Разное

Длина х рей лада: Лада Икс Рей Кросс технические характеристики 2020-2021 г на Lada XRAY Cross, официальный дилер, Москва

Содержание

Лада Икс Рей — комплектации и цены

Двигатель
Количество передач 5 5
Марка топлива 4165 4165
Мощность двигателя (л.с.) 106 122
Объем двигателя 1.6 1.8
Привод Передний Передний
Тип двигателя АИ-95 АИ-95
Топливный бак (л) 50 50
Трансмиссия MT Робот
Габаритные размеры
Высота (мм) 1570 1570
Колесная база (мм) 2592 2592
Количество дверей 5 5
Количество мест 5 5
Объем багажника 361 / 1207 361 / 1207
Полная масса 1650
1650
Снаряженная масса 1190 1190
Ширина (мм) 1764 1764
Динамические характеристики
Время разгона (0-100 км/ч, с) 11.4 10.9
Максимальная скорость (км/ч) 176 186
Подвеска
Дорожный просвет (мм) 195 195
Задняя подвеска полунезависимая, пружинная полунезависимая, пружинная
Передняя подвеска независимая, пружинная независимая, пружинная
Размер колес 195 / 65 / R15 205 / 55 / R16 195 / 65 / R15 205 / 55 / R16
Расход топлива
Городской (л/100 км) 5.9 5.8
Километров на баке 694 735
Смешанный (л/100 км) 7.2 6.8

Размеры и габариты Лада Икс Рей

Новинка отечественного автопрома Lada XRay уже почти год сходит с конвейера концерна и тестируется автолюбителями в реальных условиях российских дорог.

Тех же, кто только планирует приобретение автомобиля и выбирает для себя модель, на первых этапах выбора интересуют параметры, известные без тестирования, в частности – габариты и другие геометрические характеристики, так как знание этих параметров позволяет оценить, насколько у Х Рей габаритные размеры соответствуют классу машины и мощности двигателя.

Рассмотрим подробно размеры «Лада Х Рей», разбив их на группы по характеризуемым параметрам.

Габариты

Lada XRay создана на платформе Renault Sandero Stepway, но с чуть большей базой.

  • Длина «Лада Х Рей»/Renault Sandero Stepway – 4,164м/4,080 м.
  • Колёсная база «Рей»/Stepway – 2,592 м/2,588 м.
  • Ширина «Лада Х Рей»/Renault Sandero Stepway:
    • по аркам задних колёс – 1,764 м/1,757 м;
    • по зеркалам в разложенном состоянии – 1,980 м/1,997 м.
  • Высота «XRay»/Stepway – 1,570м/1,590 м (с рейлингами).

Свес спереди у Lada XRay составляет 834 мм, задний свес равен 738 мм. Этим величинам соответствуют:

  • угол въезда – 21 град.;
  • угол съезда – 34 град.

Параметры и размеры «Х-Рей»для кроссовера не выдающиеся, но для заявленного класса этой модели «Лада» приемлемые и достаточно комфортные.

Следует обратить внимание на то, что ширина по аркам задних колёс у Stepway меньше, а по зеркалам в разложенном состоянии – больше. Это объясняется большими размерами зеркал Renault, в то время как зеркала Lada XRay несоразмерно малы по отношению к габаритам кузова, вследствие чего обзор ими обеспечен не лучшим образом.

Высота Lada XRay довольно значительна – автомобиль без рейлингов всего на 2 см ниже, чем Renault Sandero Stepway с рейлингами, но это компенсируется большей базой и шириной «Х Рей».

Ширина колеи «Лада Х Рей» составляет (диски R-16):

  • передних колёс:
    • по осям – 1482 мм;
    • габаритная – 1983 мм.
  • задних колёс:
    • по осям – 1513 мм;
    • габаритная – 1764 мм.

Величины этих параметров, несмотря на клиренс в 195 мм, обеспечивают хорошую устойчивость автомобиля к опрокидыванию в поворотах.

Размеры багажника

Штатный багажный отсек «Лада Х Рей», на первый взгляд, маловат для кроссовера – этому впечатлению способствуют размеры багажного проёма, который ещё и заужен в верхней половине:

  • высота проема –80,0 см;
  • ширина проема – 99,0 см.

Однако объём багажника в штатной конфигурации – 361 л, а внутренние размеры составляют:

  • длина – 79,0 см;
  • ширина – 90,0 см;
  • высота (до съёмной полки) – 40,0 см.

Сложенные спинки задних сидений позволяют довести объём багажного отсека до 1200 л, длину – до 1700 мм. Длина багажника по диагонали составит при этом 1850 мм. Сложенное дополнительно переднее пассажирское сиденье увеличит объём багажного отделения до 1300 л, а большую диагональ – до 2500 мм.

Высота погрузки у Lada XRay составляет 730 мм – величина немалая, но при этом крышка багажника в открытом положении находится на высоте 181 см, что позволяет безопасно ходить под ней во время погрузки.

Размеры салона

Салон «Лада Х Рей», как и багажник, для кроссовера маловат, но это обусловлено размерами кузова. Максимальная высота салона (от пола до потолка в средней его части) составляет 1220 мм, его ширина на уровне плеч одинакова по всей длине – 1330 мм.

Подушки передних сидений расположены на высоте 180 мм от пола, заднего дивана – 260 мм. Расстояние между спинками передних и задних сидений – от 600 до 815 мм.

На передних сиденьях достаточно места для комфортной позы, но при перемещении их назад пассажиры второго ряда вынуждены искать для ног приемлемое положение.

Все двери открываются достаточно широко, а задние дверные проёмы имеют достаточную ширину для погрузки на диван и перевозки габаритных грузов.

Уровень «подоконников» боковых окон «Лада Х Рей» завышен, что визуально добавляет кузову прочности, сбитости, но уменьшает боковой обзор.

Топовая комплектация XRay имеет в салоне мультимедийную систему с цветным дисплеем размером диагонали в 7 дюймов, который при такой диагонали информативно загружен недостаточно и содержит, не считая уровня топлива, только один из выводимых параметров.

Размеры колёс Lada XRay

Стандартными размерами шин являются 195/65 R15 или 205/55 R16, указанные в технических характеристиках хэтчбека, причём R — не радиус, а радиальная конструкция шины. Все комплектации «Лада Икс Рей», кроме самой бюджетной – Optima, оснащены 5-спицевыми литыми дисками, хорошо гармонирующими с экстерьером автомобиля.

По утверждениям продвинутых владельцев «Икс Рей», на машину можно безболезненно устанавливать также шины следующих размеров: 185/55 R17, 195/50 R17, 205/50 R17, 225/45 R17,а также 175/50 R18, 195/45 R18, 215/40 R18, 225/40 R18 и даже 175/45 R19, 185/40 R19, 195/40 R19.

Вся обеспечивающая ABS электроника имеет настройки на заводские размерности колес, поэтому в целях безопасности после установки колёс других размеров необходима перепрошивка блока управления ABS/ESP на новый размер шин, а эта операция выполняется только у официальных дилеров.

Разное

Объём бензобака XRay составляет 50 л – для кроссовера это не много, но, учитывая компактность автомобиля, приемлемо.

Масса «Лада Икс Рэй» соответствует компактности габаритов машины и составляет:

  • снаряженная (заполненный на 90% топливный бак плюс 75 кг – вес водителя) – 1140,0 кг;
  • полная – 1650,0 кг.

Распределение массы по осям у Lada XRay рациональное:

  • на переднюю ось – 51%;
  • на заднюю ось — 49%.

Перечисленные габариты «Лада Икс Рей», отдельные размеры и параметры помогут иметь предварительное впечатление об автомобиле ещё до личного ознакомления с ним и определиться, насколько он соответствует тем требованиям, которые конкретный автолюбитель предъявляет к своей машине.

Хрей лада размеры цена отзывы 2020

Накануне двухлетия продаж Лады X-Рей наш обзор посвящен размерам кроссовера так как каждый обращает свой взор на габариты машины.

Особенно наружные размеры Лады Х-Рей для парковки, дорожный просвет и габаритные размеры багажника для поездок за город и другие геометрические параметры для оценки соответствия класса авто с возможностью комфортной езды, а также соответствия массы и грузоподъемности с мощностью мотора.

Так как особенностью нашей национальной традиции является неистребимое намерение встречать всех по одежке, то и в этом обзоре мы прежде чем начнем рассмотрение геометрии авто уделим внимание внешнему облику в соответствующем разделе.

Особенности кузова

Лада Х Рей вполне соответствует всем европейским стандартам категории кроссоверов. Она проста в управлении в потоке и удобна для парковке в городе – для этого у авто вполне комфортные габариты кузова.

Что касается дизайна, то он вполне в духе современной тенденции предпочтения хэтчбеков над седанами, да и сам экстерьер не подкачал в инновационных решениях выпуклых крыльев, изогнутой формы крыши, которая заканчивается кормой. Передок выражает динамику движения в сочетании с узкой оптикой.

И все это результат сотрудничества разработчиков дизайна с такими концернами как Вольво и Мерседес.

Ну и нельзя не упомянуть о том, что детали кузова Лады Х-Рей проходят заводскую оцинковку, что важно для долговечности этого автомобиля, особенно в российских условиях эксплуатации, когда актуально решение проблемы коррозии из-за того, что дорожники в борьбе с гололедом используют всякую солевую муть.

Размер багажника

Для российского авто обывателя не столько важны технические и эстетические данные машины, сколько характеристика багажника. Частота поездок к теще за натуральными продуктами, совмещая их, якобы с исключительно гостевыми регулярными визитами, напрямую зависит от размеров багажника или от того, сколько мешков картошки в него помещается.

Итак, эти объемные размеры багажника таковы:

  • 375 литров при обычном (штатном) оснащении автомобиля;
  • 770 литров в сложенном положении спинки задних сидений;
  • 1207 литров, когда кроме спинки задних сидений сложено и место пассажира.

Габариты автомобиля, включая и колесную базу

Что касается его длины, то если сделать замер от крайних точек бамперов Lada xRay рулетка покажет 416,4 см. Точно такие же размеры и у Renault Sandero, что и неудивительно, так как они сделаны на одной платформе.

Относительно ширины, то ее меряют по крайним точкам правой и левой зеркал, обеспечивающих задний обзор, и она равна 198,3 см. Причем если сложить зеркала, то тогда крайними точками станут колесные арки, и ширина кузова станет 176,4 см.

Кстати, насчет зеркал. Многие владельцы Лады Х-Рей, особенно те, которые до этого ездили на Рено Сандеро сетуют, что зеркала у нашего внедорожника, скажем так, не обеспечивают достаточный обзор заднего вида из-за их малых размеров.

Высота кузова с ригелями, а также без их установки на крышу Лады Х-Рей равна 163,0 и 157,0 см. соответственно.

Расстояние между осями колес или, иначе говоря, колесная база на внедорожнике – 259,2 см.

Дорожный   просвет

Что касается этого параметра, то он зависит от таких параметров как размер колес, так и размер дисков. На рис.1. показана средняя величина просвета между кузовом и дорожным покрытием, равная 19,5 см.

Между прочим, довольно приличный показатель для преодоления сугробов и водно-грязевых препятствий.

Размер колеи

Или если замерить расстояние между средними линиями шин, то рулетка должна показать 148,2 см.

Объем салона

Разработчики утверждают, а мы воочию можем убедиться, что Лада Х-Рей обладает просторным объемом салона среди автомобилей аналогичного класса.

И действительно, в салоне создается такое ощущение, что он выглядит больше, чем это, кажется снаружи. К сожалению, объемные параметры салона обычно не указывают в техническом описании авто, но доступны для ознакомления линейные размеры оснащения салона Лады Х Рей.

Причем, высота салона, измеряемая от пола до потолка в максимуме равна 122,0 см. Его ширина, которая измеряется на уровне плеч водителя и пассажиров, то она одинакова на всю длину салона – 133,0 см.

А вот расстояние между спинками, которое меряется в разных положениях передних и в стационарном состоянии задних сидений, может быть в диапазоне от 60,0 и вплоть до 81,5 см., что крайне мало.

Из-за чего есть многочисленные недовольства в отзывах, что впереди сидеть вольготно, когда сзади – не совсем, потому, как некуда деть коленки.

Размер шин и дисков

Лада Х Рей комплектуется различными типами дисков, начиная от бюджетных штампованных с размерами как в 15, так и в 16 дюймов, так и в элитных вариантах легко сплавными или пяти спицевыми литыми 17 дюймовыми.

Размер шин

Стандартными в соответствии с комплектацией дисками являются такие размеры резины как 195/65R15, так и такие, как 205/55R16. Однако наши братья неугомонные самоделкины умудряются и, причем как они утверждают безболезненно ставить шины с такими параметрами, где фигурирует в маркировке не, только R17, но и R18, а наиболее отчаянные и на этом не останавливаются и присобачивают даже на Ладу Х-Рей диски с резиной, где красуется маркировка R19.

Выводы специалистов

В таком же примерно, но сокращенном порядке, как и был построен наш обзор Лады Х-Рей по размерным характеристикам, разберем как ее достоинства, так и косяки, обращаясь к мнению экспертов:

1. Кузов. Хороши обводы, как и различные тиснения, лишь в эстетическом плане, а наш брат сначала ими любуется, а потом – плюется, причем, вместе с рихтовщиками, когда приходиться устранять их повреждения. Кузовные пороги не имеют защиты – результат коррозия от воздействия гравия и соли, которыми зачастую посыпаны наши дороги и, причем в изобилии. Капот имеет короткую штангу фиксации верхнего положения, что хорошо для моделей в коротких юбках для искушения нашего брата, а вот нашему брату приходится в известной позе рака залазить под капот;

2. Багажник. Его объем вроде бы приличный, он может принять пару-тройку мешков картошки, но в верхней части из-за фонарей имеет зауженный проем. Да и заднее стекло из-за этого имеет ограничения обзора, если смотреть в салонное зеркало;

3. Салон. Он хорош лишь для тех, кто сидит впереди. А вот задним пассажирам, особенно крайним хоть через окна вылезай, или распластывайся по дверям, чтобы убрать куда-либо в сторону коленки. Да и один подстаканник на троих – это не тот случай, что как у Высоцкого: на троих придумано, мол, не зря.

Список, как достоинств, так и недостатков наверняка может быть дополнен, но главное, чтобы недостатки оперативно устранялись производителем, иначе их критическая масса может повлиять и на спрос со стороны нашего брата.

Габаритные размеры Лада X-RAY (размеры салона, багажинка и клиренс)

Автомобиль Лада Х-RAY, изготовлен на одной платформе с Рено Сандеро, но имеет несколько другие габариты. Поскольку данная модель, выпущенная АвтоВАЗом – первый отечественный кроссовер, то она должна иметь довольно просторный и вместительный салон, высокую грузоподъемность и проходимость, большой клиренс, и относительно небольшие размеры кузова. Соответствует ли Lada Xray данным критериям, можно узнать, прочитав статью.

