцентных красителя, способных к FRET ковалентно связаны. Тандемные красители используются, когда желательны повышенные стоксовы сдвиги или несколько длин волн излучения от одной длины волны возбуждения.

    CIGS

    Инновационный грант CICE 2019 был присужден 9 захватывающим проектам с большим упором на междисциплинарное сотрудничество, ведущее к возможной коммерциализации.В выбранных проектах используются инновационные технологии от дронов до виртуальной реальности для решения проблем, с которыми мы сталкиваемся как общество. Если вы хотите узнать больше об этих проектах, свяжитесь с нами по адресу [email protected]

     

    Количественная оптическая газовая визуализация утечек метана с использованием систем инфракрасных камер, установленных на дронах

    Кафедра: Физика и науки о Земле

    PI: Доктор Фил Коул и доктор Джим Джордан

    В настоящее время не существует надежной технологии для дистанционного определения скорости утечки углеводородов из трубопроводов в режиме реального времени.Целью всего проекта является определение чувствительности хорошо откалиброванной системы инфракрасного изображения к десяти видам углеводородов по пяти параметрам: скорость ветра, массовая доля, массовый расход, расстояние и контрастная температура. В продолжение прошлого года этот проект расширяет методы калибровки и разрабатывает метод количественного определения массового расхода углеводородов с помощью оптической визуализации газа. Этот проект осуществляется в сотрудничестве с Infared Cameras Inc.

    .
    Создание решений IoT для продвижения качественного медицинского обслуживания пожилых людей, проживающих в сельских районах на юго-востоке и востоке Техаса

    Факультет: Сестринское дело и информатика

    ИП: Др.ЛиЭнн Чизхолм и доктор Синья Лю

    В настоящее время в юго-восточной области нет доступных систем для агрегирования данных с нескольких устройств у сельских пациентов и передачи данных осмысленным образом их сельским поставщикам медицинских услуг. В рамках этого совместного проекта будет разработана система для сбора данных о состоянии здоровья в сельской местности.


    Мониторинг состояния здоровья опор линий электропередач и расчистки растительности с помощью беспилотных летательных аппаратов и нейронной сети с глубоким обучением

    Факультет: Компьютерные науки и промышленная инженерия

    ИП: Др.Цзин Чжан и доктор Сокён Хван и доктор Берна Токгоз

    Опоры распределительной сети электроснабжения, передающие энергию от местных подстанций к потребителям, чрезвычайно уязвимы к частым и масштабным повреждениям, вызванным суровыми погодными условиями, такими как порывы ветра, бури и ураганы. Разросшаяся растительность вблизи линий электропередач также вызывает электрическую дугу и представляет собой еще одну серьезную угрозу для распределительной сети. Целью данного проекта является разработка автоматизированной, недорогой, портативной и надежной системы контроля за исправностью опор ЛЭП и управления растительностью вблизи ЛЭП.


    Перспективная коммерциализация недорогой антибактериальной салфетки, не содержащей химикатов

    Факультет: Химическая инженерия и экологическая инженерия

    PI: Доктор Клейтон Джеффрис и доктор Лив Хазельбах

    Рынок антимикробных салфеток (дезинфицирующих салфеток, губок и т. д.) быстро растет, и все большая часть этой коммерческой деятельности использует материалы, наполненные наночастицами серебра или меди (AgNP/CuNP), которые обладают антимикробными свойствами.AgNP легко синтезировать и легко приготовить в виде стабильных растворов, подходящих для нанесения или вливания в текстильные и бумажные ткани. В рамках этого проекта будут изготовлены и протестированы более дешевые и эффективные антибактериальные салфетки с наночастицами меди в соответствии с отраслевыми стандартами, а также будет определена наиболее рентабельная дозировка для каждой продаваемой единицы.


    Оценка полифенольных соединений для снижения агрегации A-бета и клеточной токсичности

    Кафедра: Химическая инженерия и биология

    ИП: Др.Джеймс Генри и доктор Мариам Васефи

    Болезнь Альцгеймера (БА) является седьмой по значимости причиной смерти в Соединенных Штатах, поражая 5,5 миллиона американцев, и ожидается, что это число удвоится к 2050 году из-за ожидаемого дальнейшего увеличения средней продолжительности жизни и населения США. Текущее лечение (управление поведением и симптомами) не устраняет необходимость лечения основного состояния, образования и отложения олигомеров A-бета. Поскольку образование А-бета является фактом существования, становится необходимым определить диетические и нутрицевтические решения, которые могут быть пожизненными профилактическими мерами.Этот проект будет направлен на использование передовых технологий и хорошо зарекомендовавших себя методов для оценки легкодоступных пищевых продуктов (полифенолов) для определения жизнеспособных целей для таких долгосрочных профилактических мер.


    Измерение силы сцепления капель жидкости с проволокой туманоуловителя с использованием акустики и нитиноловой технологии датчика силы Миллиньютона

    Кафедра: Физика

    PI: Доктор Рафаэль Де Ла Мадрид

    Основной целью данного исследования является усовершенствование конструкции туманоуловителя путем получения данных об адгезии, которые оказались недостижимыми из-за ограничений существующих методов.В проекте будут использоваться современные акустические технологии и датчики силы для измерения силы, необходимой для удаления капель жидкости из моноволокна, используемого в туманоуловителях. В этом проекте также будет измеряться работа адгезии мононити-жидкость.


    Разработка совместной системы БПЛА (беспилотных летательных аппаратов) для повышения безопасности на нефтеперерабатывающих заводах в неограниченных условиях и пример на предприятии среднего размера

    Кафедра: Промышленная инженерия

    ИП: Др.Юэцин Ли и доктор Синьюй Лю

    Исследование направлено на разработку совместной системы БПЛА (дронов) для повышения безопасности на нефтеперерабатывающих заводах в неограниченных условиях, таких как дождь, снег, туман, ночь и т. д. Будет предложен алгоритм обработки изображений. Система будет оцениваться в режиме реального времени на предприятии среднего размера (50-249 сотрудников). Будет предложена полная стратегия применения совместной системы БПЛА в местных отраслях и сообществах.


    Расширенное исследование динамики смачивания: понимание фундаментальной физики защиты от обрастания, коррозии и снижения трения

    Кафедра: Машиностроение

    ИП: Др.Пинг Хэ и доктор Чун-Вэй Яо

    Целью данного исследования является выявление общих условий контроля микропаттерна, разделяющего состояния Кэсси-Бакстера и Вензеля. Когда капля жидкости взаимодействует с субстратом с микроузором (который может быть природным продуктом, например, листом лотоса или искусственной поверхностью), существует два основных состояния смачивания: состояние Кэсси-Бакстера (CB) и состояние смачивания. Венцель (WZ) государство. В состоянии CB капля находится поверх микроузоров, а в состоянии WZ капля погружается в долины микроузоров.долины. Оба состояния могут привести к гидрофобным условиям, если сам материал является гидрофобным; однако, поскольку CB имеет ограниченную площадь контакта жидкости с твердым телом, намного меньшую, чем WZ, он снижает трение жидкости, твердого тела, коррозию и склонность к загрязнению намного лучше, чем WZ.

    Добавить комментарий

    Ваш адрес email не будет опубликован.