Кузов

По своим размерам, Лада Х-Рей полностью подходит под категорию европейских и других зарубежных кроссоверов. Для поездок в городе, среди большого потока автомобилей, у нее достаточно небольшие размеры кузова.

В длину, от передней крайней точки (переднего бампера), до задней крайней точки (заднего бампера), автомобиль Lada Xray достигает 4315 мм. Если сравнивать его с Renault Sandero, с которым, как было сказано ранее, Лада Х-Рей делит одну базу, то можно убедится в том, что длина у обоих кроссоверов абсолютно одинаковая.

Ширина отечественного внедорожника, от крайней левой точки (от левого бокового зеркала заднего вида), до правой крайней точки (до правого бокового зеркала заднего вида), составляет 1980 мм. При сложенных зеркалах, ширина будет меряться по колесным аркам, и уменьшиться до 1820 мм. Вернемся к Рено Сандеро. Его ширина имеет такие самые размеры: с сложенными зеркалами – 1822 мм, а с выдвинутыми – 2000 мм.

Высота автомобиля Lada Xray измеряется также в двух положениях: с дополнительными рейлингами, и без них. В первом положении, высота машины будет составлять 1685 см, что примерно на 200 мм выше, чем высота среднестатистического седана. Без рейлингов, высота кузова уменьшиться до 1625 мм. Учитывая то, что дорожный просвет у Сандеро и Лада Х-Рей практически одинаковый, то высота у них так же полностью идентична.

Подвеска

Размеры подвески модели Lada Xray, несколько меньше, чем у его аналога – Рено Сандреро. Конечно, такая разница особых различий в проходимости не играет, также, как и в управлении, но визуально является заметным отличием, особенно если смотреть по колесным аркам.

Ширина между передними колесами отечественного кроссовера немного меньше, чем ширина между задними колесами. Такое расположение колес сделано специально для того, чтоб улучшить проходимость внедорожника на грязи и заболоченной местности. Размер передней колеи автомобиля, равен 1482 мм, а задней – 1513 мм. Если сравнить данные размеры с кроссовером Рено, то его передняя колея имеет размер 1560 мм, а задняя – 1567 мм.

Расстояние между передней и задней осью (колесная база), у модели Лада Х-Рей, также несколько меньше, чем у аналога, и равняется 2592 мм. На сандеро, колесная база имеет размеры несколько больше – 2673 мм.

Что касается клиренса, то тут Lada Xray также незначительно уступает Рено. Дорожный просвет у отечественного внедорожника, равен 195 мм. Такой клиренс вполне достаточный для хорошей проходимости по бездорожью, а также очень сильно влияет на внешний вид автомобиля, максимально приближая его к городскому типу. А вот у Сандеро, клиренс немного больше – 210 мм, и в городе данная машина смотрится немного неуместно.

Размер салона и грузоподъемность

Учитывая довольно небольшие габариты кузова Лада Х-Рей, размеры салона также не особо просторные. Для водителя и переднего пассажира, места вполне достаточно, а вот на счет заднего сидения – вопрос спорный.

Что касается высоты сидений, то она полностью одинаковая, как для заднего, так и для двух передних, и равна – 935 мм. Само сидение, имеет несколько разную величину. Заднее сидение достигает длины в 460 мм, а переднее немного больше – 480 мм.

Для ног водителя и переднего пассажира, в автомобиле Lada Xray, просто предостаточно. Если сменить положение сидения, опустив спинку, то на нем можно будет расположиться лежа, практически во всю длину. А вот для пассажиров сзади, ноги постоянно будут упираться в спинку передних сидений. Это является одним из немногочисленных минусов модели Лада Х-Рей.

На счет грузоподъемности, не стоит ждать чего-то из ряда вон. Даже несмотря на то, что Lada Xray – полноценный кроссовер, его грузоподъемность составляет всего 445 кг, включая пассажиров. Но, ширина заднего сидения, запросто позволяет поместить на себе 3-ех человек, средней комплекции. Также, по количеству подголовников, можно определить, что салон рассчитан на 5 человек. Таким образом, если отнять вес 5-ти пассажиров, то на груз остается примерно 100 – 150 кг, что вполне достаточно.


Конечно, в Лада Х-Рей, также имеется возможность увеличить вместительность, путем складывания задних сидений. Тогда вес 3-ех пассажиров, автоматически переходит в вес дополнительного груза. Тоже самое касается и объема. При разложенных задних сидениях, объем багажного отделения составляет 376 литров, а при сложенных – 1382 литра. Такая разница довольно существенная, и все-таки прибавляет бал автомобилю Lada Xray.

При увеличении объема багажного отделения, и соответственно веса дополнительного груза, стоит учитывать, что дорожный просвет, также будет уменьшаться. Поэтому, по бездорожью ездить не рекомендуется, при нагруженном автомобиле.

Также, хочется обратить особое внимание на размеры проема багажного отделения. Разработчики Lada Xray, максимально постарались улучшить его вместительные качества, и сделали довольно просторный проем. Ширина проема багажника, составляет 975 мм, а высота – 740 мм. Немного подкачала высота порога – 770 мм. Это слишком много для погрузочной платформы, и тяжелый груз поместить в багажное отделение будет очень непросто.

Багажник новой Лада

Вывод

В целом, новый отечественный кроссовер Лада Х-Рей довольно хороший, и с легкостью сможет конкурировать с зарубежными аналогами. Ее габариты довольно невелики, что позволяет запросто маневрировать даже в плотном городском потоке. Салон также достаточно вместительный.

По подвеске, данная модель очень хорошо подойдет, как для городских условий, так и для условий полного бездорожья. Клиренс достаточно большой, для преодоления препятствий любого рода, и вовсе не портит внешний вид машины. Большой плюс данного внедорожника – доступная цена. Благодаря всем этим плюсам, модель Х-Рей станет довольно популярной, как на территории России, так и в зарубежных странах.

 Загрузка …

Лада XRay технические характеристики — двигатель, коробка передач, габариты, клиренс, кузов, подвеска (фото, видео)

Возможно, качество продукции концерна «АвтоВАЗ» с последними внесенными изменениями в новые модели, вскоре перестанет быть поводом для анекдотов – и это не может не радовать. Технические характеристики  новой Лады XRay уже успели поразить многих.

Описание возможностей разработки

Как видно на предложенных фото, которые были сделаны еще во время предварительного показа концептов Икс Рей и Весты еще в 2014 году, данный автомобиль имеет внушительные габаритные размеры. Длина кузова составляет 4165 мм, его ширина – 1764 мм и высота – 1570 мм. Данные габариты, как и колесная база длиной 2592 мм, останутся, по заявлениям конструкторов, едиными для всех автомобилей Лада Х Рей. Характеристики, относящиеся к другим показателям и параметрам, могут существенно отличаться.

Касательно модификаций и изменений данной модели, конструкторы и генеральный директор автомобильного концерна «АвтоВАЗ» заявили о том, что Икс Рей будет выпускаться в трех разнообразных версиях привода. Кузов, по заверению руководства концерна, останется неизменным (относительно того вида, в котором сейчас серийно производится Лада XRay) – однако не исключается возможность легкого рестайлинга в случае таковой необходимости.

В настоящее время готов к выходу в продажу только переднеприводный вариант этого нового автомобиля. Выход в свет версии Лады Икс Рей Cross в полном приводе в виде полноправного внедорожника должен состояться во второй половине 2016 года – и примерно в это же время будет выпущен автомобиль с переключаемым полным приводом 4х2, сочетающий все преимущества двух описанных модификаций.

Хэтчбек Лада Икс Рей

Конструкторы «АвтоВАЗ» еще до начала разработки серийной модели заявили, что данный автомобиль не будет претендовать на звание городского кроссовера, даже несмотря на огромное внешнее сходство. Во всех источниках, благодаря этому, данный автомобиль упоминается исключительно как хэтчбек (либо SUV).

Многие отечественные автолюбители с нетерпением ждали новый автомобиль Лада XRay хэтчбек – характеристики и практически полное устранение всех ошибок предыдущих провальных моделей сыграли свою роль. Машина отлично подойдет как для городской езды, так и для использования для путешествия по разбитым гравийным дорогам, благодаря высокому (195 мм в снаряженном состоянии) клиренсу и мощной подвеске. Подвеска, по мнению экспертов, получилась очень динамичной и приятной: передняя выполнена независимой, по системе Мак-Ферсон, а задняя представляет собой цельную упругую балку с мощными рессорами.

Несмотря на то, что данная модель не является внедорожником, конструкторы сделали все возможное, чтобы сделать этот автомобиль более устойчивым на трассе. Задняя ось длиннее передней на 35 мм, благодаря чему автомобилю будет значительно динамичнее и маневреннее, чем ожидается от машины подобных габаритов.

Силовые агрегаты

Технические характеристики новой Лады Х-Рей во многом зависят и от примененных для ее сборки силовых агрегатов. Стоит рассмотреть предложенные конструкторами возможности и оценить все то, что может быть размещено под капотом данной модели.

Наиболее простой и дешевый силовой агрегат, применяемый для оснащения данного автомобиля, состоит из стандартного «вазовского» 1.6-литрового двигателя мощностью 106 лошадиных сил и дополняется французской пятиступенчатой трансмиссией ручного переключения от Renault. И двигатель, и МКПП уже были использованы в целом ряде предыдущих разработок (мотор с оглушительным успехом был применен в разработке седана Лада Веста, коробка передач – также при сборке этой модели). Механическая трансмиссия отечественного производства не используется ввиду своей шумности, которую так и не удалось «вылечить» после выхода в продажу Лады Калины.

Более продвинутая версия силового агрегата сочетает ту же трансмиссию с 1.6-литровым двигателем от Nissan, мощностью 110 лошадиных сил. Разница достаточно невелика, однако этот мотор объективно лучше отечественного, производительнее и долговечнее.

Наиболее мощный силовой агрегат, предложенный для хэтчбека Lada XRay, сочетает 1.8 литровый шестнадцатиклапанник мощностью 122 л.с. с пятиступенчатой роботизированной АКПП (АМТ). Характеристики автомата Лада Икс Рей будут существенно выше, чем у предыдущих комплектаций, ввиду значительно большей мощности двигателя. Тем не менее, существенно вырастет и расход топлива, что делает лучший силовой агрегат из предложенных «палкой о двух концах».

Скорость, разгон и расход топлива

Каждый из предложенных силовых агрегатов имеет свои возможности. Их стоит рассмотреть более детально.

  • Силовой агрегат на базе 106-сильного двигателя имеет неплохие показатели расхода топлива (7.6 литров на 100 километров), однако достаточно слабый разгон (11.9 секунд от 0 до 100 километров в час). Максимальная скорость модели, оснащенной этим двигателем, составляет всего 170 км/ч – ниже, чем у базовой комплектации Весты ввиду большей массы.
  • Силовой агрегат на базе 110-сильного мотора разгоняется значительно резвее – от нуля до сотни он может разогнаться всего за 10.3 секунды. Максимальная скорость не сильно отличается от предыдущего агрегата – всего 171 км/ч, однако расход топлива существенно ниже и составляет всего 6.9 литра на 100 километров.
  • Наиболее мощный и производительный агрегат на базе 122-сильного двигателя способен развить скорость до 183 км/ч и значительно более динамичен. Тем не менее, автоматическое переключение передач существенно снижает способность автомобиля к быстрому разгону с места. При большей мощности данный силовой агрегат позволяет с места разогнаться до 100 км/ч за 10.9 секунд. Тем не менее, автомат позволяет снизить расход топлива: нужно всего 7.1 литра на 100 км пути.

Данная выкладка позволяет с уверенностью говорить о том, что оснащаемая исключительно первым типом силового агрегата комплектация Икс Рей «Оптима» вряд ли будет пользоваться высоким спросом. Покупателю будет выгоднее приобрести более продвинутую версию, которая в эксплуатации будет и удобнее, и дешевле.

Комплектации

В настоящее время автомобиль предложен в четырех типах комплектации, характеристики и цены на которые уже известны и общедоступны на официальном сайте концерна «АвтоВАЗ». Существует две основных комплектации (Оптима и Топ) и два пакета дополнительных опций, доступных для оснащения автомобиля определенной комплектации (Комфорт – для базовой, Престиж – для высшей).

Примечательно, что базовая версия Оптима (без пакета опций Комфорт) может быть снабжена исключительно первым описанным силовым агрегатом. Все остальные версии комплектаций автомобиля могут быть оснащены как вторым, так и третьим силовым агрегатом – в зависимости от предпочтений покупателя.

Интерьер и «начинка» автомобилей серьезно зависят от того, какую комплектацию выберет пользователь. К примеру, магнитола и бортовой компьютер есть уже в базовой версии Лады Х-Рей, а кондиционер появляется только при выборе версии не ниже Комфорт. Максимальная комплектация предлагает покупателю комфортный салон с кожаными элементами, сенсорную мультимедийную панель (известную еще по Весте), сиденья с подогревом и массу других приятных и полезных функций.

Внедорожник Лада Икс Рей Кросс

Характеристики кроссовера Лада XRay пока еще не известны. Тем не менее, известно, что его планируют выпускать в двух модификациях: постоянный и переключаемый полный привод. Какие изменения должны будут коснуться этих автомобилей для того, чтобы они могли считаться полноценными внедорожниками – автомобилями повышенной проходимости?

В первую очередь, наверняка будет существенно переработана схема силовых агрегатов. Полный привод передает усилия двигателя на обе колесные оси, снижая в итоге максимальную скорость и динамичность машины в обмен на увеличенную тягу. Для того, чтобы автомобиль не стал излишне тихоходным, характеристики моторов должны будут быть достаточными для обеспечения нужд полного привода. Предполагается, что в качестве базового мотора будет взят используемый и сейчас 1.8-литровый двигатель от «АвтоВАЗ» с номинальной мощностью 122 лошадиных силы, а для оснащения более продвинутых версий – турбированный двигатель той же марки, усиленный до 140 «лошадей».

Скорее всего, изменения коснутся и подвески. Характеристики Lada XRay Cross должны быть направлены на то, чтобы автомобиль комфортно эксплуатировался даже в условиях бездорожья. Все-таки хэтчбек с передним приводом, хоть и является оптимальным сочетанием возможностей, разработан в первую очередь для городского использования. Подвеску, по мнению экспертов, придется усиливать и видоизменять для полного соблюдения портрета будущего внедорожника.

Существует также неподтвержденная информация, ставшая доступной общественности, что концерн собирается прекратить разработку полноприводных версий Икс Рей. Многие автолюбители России уже выразили недовольство этим фактом.

Тем не менее, отзывы о Lada XRay содержат слишком много упоминаний об ожидании полноприводных версий, чтобы руководство концерна «АвтоВАЗ» могло закрыть на них глаза и остановить разработку. Как показывают некоторые статистические данные, практически половина всех автолюбителей с нетерпением ожидают кросс-версию Икс Рей.

Таблица ТТХ: Технические характеристики Lada XRay

Автомобиль Лада XRAY: Технические характеристики
Объем двигателя1.6 (106 л.с.)1.6 (114 л.с.)1.8 (123 л.с.)
Тип кузова5-дверный хэтчбек
Число мест5
Длина, мм4164
Ширина, мм1764
Высота, мм1570
Колесная база, мм2592
Дорожный просвет (клиренс), мм190
Снаряженная масса, кг114011561135
Тип двигателябензиновый, с распределенным впрыском
Расположениеспереди, поперечно
Число и расположение цилиндров4, в ряд
Рабочий объем, куб. см.159615981774
Число клапанов161616
Максимальная мощность, л. с. (кВт) / об/мин106 (78)114 (84)123 (90)
Максимальный крутящий момент, Нм / об/мин148155178
Коробка передачмеханическая, 5-ступенчатая
Приводпередний
Шины195/65 R16, 205/55 R16
Максимальная скорость, км/ч170171183
Время разгона 0-100 км/ч, с11,910,310,9
Расход топлива в смешанном цикле, л/100 км7,56,97,1
Емкость топливного бака, л50
Тип топливабензин, АИ-95

 

LADA XRAY – Технические характеристики – Первый Лада Центр, Краснодар.

  • Кузов
  • Колесная формула / ведущие…

  • Расположение двигателя

  • Тип кузова / количество…

  • Количество мест

  • Длина / ширина / высота, мм

  • База, мм

  • Колея передних / задних колес,…

  • Дорожный просвет, мм

  • Объем багажного отделения в пассажирском / грузовом…

  • Двигатель
  • Код двигателя

  • Тип двигателя

  • Система питания

  • Количество, расположение…

  • Рабочий объем, куб. см

  • Максимальная мощность, кВт (л.с.) / об….

  • Максимальный крутящий момент, Нм / об….

  • Рекомендуемое топливо

  • Динамические характеристики
  • Максимальная скорость, км/ч

  • Время разгона 0-100 км/ч, с

  • Расход топлива
  • Городской цикл, л/100 км

  • Загородный цикл, л/100 км

  • Смешанный цикл, л/100 км

  • Масса
  • Снаряженная масса, кг

  • Технически допустимая максимальная масса,…

  • Максимальная масса прицепа без тормозной системы /…

  • Объем топливного бака, л

  • Трансмиссия
  • Тип трансмиссии

  • Передаточное число главной…

  • Подвеска
  • Передняя

  • Задняя

  • Рулевое управление
  • Рулевой механизм

  • Шины
  • Размерность

  • Размер багажника лада х рей

    Инфопост! По наглядным размерам багажника, возможно кому то будет интересно.

    Нашел подобую картинки для многих машин, а вот для XRAY не нашел. В целом размеры багажника не дотягивают для кроссоверов на базе универсалов, но +- могут по соперничать с хачбэками из В и С класса.

    Замерять всякие извращенные величины, типа диагонали от ног пассажира до заднего стекла я не стал, хотя трех метровый брус по диагонали в авто входит. Что касается проема багажника, то груз войдет размерами 80 (по высоте) на 90 сантиметров по ширине, хотя сам проем несколько шире, что то в районе 99 сантиметров в самом широком месте. Если интересует высота от пола до крыши, то там в районе 80-90 сантиметров (с фальшполом и без). И если сложить спинки сидений, войдет габарит длиной около 1,5 метра, если сдвинуть сидения ближе к рулю, то чуть больше.

    Грубо говоря, в машину можно запихать ящикгабарит размером 1,5х0,8х0,9 метров.

    И для наглядности, прилепил рисунок, с основными размерами в мм, и точностью +- 10 мм. Мои замеры примерно сходятся с данными производителя и «обзорщиков».

    Если нашли ошибки — пишите. А то погода ужасная, мерил все рулеткой на улице без особой любви к делу, вот и фото не мои.

    При выборе машины оценивайте не только характеристики двигателя, но и размеры кузова, салона и багажника. Сравнив эти значения с конкурентами можно сразу понять, насколько крупный и вместительный этот автомобиль. В статье представлены все основные размеры XRAY.

    Габаритные размеры кузова

    Справочные размеры хэтчбека/кроссовера указаны на официальном сайте и в руководстве по эксплуатации автомобиля:

    • длина – 4165 мм;
    • ширина 1764 мм;
    • высота – 1570 мм.

    Размеры салона и багажника

    Более детальные размеры кузова, салона и багажника предоставил журнал ЗаРулем .

    Размеры салона XRAY:

    • Высота салона – 1220 мм
    • Высота от подушки переднего сиденья до потолка – 1040 мм
    • Высота от подушки заднего дивана до потолка – 960 мм
    • Расстояние от спинки переднего сиденья до руля – 945..1180 мм
    • Расстояние от спинки заднего дивана до спинки переднего сиденья – 600..815 мм
    • Ширина салона по переднему/заднему ряду сидений – 1330 мм

    Размеры багажника XRAY:

    • Длинна багажника (спинка заднего дивана не сложена/сложена) – 790/1700 мм
    • Высота до задних подголовников (до шторки багажника) – 400/510 мм
    • Ширина багажника – 900 мм
    • Высота проема багажника – 800 мм
    • Ширина проема багажника – 990 мм
    • Высота погрузки – 730 мм
    • Высота поднятия крышки багажника – 1815 мм

    Объем багажного отделения (минимальный / сложенные спинки задних сидений / сложенные спинки передних сидений) – 361л / 1207л / 1514л.

    Если делать сравнение габаритных размеров Lada XRAY с Sandero (подробное сравнение):

    • Длина XRAY больше на 84 мм;
    • База XRAY больше на 3 мм;
    • Высота XRAY ниже на 48 мм;
    • Ширина XRAY больше на 7 мм;
    • Задняя колея XRAY шире на 34 мм.

    Габаритные размеры кузова мы сравнивали в рамках другого обзора. См. также совместимость и размеры шин и дисков XRAY.

    Ключевые слова: багажник lada xray

    Не прошло много времени, как я рассказал историю покупки автомобиля.
    И как оказалось, столкнулся с некоторым недоверием относительно размера авто. Что якобы xray значительно меньше лачетти, или даже своих одноклассников, и в нем неудобно сидеть так как давят двери, потолок, пол, стены и багажник вмещает буханку хлеба.
    Покопавшись в интернете, я понял, мнение возникло после осмотра автомобиля в салоне, и передается из уст в уста не владельцами авто, а группой сочувствующих. Сразу оговорюсь, я согласен, длинноногим пассажирам сидеть за длинноногим водителем тесно, это без вопросов. Так же хочется сказать, что сравниваем именно размеры. А не материалы отделки дизайн и удобство сидений управляемость и все остальное, про что укажут в комментариях, увидев сравнение фокуса 3 с иксреем. Я не пытаюсь представить машину крупнее, чем она есть. Я лишь хочу показать ее истинные размеры. Xray не уступает прямым конкурентам, и совсем немного отстает от машин классом повыше.
    Так вот, покапавшись некоторое время по авторитетным авто журналам, которые измеряют автомобили, удалось найти сравнение xray с моей прошлой машинкой, так же такими соперниками и одноклассниками, как третий фокус и солярис соответственно .

    Если присмотреться к данным на картинке, то действительно, у xray свободного места для ног задних пассажиров меньше чем у других. На целых три сантиметра меньше чем у фокуса, и на целый сантиметр меньше чем у соляриса. А вот от лачетти уже серьезный отрыв, в 10 сантиметров, правда надо учитывать, что сидения сами по себе в автомобиле короткие, и это дает лишнее место. Именно на эти 10 сантиметров, багажник лачетти и короче в районе пола. Остальные габаритные размеры у машин примерно одинаковые. Длина подушек, высота в салоне, все это в xray не уступает соперникам. Хотя лачетти, хоть и старый автомобиль, но все же классом выше, как и более новый фокус. Конечно фокус обладает большей колесной базой, которая в основном и прибавляет места сзади, так же фокус и лачетти, как представители более высокого класса имеют более длинную корму и нос. В связи с чем прибавляют в габаритах по длине автомобиля, жаль не прибавляют места.

    А теперь поговорим об иллюзиях восприятия. Конечно я не психолог, на как то в институте приходилось изучать науку психологию целый год, это были темные времена… Ну да ладно сейчас не об этом. Так вот еще изучал и психиатрию, там еще более темные времена. Ну и в детстве у меня была советская книжка, из 60х, где целая глава была посвящена иллюзиям восприятия. Каждый из наз помнит что это такое. Это когда предметы или их изображения кажутся больше или меньше, чем они есть. Так же визуально могут менять форму.

    Кто же это использует.

    Как не странно многие. Толстые одевают темную, висячую одежду с рисунком, который скрывает живот. Девушки красят лицо скрывая недостатки и выделяя достоинства (не всегда удачно). Военные красят танки и самолеты, чтобы сложнее было определить форму и размер техники, это так называемая «деформирующая окраска». Людей одевают в цифровой камуфляж, рисунок которого создан компьютером, и призван обмануть глаз, и скрыть передвижения личного состава по местности. Маркетологи в автомобилях — создают иллюзии объёма, там, где его нет, и никогда не было. Как обманывая вас оптическими иллюзиями, так и нагло меняя конструкцию. Делают длинный моторный отсек и задний бампер – машина становится визуально большой, посмотрите на нексию, тесная, при этом длинная — охотничья сосиска. Именно поэтому потолок машин делают светлым, так он кажется выше. Укорачивают подушки сидений заднего ряда, так расстояние до передних сидений кажется больше (такое очень чувствуется в РАВ 4 2008 модельного года место вроде есть, но ноги не лезут ни спереди ни сзади), делают спинку задних сидений вертикальной, увеличивая багажник. Или как в приоре, калине и гранте, укорачивают салазки, и водитель создает место сзади — теряя его спереди.

    Структурная информация из экспериментов с FRET одиночной молекулой с использованием системы быстрого нано-позиционирования

    J Vis Exp. 2017; (120): 54782.

    Тило Дёрфлер

    1 Институт биофизики, Ульмский университет

    Тобиас Эйлерт

    1 Институт биофизики Ульмского университета

    Карлхайнц

    Институт биофизики Университет

    Джулия Надь

    1 Институт биофизики, Ульмский университет

    Йенс Михаэлис

    1 Институт биофизики, Ульмский университет

    1 Институт биофизики, Ульмский университет

    , равный номер.

    Авторские права © 2017, Журнал визуализированных экспериментов Эта статья цитируется в других статьях PMC.

    Abstract

    Одномолекулярный резонансный перенос энергии Ферстера (smFRET) может использоваться для получения структурной информации о биомолекулярных комплексах в реальном времени. Таким образом, несколько измерений smFRET используются для локализации неизвестного положения красителя внутри белкового комплекса посредством трилатерации. Для получения количественной информации система нанопозиционирования (NPS) использует вероятностный анализ данных для объединения структурной информации из рентгеновской кристаллографии с данными флуоресценции одиночных молекул для расчета не только наиболее вероятного положения, но и полного трехмерного распределения вероятностей. , названный апостериорным, что указывает на экспериментальную неопределенность.Эта концепция была обобщена для анализа сетей smFRET, содержащих множество молекул красителей. Последняя версия NPS, Fast-NPS, включает новый алгоритм, использующий оценку байесовских параметров на основе выборки методом Монте-Карло цепи Маркова и параллельного темперирования, что позволяет анализировать большие сети smFRET за сравнительно короткое время. Более того, Fast-NPS позволяет рассчитать апостериор, выбирая одну из пяти различных моделей для каждого красителя, которые учитывают различное пространственное и ориентационное поведение, демонстрируемое молекулами красителя из-за их локального окружения.

    Здесь мы представляем подробный протокол для получения данных smFRET и применения Fast-NPS. Мы предоставляем подробные инструкции для получения трех входных параметров Fast-NPS: значений smFRET, а также квантового выхода и анизотропии молекул красителя. Недавно NPS был использован для выяснения архитектуры открытого промоторного комплекса архей. Эти данные используются для демонстрации влияния пяти различных моделей красителей на апостериорное распределение.

    Ключевые слова: Биохимия, Выпуск 120, Система нанопозиционирования, Fast-NPS, флуоресценция одиночных молекул, резонансный перенос энергии Фёрстера одиночных молекул, структурная биология

    Введение

    Определение структуры биомолекулы является ключевым предварительным условием для понимания его функции.Два хорошо зарекомендовавших себя метода определения структуры — криоэлектронная микроскопия и рентгеновская кристаллография1,2. Сегодня оба метода предоставляют структурную информацию с высоким разрешением и разрешением до уровня Ангстрема. Эти два метода широко используются для выяснения структуры больших биомолекул, таких как белковые комплексы. Хотя существующие методы постоянно совершенствовались на протяжении последних десятилетий, сложность биологических структур по-прежнему представляет собой серьезную проблему для структурной биологии, особенно при исследовании больших, динамических и переходных комплексов3.

    Чтобы изучить динамику макромолекулярных комплексов и, в частности, взаимосвязь между структурой и функцией, методологии исследования отдельных молекул предоставили полезную информацию4. Было разработано несколько новых стратегий, обеспечивающих ортогональный подход к получению структурной и динамической информации. Примерами являются высокоскоростной AFM5, механические манипуляции6, флуоресцентная микроскопия локализации7, а также одномолекулярный резонансный перенос энергии Ферстера (smFRET) 8,9. С самого начала FRET был назван молекулярной линейкой из-за зависимости расстояния от масштаба биомакромолекул10.

    Одним из особенно интересных приложений smFRET является использование информации о расстоянии, полученной из измерений smFRET, для вывода структурной информации11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23. Благодаря высокому временному разрешению smFRET положение мобильных частей белковой структуры может быть локализовано. Однако, чтобы извлечь количественную информацию из данных smFRET, во время измерения необходимо определить важные поправочные параметры о молекулах красителя24. С этими поправочными коэффициентами эффективность FRET E FRET может быть рассчитана по формуле

    ,

    , где I A и I D — интенсивности флуоресценции молекулы донора и акцептора. соответственно (см. Рисунок 2 ).Β-фактор учитывает перекрестные помехи, утечку излучения донора в канал акцептора и рассчитывается по формуле

    , где I ‘ A и I’ D — интенсивности флуоресценции донора и молекула-акцептор после фотообесцвечивания молекулы-акцептора.

    γ-фактор корректирует разницу в относительной эффективности обнаружения в двух каналах, а также разницу в квантовом выходе флуоресценции донорного и акцепторного красителей.Он рассчитывается по каждому индивидуальному временному графику с помощью

    . Обратите внимание, что в этом описании не учитывается прямое возбуждение акцепторной молекулы, которое иногда становится важным и также требует корректировки. Для определения этих поправочных коэффициентов полезно возбуждать как донор, так и акцептор по чередующейся схеме25, чтобы различать фотофизические изменения и структурную динамику.

    Для получения не только количественной эффективности smFRET, но и количественной структурной информации, в 2008 году была введена система нанопозиционирования (NPS).Название было выбрано на основе его сходства со спутниковой системой глобального позиционирования (GPS). NPS — это гибридный метод, сочетающий данные smFRET и рентгеновской кристаллографии для локализации неизвестных положений красителя в биомакромолекулярных комплексах. Кристаллическая структура служит опорным кадром, а результаты smFRET используются для получения информации о расстоянии между неизвестным положением флуорофора (антенна , ) и положением, известным из кристаллической структуры (спутник , ).В последовательных экспериментах измеряются расстояния между антенной и несколькими спутниками, а положение антенны определяется с помощью статистически строгой схемы анализа, основанной на оценке байесовских параметров. В результате вычисляется не только наиболее вероятное положение антенны, но и ее полное трехмерное распределение неопределенности, так называемое апостериорное, визуализируемое с помощью достоверных объемов. Кроме того, NPS был расширен, чтобы обеспечить возможность анализа полных сетей smFRET27.

    NPS использовался для решения ряда важных вопросов в эукариотической транскрипции, а именно пути восходящей ДНК, нематричной ДНК и зарождающейся мРНК в комплексе элонгации РНК-полимеразы II12,28, что также демонстрирует эффект факторы инициации транскрипции26 и динамическая архитектура открытого промоторного комплекса29.Более того, NPS использовали для выяснения структуры открытого комплекса РНК-полимеразы архей 30 и, в частности, положения фактора инициации транскрипции TFE, который конкурентно связывается с тем же сайтом, что и фактор элонгации транскрипции Spt4 / 531.

    С тех пор было опубликовано несколько структурных подходов на основе smFRET15,18,21,23. При сравнении различных структурных методов на основе smFRET становится ясно, что кажущаяся точность метода сильно зависит от конкретного выбора моделей красителя.Следует отметить, что молекулы красителя могут демонстрировать различное пространственное и ориентационное поведение в зависимости от их локального окружения.

    С этой целью был введен Fast-NPS32. Fast-NPS использует усовершенствованный алгоритм выборки, значительно сокращающий время вычислений. Кроме того, Fast-NPS позволяет выполнять структурный анализ, и для каждой молекулы красителя пользователь может выбрать из набора из пяти различных моделей красителя, которые будут описаны ниже. Самая консервативная модель, получившая название classic , предполагает, что краситель занимает только одну, но неизвестную позицию.В этом положении флуорофор может свободно вращаться внутри конуса, размер которого определяется его соответствующей (зависящей от времени) анизотропией флуоресценции. Ориентация конуса неизвестна, что приводит к большим погрешностям при преобразовании измеренной эффективности smFRET в расстояния. В этом отношении модель консервативна, так как она дает наименьшую точность по сравнению с другими моделями красителей. Только для очень коротких расстояний допущения, сделанные классической моделью, должны приводить к заметно неправильному определению местоположения.Для типичных значений smFRET правильная позиция всегда заключена в сравнительно большой достоверный объем.

    Однако, поскольку желательна более высокая точность, важно разработать и испытать альтернативные модели красителей, которые могут помочь повысить точность. Если краситель вращается намного быстрее, чем время его собственной флуоресценции, можно применить так называемую модель iso . Здесь коэффициент ориентации κ 2 (необходимый для расчета характеристического изотропного радиуса Ферстера

    ) установлен равным 2/3.В результате рассчитанные достоверные объемы почти на два порядка меньше, чем в классической модели32. В случае, если флуорофор находится в среде, которая обеспечивает не только быструю переориентацию, но и дополнительное быстрое движение во всем доступном объеме, следует использовать модель meanpos-iso . В этой модели краситель эффективно занимает только одно среднее положение, где пространственное усреднение учитывается путем преобразования полиномиального расстояния15. Эта модель применима, например, если (обычно гидрофобный) краситель прикреплен к гидрофильной области, e.г., ДНК. Применение модели meanpos-iso приводит к дальнейшему уменьшению размера достоверных объемов примерно в два раза. Однако краситель, связанный с белком, может обратимо связываться с несколькими гидрофобными участками в своем стерически доступном объеме (AV). Флуорофор, который мгновенно переключается между этими областями, но внутри одной области подвергается свободному вращению и быстрому локализованному движению, лучше всего описывается моделью var-meanpos-iso . Для аналогичной ситуации, когда краситель не может свободно вращаться, применяется модель var-meanpos .Более подробную информацию об этих моделях можно найти в нашей недавней публикации32.

    Эти модели имеют обширный репертуар, специально предназначенный для различных сред, с которыми может столкнуться краситель, и их разумное применение оптимизирует точность его локализации. В Fast-NPS каждая молекула красителя, прикрепленная к определенному положению, может быть отнесена к отдельной модели, так что FRET-партнерам разрешено иметь разные модели. Это обеспечивает безграничное моделирование, приближенное к природе. Однако важно проводить строгие статистические тесты, чтобы гарантировать, что результат, полученный с помощью окончательной комбинации моделей, по-прежнему согласуется с экспериментальными данными.Эти тесты включены в программное обеспечение Fast-NPS.

    Чтобы применить Fast-NPS к экспериментальным данным, требуется измерение (только) трех входных параметров. Во-первых, необходимо определить изотропные радиусы Фёрстера для каждой пары красителей (

    ). Следовательно, необходимо измерять квантовый выход (QY) донорного красителя, спектры излучения донорной флуоресценции и спектры поглощения акцептора. Эти измерения можно проводить в большом количестве, используя стандартный спектрометр и стандартный флуоресцентный спектрометр.Для каждой пары затем вычисляется R 0 с помощью бесплатного программного обеспечения PhotochemCAD и может использоваться в анализе NPS. Более того, (разрешенная во времени) анизотропия флуоресценции молекул красителя должна быть получена с использованием поляризационного (и временного) флуоресцентного спектрометра. Однако наиболее важными входными параметрами для Fast-NPS являются эффективности smFRET, измеренные на установке для флуоресцентной микроскопии одиночных молекул, такой как флуоресцентный микроскоп полного внутреннего отражения (TIRFM).

    Здесь мы представляем пошаговый протокол для получения данных smFRET и применения Fast-NPS (, рис. 1, ).

    Протокол

    1. Предварительные условия и лабораторное оборудование

    ПРИМЕЧАНИЕ: Сборка измерительной камеры изображена на Рис. 3 . Сэндвич-конструкция измерительной камеры состоит из трех основных компонентов: предметного стекла из кварцевого стекла (плавленого кварца), герметизирующей пленки и покровного стекла, закрывающего проточную камеру. Измерительная камера устанавливается на специальный держатель образца.Размеры камеры для образцов и металлического держателя соответствуют стандартному предметному стеклу из кварцевого стекла для микроскопии (76 мм x 26 мм).

    1. Вырежьте предметные стекла из кварцевого стекла с помощью алмазного сверла (0,75 мм) в положениях, указанных на Рисунок 4 . Конструкция слайдов из кварцевого стекла асимметрична, чтобы различать две стороны каждого слайда. ПРИМЕЧАНИЕ. Кварцевые предметные стекла можно использовать повторно после измерения до появления царапин на поверхности.

    2. Для установки камер используйте индивидуальные металлические держатели образцов, как показано на Рисунок 5 .Держатели образцов содержат две резьбы (M4) для соединения впускной и выпускной трубок для проточной камеры. Кроме того, используйте резьбу (M3), чтобы установить камеру для образца на металлический держатель, а также резьбу (M3), чтобы закрепить держатель призмы на нижней половине металлического держателя.

    3. Выполните измерения smFRET на флуоресцентном микроскопе полного внутреннего отражения призменного типа (TIRFM) (, рис. 6, ). ПРИМЕЧАНИЕ: TIRFM включает три лазера: зеленый (532 нм, Nd: YAG-лазер) и красный лазер (643 нм, диодный лазер) для возбуждения донорных и акцепторных молекул красителя, а также синий лазер (491 нм. , твердотельный лазер с диодной накачкой) для обесцвечивания фоновых флуоресцентных примесей на камере для образца перед измерением smFRET.Три лазерных луча пространственно объединены и могут быть выбраны с помощью акустооптического перестраиваемого фильтра (AOTF). Флуоресцентный свет собирается объективом с высокой апертурой, разделяется на донорный и акцепторный каналы с помощью дихроичного зеркала и проецируется на две камеры EM-CCD. Камера для образца прикреплена к микрометрическому столику, позволяющему перемещаться в направлениях x и y с помощью двух шаговых двигателей. Третий пьезодвигатель используется вместе с ИК-лазером и позиционно-чувствительным детектором для создания системы автоматической фокусировки, обеспечивающей оптимальную фокусировку на протяжении всего эксперимента.

      1. Используйте переменное лазерное возбуждение (ALEX), когда наблюдается динамика временных траекторий FRET 25 . Такая динамика может быть вызвана либо конформационными изменениями внутри молекул, либо флуктуациями яркости акцептора и мерцанием акцептора. ПРИМЕЧАНИЕ: ALEX позволяет различать эти две возможные причины и предотвращает неправильную интерпретацию динамических траекторий FRET. Однако из соображений простоты протокольная часть ограничивается анализом фильмов, снятых без ALEX.Внимание: в установке флуоресценции одиночных молекул используются лазеры класса 3B. Перед запуском системы убедитесь, что приняты соответствующие меры безопасности при работе с лазером в соответствии с постановлениями местного правительства.

    4. Выполните измерение поглощения, используемое для определения квантового выхода на спектрометре UV-VIS (см. Материалы и методы).

    5. Выполните измерение спектра излучения донорной флуоресценции, спектра поглощения акцептора и анизотропии флуоресценции на флуоресцентном спектрометре (см. Материалы и методы).

    6. Подготовьте камеры для проб в соответствии с опубликованными процедурами 33. В качестве альтернативы можно использовать процедуру, описанную в [34].

    7. Пометьте исследуемые образцы парой молекул донорно-акцепторного красителя, подходящей для smFRET, и убедитесь, что на поверхности камеры для образцов имеется фрагмент биотина для иммобилизации. ПРИМЕЧАНИЕ. Чтобы локализовать неизвестное положение красителя антенны с помощью программного обеспечения Fast-NPS, необходимы различные образцы конструкций. Каждая конструкция должна иметь одну метку в неизвестном положении окраски антенны и одну метку в спутниковой позиции, известной из кристаллической структуры.Для получения точных результатов требуются по крайней мере три различных конструкции с красителями, прикрепленными к положению антенны, и три различных положения спутника. Измерения между антеннами, а также между спутниками также полезны для повышения точности, однако для этого требуется обмен молекулами красителя, который необходимо правильно ввести в анализ.

    2. Установка проточных камер в специальный держатель

    1. Протяните силиконовую трубку (внутренний диаметр 0,8 мм, внешний диаметр 2,4 мм) в полые винты с выступом (M4) и обрежьте трубку с обоих концов ровно, оставив выступ 1 см с обеих сторон острым лезвием бритвы.Отрегулируйте выступ трубки примерно на 2 мм с одной стороны винта с выступом.

    2. Установите проточную камеру в держатель образца таким образом, чтобы отверстия в предметном стекле из кварцевого стекла совпадали с резьбой держателя образца. Осторожно затяните впускные и выпускные винты, чтобы убедиться, что впускное и выпускное отверстия камеры для пробы по-прежнему проницаемы. Осторожно затяните четыре винта держателя акрилового стекла, чтобы зафиксировать положение проточной камеры.

    3. Обрезанная силиконовая трубка (0.58 мм ВД, 0,96 мм ВД) на куски длиной 20 см. Вставьте одну из частей во входной и выходной винт измерительной камеры. Закройте впускной и выпускной трубопровод с помощью зажима. ПРИМЕЧАНИЕ. Собранные камеры для проб можно хранить при комнатной температуре до двух недель.

    3. Измерение smFRET на микроскопе TIRF

    1. Используйте шприц, чтобы промыть камеру для образца 500 мкл PBS. Постоянно предотвращайте попадание пузырьков воздуха в камеру для пробы, создавая каплю на конце впускной трубки перед переходом на другой буферный раствор.

    2. Промойте камеру для образцов раствором 100 мкл нейтравидина (0,5 мг / мл в PBS) и инкубируйте 15 мин при комнатной температуре.

    3. Промойте раствор нейтравидина 500 мкл PBS.

    4. Навинтите металлический держатель призмы на камеру для образца.

    5. Установите камеру для образца на микрометрический столик TIRF-микроскопа. Убедитесь, что камера для образца установлена ​​горизонтально как можно прямо перед объективом, чтобы избежать расфокусировки во время сканирования.

    6. Запустите программное обеспечение для управления камерами EM-CCD и программное обеспечение для управления пьезодвигателями сцены.

    7. Отрегулируйте фокусировку объектива микроскопа, глядя на отражение ИК-лазера.

    8. Поместите призму (PS991, n = 1,52) поверх металлического держателя призмы. Отрегулируйте боковое положение призмы, чтобы лазерные лучи попадали на призму, затем используйте клей и инкубируйте с УФ-светом в течение 5 мин.ПРИМЕЧАНИЕ. Установленную призму можно повторно использовать после очистки.

    9. В программном обеспечении управления камерой нажмите «Настройка сбора данных» и определите следующие параметры сбора данных: время интеграции 100 мс, 401 кадр / видеоролик (зеленая камера), 400 кадров / видеоролик (красная камера), коэффициент усиления электронного умножителя 225, предварительный -усиление 5-кратное усиление и скорость считывания 3 МГц при 14 битах.

    10. Создайте папку на локальном жестком диске для измерения. Выберите желаемое имя для файлов измерений, e.г. , год-месяц-день. В настройках программы зайдите в райдер «Автосохранение», включите «Автосохранение» и выберите формат файла * .sif для получения фильма. Выберите папку на жестком диске. Используйте имя папки как файл.

    11. Включите функцию «Автоинкремент» (установите начальное значение на 1). Включите привязку оператора к имени файла. Используйте «ДОН» и «АСС» для донорного и акцепторного каналов соответственно. Выберите «_» в качестве разделителя.

    12. В программном обеспечении управления камерой нажмите «Видео», чтобы запустить прямое изображение с камеры и обесцветить фоновую флуоресценцию путем сканирования камеры для образца с использованием максимальной интенсивности всех трех лазеров (вместе ≈ 3000 Вт / см 2 для 10 с на поле зрения).

    13. Выключите синий лазер. Уменьшите интенсивность зеленого лазера примерно до 200 Вт / см 2 и примерно до 40 мВт / см 2 для красного лазера, если используется переменное лазерное возбуждение (ALEX).

    14. Разбавьте биотинилированный флуоресцентный образец до концентрации 50–100 пМ. Загрузите 100 мкл раствора. При связывании образец иммобилизируется на поверхности камеры. ПРИМЕЧАНИЕ. Следите за тем, чтобы не перегружать камеру. Соседние молекулы должны быть отделены друг от друга.

    15. При необходимости загрузите в камеру дополнительные 100 мкл пробы, в 2 раза более концентрированной.

    16. Закройте впускной и выпускной трубопроводы измерительной камеры зажимами после завершения загрузки.

    17. Выключите все лазеры и используйте пьезодвигатели для перемещения проточной камеры на два поля зрения дальше.

    18. В программном обеспечении управления камерой щелкните «Take signal», чтобы начать запись видео и одновременно включить лазер.Регулируя мощность лазера, убедитесь, что к концу пленки обесцвечивается более 80% молекул.

    19. Повторите шаги 3.17 и 3.18 для всей области предварительно обесцвеченной камеры для образца.

    4. Получение карты трансформации («beadmap»)

    1. Подготовьте проточную камеру, как описано в разделах 1.1, 1.2 и 2.

    2. Используйте флуоресцентные мультиспектральные шарики, покрытые авидином, которые показывают испускание флуоресценции в донорный и акцепторный каналы.Вихревую смесь в течение 1 мин, затем разбавьте 50 мкл смеси в 50 мкл ddH 2 O. Снова встряхните в течение 1 мин, обработайте ультразвуком 1-2 мин, затем встряхните еще 10 сек.

    3. Выполните шаги, описанные для измерений smFRET (Раздел 3.5–3.10).

    4. Загрузите 100 мкл (1 объем камеры) разбавленных 1: 2 флуоресцентных шариков в проточную камеру. Подождите 10 минут, чтобы флуоресцентные шарики связались с поверхностью.

    5. Используйте параметры сбора данных в 3.9, но измените длину видеоролика на 26 (зеленая камера) и 25 (красная камера), а коэффициент усиления электронного умножителя на 10.

    6. Установите интенсивность зеленого лазера на значение 20 Вт / см 2 .

    7. Возьмите один видеоролик в поле зрения примерно с 50–100 бусинами.

    5. Обработка и анализ данных smFRET

    1. Используйте специально написанное программное обеспечение SM FRET для анализа диаграммы направленности (см. Материалы и методы) и полученных фильмов. Запустите программу viewPlot1.m.

    2. Щелкните «Анализ» | «Анализ партии», снимите флажок «ALEX», если он не использовался.Для лучшей производительности выберите «высокий» порог нахождения пика. Нажимаем «ОК».

    3. Выберите «НЕТ», когда вас спросят, анализировалась ли карта уже. Просмотрите папку, содержащую полученный beadmap, и выберите файл * .sif (дважды щелкнув по нему). В следующем диалоговом окне нажмите «ОК». ПРИМЕЧАНИЕ. Если диаграмма направленности уже была проанализирована в ходе предыдущего измерения, выберите здесь «ДА» и выберите сохраненную карту разбивки, перейдя в нужную папку и дважды щелкнув файл карты схемы * .map.Продолжите с шага 5.8.

    4. Выберите два одиночных шарика, расположенных в противоположных углах поля зрения. Интенсивность пикселей имеет цветовую кодировку от темно-синего (низкая интенсивность) до темно-красного (высокая интенсивность).

    5. Щелкните по центру первой бусинки. Если центр молекулы можно четко определить по цветовой кодировке, выберите «ДА» или нажмите «НЕТ» и выберите другую пару молекул.

    6. Поместите перекрестие на пиксель, показывающий максимальную интенсивность, и нажмите «СОХРАНИТЬ».Повторите процесс со вторым каналом.

    7. Щелкните по молекуле в противоположном углу и повторите шаги 5.5 и 5.6. ПРИМЕЧАНИЕ. Относительный сдвиг пикселей двух каналов отображается в командном окне, и карта преобразования автоматически сохраняется как файл * .map в папку, содержащую файл beadmap * .sif.

    8. Чтобы загрузить фильмы-доноры и акцепторы (* .sif) для «пакетного анализа», перейдите в папку, выберите все фильмы, которые необходимо проанализировать, и нажмите «OK».В следующем диалоговом окне нажмите «ОК». ПРИМЕЧАНИЕ. Пакетный анализ завершен, когда последняя дорожка, отображаемая в командном окне, начинается с «Завершенный анализ…». Обнаруженные молекулы отображаются в новом окне, в котором также указывается относительный сдвиг донорного и акцепторного каналов, определенный из карты трансформации.

    9. Чтобы загрузить пакетные файлы фильмов, щелкните Файл | Загрузить. Снимите отметку с опции «ALEX», если она не использовалась. Установите гладкость на 10 и нажмите «ОК».Выберите папку, содержащую файлы * .ttr, и нажмите «выбрать все» и «ОК» в следующем контекстном меню.

    10. Если отображаемая кривая имеет характерные фазы smFRET ( Рисунок 2 ), нажмите кнопку переключения «Не выбрано» и сначала выберите момент времени начала события FRET, перемещая линию с помощью курсора мыши и щелкнув левой кнопкой мыши. Затем выберите момент времени обесцвечивания молекулы-акцептора и, наконец, момент времени обесцвечивания молекулы-донора.

    11. В следующем окне эффективность FRET отображается синим цветом. Чтобы выбрать график, нажмите кнопку «Да», в противном случае выберите «Нет». Чтобы повторно получить доступ к временной шкале, нажмите кнопку «Назад».

    12. Повторяйте процедуру до последней молекулы фильма.

    13. После анализа последней молекулы в фильме сохраните выбранные следы, нажав «Файл | Сохранить». Сохраните выбранные трассы в той же папке, что и файлы * .sif.

    14. Повторите шаги 5.10-5,13 за все приобретенные фильмы.

    15. Выполнить программу comb_fret_results.m . Выберите папку, содержащую файлы * .res и все файлы * .FRETonly_trace. Сохраните молекулярные файлы FRET и FRET как MW.dat и FRW.dat соответственно. ПРИМЕЧАНИЕ. Файлы * .dat сохраняются как файлы ASCII. Файл FRW.dat содержит шесть столбцов и одну строку для каждого кадра FRET. Шестой столбец содержит скорректированную покадровую эффективность FRET. Файл MW.dat содержит 21 столбец и одну строку для каждой выбранной молекулы FRET.Третий столбец содержит молекулярную эффективность FRET.

    6. Отображение данных smFRET в гистограммах

    ПРИМЕЧАНИЕ: Для извлечения средней эффективности smFRET всех записанных данных smFRET покадровые данные или данные по молекулам наносятся на гистограммы и анализируются с использованием гауссовских аппроксимаций до ( множественные) пики. Далее в протоколе используется коммерческое программное обеспечение для анализа данных (см. Список материалов). Однако вместо этого можно использовать любое другое доступное программное обеспечение.

    1. Откройте программное обеспечение для анализа данных (см. Список материалов). Щелкните File | Import | multiple ASCII. Выберите папку, содержащую файл FRW.dat. Выберите файл и нажмите «ОК». Подтвердите вариант ввода нажатием «ОК» без изменений.

    2. Выберите третий столбец C (Y), содержащий исправленные значения эффективности FRET, щелкните столбец правой кнопкой мыши и выберите «График | Статистика | Гистограмма». В окне гистограммы дважды щелкните столбцы и отмените выбор «автоматическое разбиение на интервалы» и выберите желаемый размер интервала, e.г. , 0,05. Также выберите начальное и конечное значения, , например, -0,025 и 1,025.

    3. Выберите столбцы гистограммы, щелкнув по ним левой кнопкой мыши. Затем щелкните правой кнопкой мыши и выберите «Перейти к рабочему листу корзины». Выберите столбец «Количество», щелкнув его левой кнопкой мыши, а затем щелкните правой кнопкой мыши и выберите «График | Столбец / столбец / круговая диаграмма | Столбец».

    4. На столбчатой ​​диаграмме перейдите в диалоговое окно Анализ | Подгонка | Подгонка нелинейной кривой | Открыть. Выберите «Гауссовский» в разделе «Функция», затем перейдите к райдеру «Параметр».Отмените выбор автоматической инициализации параметров. Зафиксируйте значение смещения (y0) на 0. Нажмите «Подогнать». ПРИМЕЧАНИЕ. Функция подгонки, а также детали подгонки теперь отображаются на столбчатой ​​диаграмме. Значение «xc» дает центр функции соответствия, , то есть — средний КПД FRET, который служит входным параметром для программного обеспечения NPS.

    7. Измерение квантового выхода

    1. Выполните определение квантового выхода относительным методом, аналогичным процедуре, описанной Würth et al. 35, используя в качестве стандарта родамин 101, растворенный в этаноле (QY = 91,5%).

    2. Запишите спектры поглощения на спектрометре UV-VIS, используя объем 80 мкл в абсорбционной кювете с длиной пути 1 см. Поглощение на длине волны, которая будет использоваться для возбуждения флуоресценции, должно быть ≤ 0,05.

    3. Запишите спектры излучения на спектрометре с ламповой калибровкой, работающем в режиме счета фотонов. Проведите измерения с поляризаторами Глана-Томпсона в возбуждении (0 °) и эмиссии (54.7 °) (условия магического угла) с использованием спектральной ширины полосы около 5 нм и 2,5 нм для монохроматора возбуждения и излучения соответственно. Измерьте образцы после их переноса во флюоресцентную кювету с длиной пути 3 мм, следя за тем, чтобы скорость счета не превышала 10 6 с -1 .

      1. Рассчитайте квантовый выход согласно

    , где n и n Std — показатели преломления растворителя образца и стандарта соответственно.f (λ) и f_Std (λ) — интенсивности флуоресценции образца и стандарта на длине волны λ. A (λ от ) и A std от ) — это оптическая плотность образца и эталона на длине волны возбуждения, а Φ std — квантовый выход стандарта.

    8. Расчет изотропного радиуса Ферстера

    1. Рассчитайте изотропный радиус Ферстера (

      ) из ​​спектра излучения молекулы донора, спектра поглощения молекулы акцептора, квантового выхода донора и показателя преломления среды.Используйте бесплатную программу PhotochemCAD для расчета

      . Однако вместо него можно использовать любое другое доступное программное обеспечение36.

    9. Измерение анизотропии

    1. Определите стационарную анизотропию флуоресценции по записям спектров флуоресценции с различными настройками поляризатора возбуждения / излучения (V / V, V / H, H / V, H / H) 36 .

    2. Рассчитайте G-фактор, который корректирует артефакты поляризации прибора, для каждой длины волны из отношения

    и используйте его для вычисления значения анизотропии для каждой длины волны:

    , где I xy указывает интенсивность для поляризации возбуждения x и поляризации излучения y .

    1. Усредните значения по спектральному диапазону излучения для расчета стационарной анизотропии флуоресценции.

    10. Установка программного обеспечения Fast-NPS

    1. Загрузите UCSF Chimera с http://www.cgl.ucsf.edu/chimera и следуйте инструкциям по установке.

    2. Перейдите на сайт «Института биофизики» при Ульмском университете: https://www.uni-ulm.de/en/nawi/institute-of-biophysics/software.html. Загрузите текущую версию Fast-NPS и распакуйте ее в любую папку.Откройте подпапку «Распространяемый компонент» и установите распространяемый пакет Visual C ++, который подходит для системы.

    11. Центрирование файла pdb

    1. Откройте интересующие файлы pdb в Chimera. Выберите все атомы макромолекулярного комплекса и вычислите координаты центроида (Инструменты | Анализ структуры | Оси / Плоскости / Центроиды | Определить центроид… | Хорошо).

    2. Откройте журнал ответов (Избранное | Журнал ответов) и инструмент преобразования (Инструменты | Движение | Трансформировать координаты).Введите координаты центроида, показанного в журнале ответов, в текстовое поле «Сдвиг» окна преобразования координат и измените знак каждой координаты. Нажмите «Применить» и сохраните файл с помощью «Сохранить PDB» (Файл | Сохранить PDB).

    12. Настройка приоритетных позиций

    ПРИМЕЧАНИЕ. Все значения указаны в ангстремах.

    1. Запустите язык технических вычислений и измените текущую папку на локальную папку Fast-NPS. Введите в командном окне: FastNPS.

    2. Создайте новый файл вакансии в Менеджере проектов (Проект | Новый).

    3. Установите предыдущую позицию (Инструменты | Модель красителя до).

    4. В панели «предыдущие основы» определите пространственное разрешение предыдущей позиции, введя ее значение (рекомендуется 2).

    5. Исключите внутреннюю часть макромолекулы, установив флажок и нажав кнопку «загрузить PDB». Выберите и загрузите центрированный файл PDB, как описано в Разделе 11.

    6. Укажите приблизительный диаметр (рекомендуется 13 Å, см. Обсуждение) красителя, указав его значение.

    7. Введите расстояние скелетонизации, , т. Е. расстояние, на которое молекула красителя может проникнуть в макромолекулу (рекомендуется 2 Å).

    8. В панели «Максимальный предыдущий размер» введите минимальные и максимальные координаты предыдущей позиции (рекомендуется: x в [-150,150], y в [-150,150] и z в [-150,150]).

    9. При определении сателлита активируйте флажок «присоединение через гибкий линкер» на панели «предыдущие основы» и введите в панель «линкер» координаты атома (в центрированном файле pdb), в котором находится молекула красителя. прилагается.Далее укажите длину и диаметр линкера, введя их значения (рекомендуются 13 Å и 4,5 Å, см. Обсуждение). В случае антенны пропустите этот пункт.

    10. Нажать кнопку «рассчитать доступный объем».

    11. Сохраните предыдущее положение и при желании экспортируйте его для целей визуализации с помощью такого программного обеспечения, как Chimera.

    13. Определение сетевой геометрии

    1. Откройте окно определения измерений (Режим | Редактировать геометрию).

    2. Создайте новую молекулу красителя, нажав кнопку «Новый» в панели «Красители».

    3. Задайте анизотропию флуоресценции (Раздел 9), введя значение и выбрав модель красителя в раскрывающемся меню «Модель красителя».

    4. Нажмите кнопку «Загрузить», выберите соответствующую позицию и установите флажок активировать краситель. Повторите эту процедуру для всех красок, , то есть для всех антенн, а также для всех спутников.

    5. После создания всех красителей определите размеры.Создайте новое измерение, нажав «Создать» на панели «Измерения».

    6. Выберите партнеров FRET в раскрывающихся меню «Dye1» и «Dye2» ниже.

    7. Введите эффективность smFRET с ошибкой и изотропный радиус Ферстера этой пары красителей.

    8. Наконец, отметьте флажок активации измерения. Повторите эту процедуру для всех измерений. ПРИМЕЧАНИЕ. Часто сеть становится все более сложной, так что пользователь может запутаться.Во избежание ошибок проверьте сеть визуально, нажав кнопку «Проверить сеть». На рисунке показаны активированные красители и измерения с помощью линий, соединяющих красители FRET.

    14. Расчет

    1. Откройте окно расчета (Режим | Расчет).

    2. Если каждому красителю в сети назначена определенная модель, выберите «Определено пользователем» и запустите расчет, нажав «Расчет». Чтобы использовать все красители в одной модели, выберите одну из пяти моделей (классическая, iso, meanpos-iso, var-meanpos-iso и var-meanpos) и продолжайте.ПРИМЕЧАНИЕ. В командном окне будет отображаться ход расчета. Fast-NPS сделает это во всплывающем сообщении, когда расчет будет завершен.

    15. Визуализация результатов

    1. Чтобы экспортировать достоверные объемы красителей, откройте окно просмотра результатов (Модель | Просмотр результатов).

    2. Экспортные плотности красителей:

      1. Экспортные красители по отдельности или все одновременно. Чтобы экспортировать отдельный краситель, выберите его на панели «Отображаемые красители» и нажмите «Экспорт плотности».Введите разрешение (рекомендуется 2) и выберите тип файла для экспорта. Справа показана плотность и некоторые ее математические характеристики.

      2. Чтобы экспортировать все красители одновременно, нажмите «Пакетный экспорт».

    3. Откройте полученные файлы плотности в Chimera.

    16. Проверка согласованности выбранной комбинации моделей

    1. Откройте окно просмотра результатов (Модель | Просмотр результатов).Если на панели «Информация о расчетах» в текстовом поле «Согласованность» отображается значение ниже 90%, текущая модель не отражает в достаточной степени измеренную эффективность smFRET и, таким образом, является несовместимой.

    2. В случае несоответствия нажмите кнопку «Детальная согласованность». Найдите измерения со значением ниже 90%. Если в этих измерениях преимущественно задействованы один или несколько красителей, их модели могут вызвать несоответствие. Рассмотрите различные модели красителей для этих красителей и повторно запустите расчет Fast-NPS.

    Типичные результаты

    Транскрипция — это первый шаг в экспрессии генов у всех организмов. У архей транскрипция осуществляется одной РНК-полимеразой (РНКП). По сравнению с эукариотами, RNAP архей имеет поразительное структурное сходство со своими эукариотическими аналогами, но при этом имеет более простой механизм транскрипции. Таким образом, археи можно использовать в качестве модельной системы для изучения инициации транскрипции эукариот с помощью РНК-полимеразы II (Pol II). Недавно полная архитектура открытого комплекса РНК-полимеразы архей была определена из одномолекулярных FRET и NPS.Данные анализа NPS были использованы для построения модели полного открытого промоторного комплекса архей, которая дает полезные сведения о механизме инициации транскрипции.

    Чтобы выяснить эту структуру, была измерена эффективность smFRET между неизвестными молекулами антенного красителя, расположенными внутри открытого промоторного комплекса, и несколькими известными молекулами красителя-сателлита, которые были включены в пять ссылочных сайтов в RNAP, положения которых известны из кристаллографических структур (pdb-ID). : 2WAQ) 37.Антенные красители были прикреплены к любому из различных положений нематричной ДНК, TFB, TBP или TFE. Полная сеть, использованная в этом исследовании, состояла из более чем 60 измеренных расстояний.

    Рисунок 7 изображает модель полного комплекса открытого промотора архей, построенного на основе анализа NPS. Он состоит из двухцепочечной промоторной ДНК (голубой и голубой), РНК-полимеразы (серый) и факторов инициации транскрипции ТВР (фиолетовый), TFB (зеленый) и TFE (желтый).Модель накладывается на результаты анализа NPS, достоверные объемы, которые были рассчитаны с использованием классической модели (A), модели iso (B), модели meanpos-iso (C), модели var-meanpos-iso. (D) и модель var-meanpos (E).

    Рисунок 1: Рабочий процесс сбора и обработки параметров, необходимых для расчета Fast-NPS. Щелкните здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

    Рисунок 2: Примерная временная диаграмма интенсивности флуоресценции для события smFRET. Интенсивности флуоресценции донора (зеленый) и молекулы акцептора (красный), показывающие три характерные фазы, а именно: I: smFRET, II: флуоресценция донора после фотообесцвечивания акцептора, III: фоновая флуоресценция после фотообесцвечивания донора. Щелкните здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

    Рисунок 3: Схематическое изображение проточной камеры для экспериментов smFRET. Проточная камера устанавливается на индивидуальный металлический держатель с держателями из акрилового стекла.Сэндвич-конструкция проточной камеры включает предметное стекло из кварцевого стекла (плавленого кварца) с двумя отверстиями для крепления впускной и выпускной трубок, герметизирующую пленку и покровное стекло, закрывающее проточную камеру. Призма для освещения TIRF устанавливается на нижнюю половину проточной камеры. Полые винты с язычками обеспечивают вход и выход для проточной камеры. Щелкните здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

    Рисунок 4: Подготовка предметного стекла из кварцевого стекла и герметизирующей пленки. Механический чертеж предметного стекла из кварцевого стекла с указанием положения отверстий (в миллиметрах). Щелкните здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

    Рисунок 5: Механический чертеж проточной камеры. Размеры алюминиевого держателя призмы, держателя акрилового стекла и алюминиевой монтажной рамы указаны в миллиметрах. Щелкните здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

    Рисунок 6: Схематическое изображение призменной установки TIRF, используемой для экспериментов smFRET. Сокращения для обозначения оптических компонентов: A — диафрагма; DM — дихроичное зеркало; F, эмиссионный фильтр; L, линза; М, зеркало; О, объективный; П — призма; PSD, позиционно-чувствительный фотодиод; S, образец; PS, этап позиционирования; Т, телескоп. Щелкните здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

    Рисунок 7: Результаты моделирования различных допущений модели. Все изображения показывают полимеразу РНК архей (pdb-ID: 2WAQ, вид сверху) вместе с моделью для промоторной ДНК (тДНК и нтДНК синим и голубым цветом соответственно), TBP (фиолетовый), TFB (зеленый) и TFE (желтый). ) в археологическом открытом комплексе 30.Надежные объемы накладываются на результаты моделирования NPS ( A ) классической модели, ( B ) iso-модели, ( C ) meanpos-iso модели, ( D ) var-meanpos- iso и ( E ) модель var-meanpos. Все объемы показаны с достоверностью 68%. Классическая сеть и сеть var-meanpos согласуются с данными smFRET. Напротив, сети, в которых для всех красителей выбрана модель iso, meanpos-iso или var-meanpos-iso, не соответствуют измеренным данным.Щелкните здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

    Обсуждение

    Мы представляем установку и экспериментальную процедуру для точного определения эффективности FRET между красителями, прикрепленными через гибкие линкеры к биомакромолекулам, то есть , нуклеиновым кислотам и / или белкам.

    Для обеспечения точных измерений smFRET (Раздел 3) очень важно исключить воздух из проточной камеры в любой момент во время измерения. Кроме того, следите за тем, чтобы не перегружать проточную камеру флуорофорами.Флуорофоры должны быть четко разделены для обеспечения правильного анализа. Поскольку пары smFRET, которые не показывают обесцвечивание донора, должны быть исключены из анализа, убедитесь, что> 80% молекул в поле зрения обесцвечиваются в конце фильма. Чтобы учесть неоднородности в образце, β-фактор и γ-фактор, корректирующие перекрестные помехи и относительную эффективность обнаружения донорного и акцепторного каналов, соответственно, рассчитываются для каждой пары FRET отдельно.

    Настройки камеры (время интегрирования, коэффициент усиления электронного умножителя, коэффициент усиления предварительного усилителя и скорость считывания, описанные в разделе 3.9) должны быть установлены на значения, обеспечивающие наилучший компромисс между отношением сигнал / шум, динамическим диапазоном и временным разрешением. Их необходимо перенастроить для разных экспериментов или при использовании другого оборудования. Количество кадров должно быть достаточно большим, чтобы обеспечить обесцвечивание большинства донорных молекул в течение времени наблюдения.

    Для измерений на флуоресцентном спектрометре (разделы с 7 по 9) должен быть найден хороший компромисс между интенсивностью сигнала и спектральным разрешением записанных данных.С этой целью щели на пути возбуждения и излучения флуоресцентного спектрометра должны быть адаптированы в зависимости от используемого инструмента и концентрации образца.

    Кроме того, мы представляем метод анализа Fast-NPS для получения структурной информации о переходных или динамических макромолекулярных комплексах. NPS был применен для выявления пути нематричной цепи ДНК и положения факторов инициации транскрипции в открытом комплексе РНК-полимеразы архей. Используя сеть из более чем 60 различных измерений расстояний, мы показали, что Fast-NPS, оснащенный недавно реализованным механизмом отбора проб (Eilert, T., Beckers, M., Drechsler, F., & Michaelis, J. в стадии подготовки), сокращает время, необходимое для анализа этой сложной сети smFRET, примерно на 2 порядка по сравнению с исходным глобальным методом NPS27. Надежность алгоритма основана на сэмплере «Метрополис внутри Гиббса» в сочетании с параллельной схемой темперирования. Fast-NPS показывает точную воспроизводимость сетевых результатов и согласуется с результатами, опубликованными ранее30.

    Было опубликовано несколько различных методов, нацеленных на вывод структурной информации из измерений smFRET11,12,13,14,15,16,17,18.Все эти подходы обеспечивают только одну конкретную модель красителя. Таким образом, красители, которые не соответствуют предположениям, сделанным соответствующей моделью, не могут быть использованы или приводят к ложной структурной информации. Fast-NPS, напротив, позволяет подбирать для каждой молекулы красителя отдельную модель. Это помогает учесть различное конформационное поведение как самой молекулы красителя, так и линкера, используемого для ее прикрепления. Локальное молекулярное окружение молекулы красителя, а также ее физические свойства будут определять, какая модель является наиболее подходящей.

    Для анализируемой сети smFRET комплекса инициации архей изотропное предположение для всех молекул красителя приводит к резкому уменьшению размера вероятных объемов по сравнению с классической моделью. В сочетании с динамическим усреднением положения для всех молекул красителя медиана всех вероятных размеров объема (при 95%) уменьшается до менее 0,5 нм 3 . Однако эти задние молекулы красителя больше не согласуются с их измерениями smFRET, указывая на то, что сделанные предположения приводят к ложной структурной информации.Напротив, апостериорные уровни, определенные в классической модели, согласуются с определенными значениями эффективности smFRET.

    Поскольку предположение об изотропном и / или динамическом усреднении положения для всех красителей приводит к несоответствиям, Fast-NPS позволяет использовать априорные молекулы красителя, в которых каждому красителю может быть назначена одна из пяти моделей. В каждой модели используется один и тот же доступный объем. Алгоритм расчета АВ красителя делает несколько предположений. Сначала пространственная форма флуорофора аппроксимируется сферой.Таким образом, следует использовать диаметр, учитывающий ширину, высоту и толщину флуорофора (раздел 12). Далее форма линкера аппроксимируется гибким стержнем. Значения, представленные в разделе 12, были вычислены для красителя Alexa 647, присоединенного через линкер 12-C. На сегодняшний день невозможно точно определить априори, какая модель наиболее подходит, учитывая геометрию эксперимента, и поэтому все модели должны быть проверены. Как правило, выбирают модель, которая дает наименьший возможный апостериорный размер, но при этом согласуется с данными.Чтобы проверить, соответствует ли выбор модели данным smFRET, мы вычисляем как апостериорную, так и вероятность. Согласованность означает, что более 90% образцов, собранных в апостериорной области, находятся в пределах 95% доверительного интервала правдоподобия.

    Хотя верно, что чем ниже анизотропия, тем меньше неопределенность расстояния, в сети smFRET также необходимо учитывать геометрическое расположение молекул красителя. Таким образом, хотя представление молекул красителя с низкой анизотропией флуоресценции с помощью изомодели является типичным первым выбором, тест на консистенцию предоставляет более прямые средства для выбора правильной модели красителя.Оптимальный выбор моделей красителей может привести к резкому увеличению точности локализации и в то же время сохранить согласованность сети с ее данными FRET.

    Таким образом, Fast-NPS позволяет получать структурную и динамическую информацию о крупных макромолекулярных комплексах. В отличие от обычных структурных методов, таких как рентгеновская кристаллография или криоэлектронная микроскопия, это позволяет отслеживать очень гибкие или переходные комплексы, что значительно расширяет наше понимание механизмов сложных биологических процессов.

    Раскрытие информации

    Авторам нечего раскрывать.

    Благодарности

    Авторы благодарят Б. Грюхманна за механические чертежи проточной камеры. Кроме того, мы хотим выразить нашу благодарность Максу Бекерсу и Флориану Дрекслеру за содержательные комментарии и обсуждения, касающиеся NPS и лежащего в основе механизма выборки.

    Ссылки

    • Ченг Ю. Крио-ЭМ одиночных частиц с кристаллографическим разрешением. Клетка. 2015; 161: 450–457.[Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
    • Гарман Э. Ф. Развитие методов рентгеноструктурного определения биологических макромолекул. Наука. 2014. 343 (6175): 1102–1108. [PubMed] [Google Scholar]
    • Сали А. Итоги первого семинара рабочей группы по гибридным / интеграционным методам wwPDB. Структура. 2015; 23: 1156–1167. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
    • Хопфнер К.П., Михаэлис Дж. Механизмы транслоказ нуклеиновых кислот: уроки структурной биологии и биофизики одиночных молекул.Curr Opin Struct Biol. 2007; 17: 87–95. [PubMed] [Google Scholar]
    • Андо Т., Учихаши Т., Кодера Н. Высокоскоростной АСМ и приложения к биомолекулярным системам. Анну Рев Биофиз. 2013; 42: 393–414. [PubMed] [Google Scholar]
    • Нойман К.К.С., Надь А. Силовая спектроскопия одиночных молекул: оптический пинцет, магнитный пинцет и атомно-силовая микроскопия. Нат методы. 2008; 5: 491–505. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
    • Йилдиз А. Миозин V ходит из рук в руки: визуализация одного флуорофора с помощью 1.5-нм локализация. Наука. 2003. 300 (5628): 2061–2065. [PubMed] [Google Scholar]
    • Джу К., Бальчи Х, Ишицука Й., Бураначай С., Ха Т. Достижения в методах флуоресценции одиночных молекул для молекулярной биологии. Анну Рев Биохим. 2008. 77 (1): 51–76. [PubMed] [Google Scholar]
    • Hohlbein J, Craggs TD, Cordes T. Возбуждение переменного лазера: FRET одной молекулы и не только. Chem Soc Rev.2014; 43 (4): 1156–1171. [PubMed] [Google Scholar]
    • Страйер Л., Хаугланд Р.П. Передача энергии: спектроскопическая линейка.Proc Natl Acad Sci U S. A. 1967; 58 (2): 719–726. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
    • Rasnik I, Myong S, Cheng W, Lohman TM, Ha T. Ориентация связывания ДНК и конформация домена мономера Helicase Rep E. coli, связанного с частичным дуплексным соединением : Исследования одиночных молекул флуоресцентно меченых ферментов. J Mol Biol. 2004. 336 (2): 395–408. [PubMed] [Google Scholar]
    • Андрека Дж. Отслеживание одной молекулы мРНК, выходящей из РНК-полимеразы II. Proc Natl Acad Sci U S A.2008. 105 (1): 135–140. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
    • Шредер Г.Ф., Грубмюллер Х. FRETsg: Построение модели биомолекулярной структуры на основе нескольких экспериментов FRET. Comput Phys Commun. 2004. 158 (3): 150–157. [Google Scholar]
    • Маргиттай М. Одномолекулярный резонансный перенос энергии флуоресценции обнаруживает динамическое равновесие между закрытой и открытой конформациями синтаксина 1. Proc Natl Acad Sci U S. A. 2003; 100 (26): 15516–15521. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
    • Калинин С.Набор инструментов и эталонное исследование для высокоточного структурного моделирования с ограничениями FRET. Нат методы. 2012. 9 (12): 1218–1227. [PubMed] [Google Scholar]
    • Choi J. N6-метиладенозин в мРНК нарушает отбор тРНК и динамику удлинения трансляции. Nat Struct Mol Biol. 2015; 23 (август 2015): 110–115. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
    • Свенссон Б. Трилатерация зондов, связанных с функциональными рианодиновыми рецепторами, на основе FRET. Biophys J. 2014; 107 (9): 2037–2048. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
    • Стивенсон Дж. Д., Кеньон Дж. К., Симмонс М. Ф., Lever AML.Характеристика трехмерной структуры РНК с помощью одиночной молекулы FRET. Методы. 2016. С. 1–11.
    • Ли Н.К. Точные измерения FRET в одиночных диффундирующих биомолекулах с использованием переменного лазерного возбуждения. Биофиз Дж. 2005; 88 (4): 2939–2953. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
    • McCann JJ, Choi UB, Zheng L, Weninger K, Bowen ME. Оптимизация методов восстановления абсолютной эффективности FRET от иммобилизованных одиночных молекул. Биофиз Дж. 2010; 99 (3): 961–970. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
    • Brunger AT, Strop P, Vrljic M, Chu S, Weninger KR.Трехмерное молекулярное моделирование с помощью FRET одной молекулы. J. Struct Biol. 2011; 173: 497–505. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
    • Шулер Б. Одномолекулярный FRET структуры и динамики белка — праймер. J нанобоитехнология. 2013; 11 (Приложение 1): 1–17. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
    • Choi UB. Одномолекулярная модель слитого комплекса синаптотагмин 1-SNARE, полученная из FRET. Nat Struct Mol Biol. 2010. 17 (3): 318–324. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
    • Dale RE, Eisinger J, Blumberg WE.Ориентационная свобода молекулярных зондов. Фактор ориентации при внутримолекулярном переносе энергии. Биофиз Дж. 1979; 26 (2): 161–193. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
    • Kapanidis AN. Переменное лазерное возбуждение одиночных молекул. Acc Chem Res. 2005. 38 (7): 523–533. [PubMed] [Google Scholar]
    • Muschielok A. Система нанопозиционирования для анализа структуры макромолекул. Нат методы. 2008. 5 (11): 965–971. [PubMed] [Google Scholar]
    • Muschielok A, Michaelis J.Применение системы нано-позиционирования для анализа сетей резонансного переноса энергии флуоресценции. J. Phys Chem B. 2011; 115 (41): 11927–11937. [PubMed] [Google Scholar]
    • Andrecka J. Система нано-позиционирования выявляет ход восходящей и неэлементной ДНК внутри комплекса элонгации РНК-полимеразы II. Nucleic Acids Res. 2009. 37 (17): 5803–5809. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
    • Трейтлейн Б. Динамическая архитектура комплекса открытого промотора с минимальной РНК-полимеразой II.Mol Cell. 2012. 46 (2): 136–146. [PubMed] [Google Scholar]
    • Надь Дж. Полная архитектура открытого комплекса РНК-полимеразы архей из одной молекулы. FRET и NPS. Nat Commun. 2015; 6: 6161. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
    • Grohmann D, et al. Фактор инициации TFE и фактор элонгации Spt4 / 5 конкурируют за зажим RNAP во время инициации и удлинения транскрипции. Mol Cell. 2011. 43 (2): 263–274. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
    • Beckers M, Drechsler F, Eilert T, Nagy J, Michaelis J.Количественная структурная информация из FRET одной молекулы. Фарадей Обсуди. 2015; 184: 117–129. [PubMed] [Google Scholar]
    • Беннинк М.Л. Разворачивание отдельных нуклеосом путем растягивания отдельных волокон хроматина с помощью оптического пинцета. Nat Struct Biol. 2001. 8 (7): 606–610. [PubMed] [Google Scholar]
    • Chandradoss SD. Пассивация поверхности для исследования одномолекулярных белков. J Vis Exp. 2014. с. e50549. [Бесплатная статья PMC] [PubMed]
    • Würth C, Grabolle M, Pauli J, Spieles M, Resch-Genger U.Относительное и абсолютное определение квантовых выходов флуоресценции прозрачных образцов. Nat Protoc. 2013. 8 (8): 1535–1550. [PubMed] [Google Scholar]
    • Lakowicz JR. Принципы флуоресцентной спектроскопии. Бостон, Массачусетс: Springer США; 2006. [Google Scholar]
    • Корхин Ю. Эволюция сложных РНК-полимераз: Полная структура РНК-полимеразы архей. PLoS Biol. 2009; 7 (5) [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]

    Произошла ошибка при настройке вашего пользовательского файла cookie

    Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности.Если ваш браузер не принимает файлы cookie, вы не можете просматривать этот сайт.


    Настройка вашего браузера для приема файлов cookie

    Существует множество причин, по которым cookie не может быть установлен правильно. Ниже приведены наиболее частые причины:

    • В вашем браузере отключены файлы cookie. Вам необходимо сбросить настройки своего браузера, чтобы он принимал файлы cookie, или чтобы спросить вас, хотите ли вы принимать файлы cookie.
    • Ваш браузер спрашивает вас, хотите ли вы принимать файлы cookie, и вы отказались.Чтобы принять файлы cookie с этого сайта, нажмите кнопку «Назад» и примите файлы cookie.
    • Ваш браузер не поддерживает файлы cookie. Если вы подозреваете это, попробуйте другой браузер.
    • Дата на вашем компьютере в прошлом. Если часы вашего компьютера показывают дату до 1 января 1970 г., браузер автоматически забудет файл cookie. Чтобы исправить это, установите правильное время и дату на своем компьютере.
    • Вы установили приложение, которое отслеживает или блокирует установку файлов cookie.Вы должны отключить приложение при входе в систему или проконсультироваться с системным администратором.

    Почему этому сайту требуются файлы cookie?

    Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности, запоминая, что вы вошли в систему, когда переходите со страницы на страницу. Чтобы предоставить доступ без файлов cookie потребует, чтобы сайт создавал новый сеанс для каждой посещаемой страницы, что замедляет работу системы до неприемлемого уровня.


    Что сохраняется в файле cookie?

    Этот сайт не хранит ничего, кроме автоматически сгенерированного идентификатора сеанса в cookie; никакая другая информация не фиксируется.

    Как правило, в файле cookie может храниться только информация, которую вы предоставляете, или выбор, который вы делаете при посещении веб-сайта. Например, сайт не может определить ваше имя электронной почты, пока вы не введете его. Разрешение веб-сайту создавать файлы cookie не дает этому или любому другому сайту доступа к остальной части вашего компьютера, и только сайт, который создал файл cookie, может его прочитать.

    Произошла ошибка при установке пользовательского файла cookie

    Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности.Если ваш браузер не принимает файлы cookie, вы не можете просматривать этот сайт.


    Настройка вашего браузера для приема файлов cookie

    Существует множество причин, по которым cookie не может быть установлен правильно. Ниже приведены наиболее частые причины:

    • В вашем браузере отключены файлы cookie. Вам необходимо сбросить настройки своего браузера, чтобы он принимал файлы cookie, или чтобы спросить вас, хотите ли вы принимать файлы cookie.
    • Ваш браузер спрашивает вас, хотите ли вы принимать файлы cookie, и вы отказались.Чтобы принять файлы cookie с этого сайта, нажмите кнопку «Назад» и примите файлы cookie.
    • Ваш браузер не поддерживает файлы cookie. Если вы подозреваете это, попробуйте другой браузер.
    • Дата на вашем компьютере в прошлом. Если часы вашего компьютера показывают дату до 1 января 1970 г., браузер автоматически забудет файл cookie. Чтобы исправить это, установите правильное время и дату на своем компьютере.
    • Вы установили приложение, которое отслеживает или блокирует установку файлов cookie.Вы должны отключить приложение при входе в систему или проконсультироваться с системным администратором.

    Почему этому сайту требуются файлы cookie?

    Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности, запоминая, что вы вошли в систему, когда переходите со страницы на страницу. Чтобы предоставить доступ без файлов cookie потребует, чтобы сайт создавал новый сеанс для каждой посещаемой страницы, что замедляет работу системы до неприемлемого уровня.


    Что сохраняется в файле cookie?

    Этот сайт не хранит ничего, кроме автоматически сгенерированного идентификатора сеанса в cookie; никакая другая информация не фиксируется.

    Как правило, в файле cookie может храниться только информация, которую вы предоставляете, или выбор, который вы делаете при посещении веб-сайта. Например, сайт не может определить ваше имя электронной почты, пока вы не введете его. Разрешение веб-сайту создавать файлы cookie не дает этому или любому другому сайту доступа к остальной части вашего компьютера, и только сайт, который создал файл cookie, может его прочитать.

    Произошла ошибка при установке пользовательского файла cookie

    Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности.Если ваш браузер не принимает файлы cookie, вы не можете просматривать этот сайт.


    Настройка вашего браузера для приема файлов cookie

    Существует множество причин, по которым cookie не может быть установлен правильно. Ниже приведены наиболее частые причины:

    • В вашем браузере отключены файлы cookie. Вам необходимо сбросить настройки своего браузера, чтобы он принимал файлы cookie, или чтобы спросить вас, хотите ли вы принимать файлы cookie.
    • Ваш браузер спрашивает вас, хотите ли вы принимать файлы cookie, и вы отказались.Чтобы принять файлы cookie с этого сайта, нажмите кнопку «Назад» и примите файлы cookie.
    • Ваш браузер не поддерживает файлы cookie. Если вы подозреваете это, попробуйте другой браузер.
    • Дата на вашем компьютере в прошлом. Если часы вашего компьютера показывают дату до 1 января 1970 г., браузер автоматически забудет файл cookie. Чтобы исправить это, установите правильное время и дату на своем компьютере.
    • Вы установили приложение, которое отслеживает или блокирует установку файлов cookie.Вы должны отключить приложение при входе в систему или проконсультироваться с системным администратором.

    Почему этому сайту требуются файлы cookie?

    Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности, запоминая, что вы вошли в систему, когда переходите со страницы на страницу. Чтобы предоставить доступ без файлов cookie потребует, чтобы сайт создавал новый сеанс для каждой посещаемой страницы, что замедляет работу системы до неприемлемого уровня.


    Что сохраняется в файле cookie?

    Этот сайт не хранит ничего, кроме автоматически сгенерированного идентификатора сеанса в cookie; никакая другая информация не фиксируется.

    Как правило, в файле cookie может храниться только информация, которую вы предоставляете, или выбор, который вы делаете при посещении веб-сайта. Например, сайт не может определить ваше имя электронной почты, пока вы не введете его. Разрешение веб-сайту создавать файлы cookie не дает этому или любому другому сайту доступа к остальной части вашего компьютера, и только сайт, который создал файл cookie, может его прочитать.

    Произошла ошибка при установке пользовательского файла cookie

    Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности.Если ваш браузер не принимает файлы cookie, вы не можете просматривать этот сайт.


    Настройка вашего браузера для приема файлов cookie

    Существует множество причин, по которым cookie не может быть установлен правильно. Ниже приведены наиболее частые причины:

    • В вашем браузере отключены файлы cookie. Вам необходимо сбросить настройки своего браузера, чтобы он принимал файлы cookie, или чтобы спросить вас, хотите ли вы принимать файлы cookie.
    • Ваш браузер спрашивает вас, хотите ли вы принимать файлы cookie, и вы отказались.Чтобы принять файлы cookie с этого сайта, нажмите кнопку «Назад» и примите файлы cookie.
    • Ваш браузер не поддерживает файлы cookie. Если вы подозреваете это, попробуйте другой браузер.
    • Дата на вашем компьютере в прошлом. Если часы вашего компьютера показывают дату до 1 января 1970 г., браузер автоматически забудет файл cookie. Чтобы исправить это, установите правильное время и дату на своем компьютере.
    • Вы установили приложение, которое отслеживает или блокирует установку файлов cookie.Вы должны отключить приложение при входе в систему или проконсультироваться с системным администратором.

    Почему этому сайту требуются файлы cookie?

    Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности, запоминая, что вы вошли в систему, когда переходите со страницы на страницу. Чтобы предоставить доступ без файлов cookie потребует, чтобы сайт создавал новый сеанс для каждой посещаемой страницы, что замедляет работу системы до неприемлемого уровня.


    Что сохраняется в файле cookie?

    Этот сайт не хранит ничего, кроме автоматически сгенерированного идентификатора сеанса в cookie; никакая другая информация не фиксируется.

    Как правило, в файле cookie может храниться только информация, которую вы предоставляете, или выбор, который вы делаете при посещении веб-сайта. Например, сайт не может определить ваше имя электронной почты, пока вы не введете его. Разрешение веб-сайту создавать файлы cookie не дает этому или любому другому сайту доступа к остальной части вашего компьютера, и только сайт, который создал файл cookie, может его прочитать.

    Произошла ошибка при установке пользовательского файла cookie

    Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности.Если ваш браузер не принимает файлы cookie, вы не можете просматривать этот сайт.


    Настройка вашего браузера для приема файлов cookie

    Существует множество причин, по которым cookie не может быть установлен правильно. Ниже приведены наиболее частые причины:

    • В вашем браузере отключены файлы cookie. Вам необходимо сбросить настройки своего браузера, чтобы он принимал файлы cookie, или чтобы спросить вас, хотите ли вы принимать файлы cookie.
    • Ваш браузер спрашивает вас, хотите ли вы принимать файлы cookie, и вы отказались.Чтобы принять файлы cookie с этого сайта, нажмите кнопку «Назад» и примите файлы cookie.
    • Ваш браузер не поддерживает файлы cookie. Если вы подозреваете это, попробуйте другой браузер.
    • Дата на вашем компьютере в прошлом. Если часы вашего компьютера показывают дату до 1 января 1970 г., браузер автоматически забудет файл cookie. Чтобы исправить это, установите правильное время и дату на своем компьютере.
    • Вы установили приложение, которое отслеживает или блокирует установку файлов cookie.Вы должны отключить приложение при входе в систему или проконсультироваться с системным администратором.

    Почему этому сайту требуются файлы cookie?

    Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности, запоминая, что вы вошли в систему, когда переходите со страницы на страницу. Чтобы предоставить доступ без файлов cookie потребует, чтобы сайт создавал новый сеанс для каждой посещаемой страницы, что замедляет работу системы до неприемлемого уровня.


    Что сохраняется в файле cookie?

    Этот сайт не хранит ничего, кроме автоматически сгенерированного идентификатора сеанса в cookie; никакая другая информация не фиксируется.

    Как правило, в файле cookie может храниться только информация, которую вы предоставляете, или выбор, который вы делаете при посещении веб-сайта. Например, сайт не может определить ваше имя электронной почты, пока вы не введете его. Разрешение веб-сайту создавать файлы cookie не дает этому или любому другому сайту доступа к остальной части вашего компьютера, и только сайт, который создал файл cookie, может его прочитать.

    Набор инструментов и эталонное исследование для высокоточного структурного моделирования с ограничением FRET

  • 1

    Stryer, L.Перенос энергии флуоресценции как спектроскопическая линейка. Annu. Rev. Biochem. 47 , 819–846 (1978).

    CAS Статья Google Scholar

  • 2

    Ha, T. et al. Исследование взаимодействия между двумя отдельными молекулами: резонансный перенос энергии флуоресценции между одним донором и одним акцептором. Proc. Natl. Акад. Sci. США 93 , 6264–6268 (1996).

    CAS Статья Google Scholar

  • 3

    Сакон, Дж.Дж. И Венингер, К. Определение конформации отдельных белков в живых клетках. Nat. Методы 7 , 203–205 (2010).

    CAS Статья Google Scholar

  • 4

    Торговец, К.А., Бест, Р.Б., Луис, Дж. М., Гопич, И.В. & Eaton, W.A. Характеризация развернутых состояний белков с помощью FRET-спектроскопии одиночных молекул и молекулярного моделирования. Proc. Natl. Акад. Sci. США 104 , 1528–1533 (2007).

    CAS Статья Google Scholar

  • 5

    Best, R.B. et al. Эффект гибкости и цис- остатков в исследованиях одномолекулярного FRET полипролина. Proc. Natl. Акад. Sci. США 104 , 18964–18969 (2007).

    CAS Статья Google Scholar

  • 6

    WoŹź’niak, A.K., Schröder, G., Grubmüller, H., Seidel, C.A.M. И Остерхельт, Ф.Одномолекулярный FRET измеряет изгибы и изгибы ДНК. Proc. Natl. Акад. Sci. США 105 , 18337–18342 (2008).

    Артикул Google Scholar

  • 7

    Hoefling, M. et al. Структурная неоднородность и количественное распределение эффективности FRET полипролинов с помощью гибридного атомистического моделирования и подхода Монте-Карло. PLoS ONE 6 , e19791 (2011 г.).

    CAS Статья Google Scholar

  • 8

    Меклер, В.и другие. Структурная организация холофермента бактериальной РНК-полимеразы и открытого комплекса РНК-полимераза-промотор. Ячейка 108 , 599–614 (2002).

    CAS Статья Google Scholar

  • 9

    Margittai, M. et al. Одномолекулярный резонансный перенос энергии флуоресценции обнаруживает динамическое равновесие между закрытой и открытой конформациями синтаксина 1. Proc. Natl. Акад. Sci. США 100 , 15516–15521 (2003).

    CAS Статья Google Scholar

  • 10

    Andrecka, J. et al. Одномолекулярное отслеживание мРНК, выходящей из РНК-полимеразы II. Proc. Natl. Акад. Sci. США 105 , 135–140 (2008).

    CAS Статья Google Scholar

  • 11

    Muschielok, A. et al. Система нанопозиционирования для структурного анализа макромолекул. Nat. Методы 5 , 965–971 (2008).

    CAS Статья Google Scholar

  • 12

    Choi, U.B. и другие. Одномолекулярная модель слитого комплекса синаптотагмин 1-SNARE, полученная из FRET. Nat. Struct. Мол. Биол. 17 , 318–324 (2010).

    CAS Статья Google Scholar

  • 13

    Brunger, A.T., Strop, P., Vrljic, M., Chu, S. & Weninger, K.R. Трехмерное молекулярное моделирование с помощью FRET одной молекулы. J. Struct. Биол. 173 , 497–505 (2011).

    CAS Статья Google Scholar

  • 14

    Sabir, T., Schroder, G.F., Toulmin, A., McGlynn, P. & Magennis, S.W. Глобальная структура разветвленной ДНК в растворе, выявленная с помощью одномолекулярного FRET высокого разрешения. J. Am. Chem. Soc. 133 , 1188–1191 (2011).

    CAS Статья Google Scholar

  • 15

    Макканн, Дж.J., Zheng, L.Q., Chiantia, S. & Bowen, M.E. Ориентация домена в N-концевом тандеме PDZ из PSD-95 сохраняется в полноразмерном белке. Структура 19 , 810–820 (2011).

    CAS Статья Google Scholar

  • 16

    Balci, H., Arslan, S., Myong, S., Lohman, T.M. & Ха, Т. Одномолекулярное нанопозиционирование: структурные переходы комплекса геликаза-ДНК во время гидролиза АТФ. Biophys.J. 101 , 976–984 (2011).

    CAS Статья Google Scholar

  • 17

    Boura, E. et al. Структура раствора комплекса ESCRT-I по данным малоуглового рентгеновского рассеяния, ЭПР и FRET-спектроскопии. Proc. Natl. Акад. Sci. США 108 , 9437–9442 (2011).

    CAS Статья Google Scholar

  • 18

    Muschielok, A. & Michaelis, J.Применение системы нано-позиционирования для анализа сетей резонансного переноса энергии флуоресценции. J. Phys. Chem. B 115 , 11927–11937 (2011).

    CAS Статья Google Scholar

  • 19

    Олофссон, М., Калинин, С., Здунек, Дж., Оливеберг, М., Йоханссон, Л.Б.А. Триптофан-BODIPY: универсальная пара донор-акцептор для исследования общих изменений внутрибелковых расстояний. Phys. Chem.Chem. Phys. 8 , 3130–3140 (2006).

    CAS Статья Google Scholar

  • 20

    Knight, J.L., Mekler, V., Mukhopadhyay, J., Ebright, R.H. & Levy, R.M. Ограничиваемая расстоянием стыковка рифампицина и рифамицина SV с РНК-полимеразой с использованием систематических измерений FRET: разработка критериев качества и надежности модели. Biophys. J. 88 , 925–938 (2005).

    CAS Статья Google Scholar

  • 21

    Долгих, Е., Ройтберг, А.Э. и Краузе, Дж. Л. Флуоресцентный резонансный перенос энергии в ДНК, меченной красителем. J. Photochem. Photobiol. Chem. 190 , 321–327 (2007).

    CAS Статья Google Scholar

  • 22

    VanBeek, D.B., Zwier, M.C., Shorb, J.M. & Krueger, B.P. Беспокойство по поводу FRET: корреляция между каппа и R. Biophys. J. 92 , 4168–4178 (2007).

    CAS Статья Google Scholar

  • 23

    Синдберт, С.и другие. Точное определение расстояния между нуклеиновыми кислотами с помощью резонансной передачи энергии Фёрстера: влияние длины и жесткости линкера красителя. J. Am. Chem. Soc. 133 , 2463–2480 (2011).

    CAS Статья Google Scholar

  • 24

    Cai, Q. et al. Измерения нанометрового расстояния в РНК с использованием сайт-направленного спинового мечения. Biophys. J. 93 , 2110–2117 (2007).

    CAS Статья Google Scholar

  • 25

    Гётте, М., Rausch, J.W., Marchand, B., Sarafianos, S. & Le Grice, S.F.J. Обратная транскриптаза в движении: конформационная динамика фермент-субстратных взаимодействий. Biochim. Биофиз. Acta 1804 , 1202–1212 (2010).

    Артикул Google Scholar

  • 26

    Пелецкая Е.Н., Когон А.А., Таске С., Арнольд Э. и Хьюз С. Связывание ненуклеозидного ингибитора влияет на взаимодействия субдомена пальцев обратной транскриптазы вируса иммунодефицита человека типа 1 с ДНК. J. Virol. 78 , 3387–3397 (2004).

    CAS Статья Google Scholar

  • 27

    Хуанг, Х., Чопра, Р., Вердин, Г.Л. и Харрисон, С.С. Структура ковалентно захваченного каталитического комплекса обратной транскриптазы ВИЧ-1: последствия для лекарственной устойчивости. Наука 282 , 1669–1675 (1998).

    CAS Статья Google Scholar

  • 28

    Ротвелл, П.J. et al. Многопараметрическая флуоресцентная спектроскопия одиночных молекул выявляет гетерогенность комплексов обратной транскриптазы ВИЧ-1: праймер / матрица. Proc. Natl. Акад. Sci. США 100 , 1655–1660 (2003).

    CAS Статья Google Scholar

  • 29

    Patel, P.H. и другие. Понимание механизмов полимеризации ДНК на основе анализа структуры и функций обратной транскриптазы ВИЧ-1. Биохимия 34 , 5351–5363 (1995).

    CAS Статья Google Scholar

  • 30

    Упадхьяй А.К., Талеле Т.Т. и Пандей В.Н. Влияние выступающей области связывания матрицы ОТ ВИЧ-1 на связывание и ориентацию дуплексной области матрицы-праймера. Мол. Клетка. Биохим. 338 , 19–33 (2010).

    CAS Статья Google Scholar

  • 31

    Лакович, Дж. Р. Принципы флуоресцентной спектроскопии 2-е изд.(Спрингер, 2006).

  • 32

    Ван Дер Меер, Б.В., Кокер, Г. III. И Чен, С.-Й.С. Резонансный перенос энергии: теория и данные. (Wiley, 1994).

  • 33

    Sisamakis, E., Valeri, A., Kalinin, S., Rothwell, P.J., Seidel, C.A.M. Точные исследования FRET одиночных молекул с использованием многопараметрического детектирования флуоресценции. Methods Enzymol. 475 , 455–514 (2010).

    CAS Статья Google Scholar

  • 34

    Антоник, М., Фелекян, С., Гайдук, А., Зайдель, C.A.M. Отделение структурных неоднородностей от стохастических вариаций в распределении флуоресцентного резонансного переноса энергии с помощью анализа распределения фотонов. J. Phys. Chem. B 110 , 6970–6978 (2006).

    CAS Статья Google Scholar

  • 35

    Гопич И.В. & Сабо, А. Одномакромолекулярный резонансный перенос энергии флуоресценции и профили свободной энергии. J. Phys. Chem. B 107 , 5058–5063 (2003).

    CAS Статья Google Scholar

  • 36

    Калинин, С., Фелекян, С., Валерий, А., Зайдель, К.А.М. Характеристика нескольких молекулярных состояний при детектировании многопараметрической флуоресценции одиночных молекул с помощью анализа распределения вероятностей. J. Phys. Chem. В 112 , 8361–8374 (2008).

    CAS Статья Google Scholar

  • 37

    Дейл, Р.E., Eisinger, J. & Blumberg, W.E. Ориентационная свобода молекулярных зондов. Фактор ориентации при внутримолекулярном переносе энергии. Biophys. J. 26 , 161–193 (1979).

    CAS Статья Google Scholar

  • 38

    Лысков, С. и Грей, Дж. Дж. Сервер RosettaDock для локального белок-белкового стыковки. Nucleic Acids Res. 36 , W233 – W238 (2008).

    CAS Статья Google Scholar

  • 39

    ван Дейк, М.И Бонвин, А. Расширяя пределы того, что достижимо в стыковке ДНК-белок: сравнительный анализ производительности HADDOCK. Nucleic Acids Res. 38 , 5634–5647 (2010).

    CAS Статья Google Scholar

  • 40

    Эфрон, Б. Обсуждение: складной нож, бутстрап и другие методы повторной выборки в регрессионном анализе. Ann. Стат. 14 , 1301–1304 (1986).

    Артикул Google Scholar

  • 41

    Брюнгер, А.T. Free R value: новая статистическая величина для оценки точности кристаллических структур. Природа 355 , 472–475 (1992).

    Артикул Google Scholar

  • 42

    Дело, Д.А. и другие. Программы биомолекулярного моделирования Amber. J. Comput. Chem. 26 , 1668–1688 (2005).

    CAS Статья Google Scholar

  • 43

    Хенцлер-Вильдман, К.И Керн, Д. Динамические личности белков. Природа 450 , 964–972 (2007).

    CAS PubMed Google Scholar

  • 44

    Токурики Н. и Тауфик Д.С. Динамизм и эволюционируемость белков. Наука 324 , 203–207 (2009).

    CAS Статья Google Scholar

  • 45

    Фелекян С., Калинин С., Санабрия Г., Валерий, А., Зайдель, C.A.M. Фильтрованная FCS: функции авто- и взаимной корреляции видов подчеркивают связывание и динамику биомолекул. ChemPhysChem 13 , 1036–1053 (2012).

    CAS Статья Google Scholar

  • 46

    Ротвелл, П.Дж. Структурные исследования ОТ ВИЧ-1 с использованием переноса энергии однопарной флуоресценции PhD диссертация, Univ. Дортмунд (2002).

  • 47

    Яйцо, C.и другие. Регистрация данных и выборочный анализ одиночных молекул с использованием многопараметрического детектирования флуоресценции. J. Biotechnol. 86 , 163–180 (2001).

    CAS Статья Google Scholar

  • 48

    Nir, E. et al. Гистограммы FRET одиночных молекул, ограниченные дробовым шумом: сравнение теории и экспериментов. J. Phys. Chem. B 110 , 22103–22124 (2006).

    CAS Статья Google Scholar

  • 49

    Santoso, Y., Торелла, Дж. П., Капанидис, А. Характеристика динамики FRET одной молекулы с анализом распределения вероятностей. ChemPhysChem 11 , 2209–2219 (2010).

  • Добавить комментарий

    Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *