2172 lada: Лада Приора хэтчбек или ВАЗ 2172 (2008 — 2015)

620026, г. Екатеринбург

Екатеринбург

620026, г. Екатеринбург

Лада 2172 Приора » Авто-реактор

Лада 2172 Приора / LADA 2172 Priora — стильный хэтчбек семейства LADA PRIORA.

Автомобиль Lada Priora 2172 создан с учетом современных международных стандартов и норм.  На дороге LADA 2172 демонстрирует высокие динамические показатели благодаря новому 16-ти клапанному двигателю рабочим объёмом 1,6 литра, а электронная система управления нового поколения обеспечивает не только выполнение норм токсичности Евро 3 и Евро 4, но и надёжный зимний пуск двигателя. Для хэтчбека Лада 2172 Приора применено заднее сиденье с поделенными на две части в соотношении 2:1 спинкой и подушкой, что допускает одновременную перевозку длинногабаритного багажа и двух или трех пассажиров. При раскладке заднего сиденья в грузовой вариант за передним рядом сидений образуется багажное отделение, позволяющее перевозить багаж с габаритными размерами. Абсолютно новой деталью интерьера LADA Priora стала облицовка тоннеля пола с центральным подлокотником, в котором скрывается небольшой бокс, имеется место для телефона и гнездо для его подключения. Впервые Лада Приора Хэтчбек была представлена в 2004 году на автосалоне в Москве.

Технические характеристики Лада Приора 2172

Кузов

Количество мест: 5
Количество дверей: 5
Тип кузова: Хэтчбек

Габариты

Длина, мм: 4210
Ширина, мм: 1680
Высота, мм: 1420
Колесная база, мм: 2492
Колея передних колес, мм: 1410
Колея задних колес, мм: 1380
Клиренс, мм: 165
Снаряженная масса, кг: 1088
Полная масса, кг: 1578
Объем багажника, л: 344
Объем топливного бака, л: 43

Двигатель

Расположение двигателя: Спереди поперечно
Объем двигателя, куб.см: 1596
Количество цилиндров: 4
Количество клапанов: 16
Система питания: Распределенный впрыск
Мощность, л.с.: 98
Крутящий момент, н*м при об/мин: 145/4000
Тип топлива: Бензин

Трансмиссия

Коробка передач: Механическая
Привод : Передний

Тормозная система

Передние тормоза: Дисковые вентилируемые
Задние тормоза: Барабанные

Рулевое управление

Усилитель руля: Электроусилитель

Эксплуатационные показатели

Максимальная скорость, км/ч.: 183
Время разгона (0-100 км/ч), c: 12
Расход топлива (городской цикл), л. на 100 км: 9.4
Расход топлива (смешанный цикл), л. на 100 км: 6.9
Расход топлива (загородный цикл), л. на 100 км: 5.5
Норма токсичности Euro: Euro III

Экстерьер

Передние противотуманные фары: есть

Безопасность

Подушка безопасности водителя: есть

Комфорт

Передние стеклоподъемники: есть
Регулируемая рулевая колонка: есть
ДУ багажником: есть

Интерьер

Аудио-видео
Аудиоподготовка: есть

Противоугонные системы
Центральный замок: есть
Иммобилайзер : есть

Колеса
Тип дисков: Стальные
Размер шин: 175/70 R14

Запись опубликована 23.11.2008 в 2:17 и размещена в разделе ВАЗ. Вы можете читать комментарии, используя RSS-ленту. Обсуждение закрыто, но Вы можете отправить трекбек с Вашего сайта.

ВАЗ 2172 — приора хэтчбек | Инфо-Ваз

В середине 2007 года завод АвтоВАЗ запустил в массовую продажу серию автомобилей «Приора». И, конечно же, не трудно догадаться, что «Приора» — это не что иное, как всем нам знакомая «десятка», «двенашка», но в более современном виде и с улучшенными техническими характеристиками. И даже сами руководители концерна не скрывают тот факт, что это действительно некий рестайлинг предыдущих моделей. Итак, предлагаю сделать некий обзор Ваз 2172 и посмотреть, насколько сильно или наоборот она отличается от своей предшественницы Ваз 2112.

Внешний вид по сравнению с «двенашкой» стал современным и интересным. И уже ничего в этом автомобиле не напоминает СССР и другие «старые» времена. Что ж, это плюс в карман, условно говоря, АвтоВАЗу. Также хочется отметить внутренний дизайн Ваз 2172. Он намного лучше, чем у Приоры седан, и выполнен он более качественно и практично. Передняя панель вылощена автомобильным пластиковым материалом, который мягкий на ощупь, что вызывает у пассажиров и водителя приятные ощущения. Кстати говоря, в салоне из-за этого стало еще тише, чем на предыдущих моделях. Но не все так безоблачно, как кажется. До сих пор ни на одной модели «Приоры», в том числе и Ваз 2172 хэтчбек нет заводской аудиосистемы. Место под нее сделано отлично, а вот самой «музыки» нет, очень жаль. Приборы управления и всякие кнопочки, находятся в поле досягаемости и легко нажимаются, но вот руль. Не то, чтобы совсем плохо, можно сказать, что особой радости не приносит. Но, как говорится, время лечит.

Положительными качествами стоит отметить электроусилитель руля. При поворотах или при любых вращениях руля, вы не столкнетесь с какими – либо трудностями, все легко и просто вертится и поворачивается (поверьте на слово). К плюсам Ваз 2172 можно отнести то, что уже в заводской, стандартной (базовой) комплектации есть подушка безопасности. Кстати чуть позже появилась обновленная версия, где аж две подушки безопасности. Одна у водителя, а другая у пассажира. В новой версии есть система АБС и усовершенствованные ремни безопасности. Ну, а совсем в новых версиях Ваз 2172 есть кондиционер, те самые диски (литые), парктроник и куча новых «прибомбасов». Вот такой вот автомобиль «лада приора хэтчбэк». Но все же стоит заметить, что, несмотря на некоторые недочеты, модельки наши все лучше и лучше.

Поделиться в соц. сетях:

Lada 2172 Priora/Лада 2172 Приора. Краткий обзор, цены, характеристики ВАЗ 2172.

Lada 2172 Priora хэтчбек. Краткий обзор и цены.

Lada 2172 Priora/Лада 2172 Приора является второй моделью семейства Лада Приора, которая воплощена в кузове хэтчбек.

Cборка пилотной партии пятидверных хэтчбеков Lada 2172 Priora началась еще 24 сентября 2007 года. На автомобилях пилотной партии отрабатывалась технология сборки и были опробованы новые для семейства Lada Priora опции.

Это противотуманные фары, обогрев сидений, подуша безопасности переднего пассажира, антиблокировочная система тормозов и другое дополнительное оборудование.

Стильный и солидный автомобиль создан с учетом современных и перспективных российских и международных стандартов и норм. Линии кузова отличаются геометрической четкостью, что придает автомобилю впечатление легкости и стремительности.

Хэтчбек, получивший имидж молодежного автомобиля, помимо стильной внешности приобрел черты спортивности, напористости и энергичности.
Lada Priora соответствует современным европейским требованиям безопасности по защите пассажиров при фронтальном и боковом ударе.

Защиту обеспечивают ремни безопасности для каждого пассажира, штатная подушка безопасности водителя, усиленные пороги пола, боковые стойки, крыша с дополнительным усилителем, стальные брусья безопасности дверей.

В конструкции обивок дверей впервые введены элементы обеспечения безопасности водителя и пассажира переднего сиденья при боковом ударе — специальные демпфирующие вставки, снижающие сосредоточенную нагрузку на тело человека.

Полностью новый салон, разработанный совместно с известной итальянской фирмой «АЕ», поднимает комфорт российской машины до уровня, ранее доступного только иномаркам. Для Лады 2172 Приора применено заднее сиденье с поделенными на две части в соотношении 2:1 спинкой и подушкой, что допускает одновременную перевозку длинногабаритного багажа и двух или трех пассажиров.

При раскладке заднего сиденья в грузовой вариант за передним рядом сидений образуется багажное отделение, позволяющее перевозить багаж с габаритными размерами. Эффективная вентиляция и мощный отопитель со встроенным фильтром очистки воздуха поддерживают в салоне авто приятный микроклимат.

Тщательная эргономическая проработка с подбором аэроклиматических характеристик по направлению и дозированию холодных и теплых потоков воздуха гарантируют высокий уровень комфорта водителя и пассажиров.

Характеристики Лада Приора 2172

Двигатель Лада Приора 2172. Описание

Фото двигателя Лада Приора 2172

Главная ->>> Модельный ряд ВАЗ ->>> Лада Приора 2172

расшифровок самых популярных подкастов | Инвентаризация — Page 2172

• • 2170
  • 2171
  • 2172 (текущий)
  • 2172 (нынешний)
  • 2173
  • 2174
  • следующие

• Нет оправданий до более здорового вы с Jonathan Roche

  без честного ловли

  Никаких жирных зажимов!!!

  No Filter Radio

  NO FIM DO Universoo

  Нет бесплатных поездок

  No Flills — Sydney Drum & Bass

  No Timimics Не требуется борьба подкапс

  Человек чат подкаст

  без богов, нет мастеров

  без большой волшебницы Leiber, FRITZ

  Нет большей любви

  без гарантии

  NO HI HA QUI T’AGUANTI

  НЕТ ДЕРЖАНЫ ЗАРЯДНЫЕ С EDDIE Goldman

  No Fresh

  No Jibba-Jabba FM

  Нет короля Но Иисуса Podcast

  Без уровней Cap Radio

  без ограничений SECU

  Без ограничений

  Без ограничений 2.0

  Нет ограничений Podcast

  Нет жизни Levers

  Нет любви, без драконов

  • предыдущих
  • 2170
  • 2171
  • 2172 (текущий)
  • 2173
  • 2174
  • Далее

  Передача сигналов рецептора, связанного с Galphas, активно подавляет аффинность α4β1-интегрина: возможный механизм клеточной деадгезии | BMC Immunology

• Hynes RO: Интегрины: двунаправленные аллостерические сигнальные машины.Клетка. 2002, 110: 673-687. 10.1016/S0092-8674(02)00971-6.

  КАС Статья пабмед Google ученый

• Cai W, Chen X: Антиангиогенная терапия рака, основанная на антагонизме интегрина альфаvбета3. Противораковые агенты Med Chem. 2006, 6: 407-428. 10.2174/187152006778226530.

  КАС Статья пабмед Google ученый

• De Meyer SF, Vanhoorelbeke K, Ulrichts H, Staelens S, Feys HB, Salles I, Fontayne A, Deckmyn H: Разработка моноклональных антител, которые ингибируют адгезию или агрегацию тромбоцитов в качестве потенциальных антитромботических препаратов.Сердечно-сосудистые мишени для лечения гематолового расстройства. 2006, 6: 191-207. 10.2174/187152

  8249536.

  КАС Статья пабмед Google ученый

• Hilden TJ, Nurmi SM, Fagerholm SC, Gahmberg CG: Препятствование активации лейкоцитарного интегрина — новая концепция в разработке противовоспалительных препаратов. Энн Мед. 2006, 38: 503-511. 10.1080/078538

  969130.

  КАС Статья пабмед Google ученый

• О’Коннор П.: Натализумаб и роль антагонизма альфа-4-интегрина в лечении рассеянного склероза.Мнение Эксперта Биол Тер. 2007, 7: 123-136. 10.1517/14712598.7.1.123.

  Артикул пабмед Google ученый

• Чигаев А., Бленк А.М., Браатен Дж.В., Кумарасвами Н., Кепли К.Л., Эндрюс Р.П., Оливер Дж.М., Эдвардс Б.С., Просниц Э.Р., Ларсон Р.С., Скляр Л.А.: Анализ аффинной регуляции альфа-4-интегрина в режиме реального времени. Физиологически активированный рецептор занимает промежуточное положение по сродству между состоянием покоя и активацией Mn(2+) или антителом. Дж. Биол. Хим.2001, 276: 48670-48678. 10.1074/jbc.M103194200.

  КАС Статья пабмед Google ученый

• Gazitt Y: Самонаведение и мобилизация гемопоэтических стволовых клеток и гемопоэтических раковых клеток являются процессами зеркального отражения, использующими сходные сигнальные пути и происходящими одновременно: циркулирующие раковые клетки представляют собой идеальную мишень для одновременного лечения химиотерапией и антилинейно-специфическими антителами. Лейкемия.2004, 18: 1-10. 10.1038/sj.leu.2403173.

  КАС Статья пабмед Google ученый

• Lapidot T, Petit I: Современное понимание мобилизации стволовых клеток: роли хемокинов, протеолитических ферментов, молекул адгезии, цитокинов и стромальных клеток. эксп Гематол. 2002, 30: 973-981. 10.1016/S0301-472X(02)00883-4.

  КАС Статья пабмед Google ученый

• Feigelson SW, Grabovsky V, Winter E, Chen LL, Pepinsky RB, Yednock T, Yablonski D, Lobb R, Alon R: Киназа Src p56(lck) повышает аффинность интегрина VLA-4.Последствия быстрой спонтанной и вызванной хемокинами адгезии Т-клеток к VCAM-1 и фибронектину. Дж. Биол. Хим. 2001, 276: 13891-13901.

  КАС пабмед Google ученый

• Чен Л.Л., Уитти А., Лобб Р.Р., Адамс С.П., Пепински Р.Б.: Множественные состояния активации интегрина альфа4бета1, обнаруженные благодаря их различному сродству к низкомолекулярным лигандам. Дж. Биол. Хим. 1999, 274: 13167-13175. 10.1074/jbc.274.19.13167.

  КАС Статья пабмед Google ученый

• Laudanna C, Kim JY, Constantin G, Butcher E: Быстрая активация лейкоцитарного интегрина хемокинами.Immunol Rev. 2002, 186: 37-46. 10.1034/j.1600-065X.2002.18604.x.

  КАС Статья пабмед Google ученый

• Беглова Н., Блэклоу С.К., Такаги Дж., Спрингер Т.А.: Богатая цистеином модульная структура обнаруживает точку опоры для перестройки интегрина при активации. Nat Struct Biol. 2002, 9: 282-287. 10.1038/нсб779.

  КАС Статья пабмед Google ученый

• Лауданна К., Алон Р.: Прямо на месте.Хемокин запускает опосредованную интегрином остановку циркулирующих лейкоцитов. Тромб Хемост. 2006, 95: 5-11.

  КАС пабмед Google ученый

• Такаги Дж., Петре Б.М., Уолц Т., Спрингер Т.А.: Глобальные конформационные перестройки во внеклеточных доменах интегрина при передаче сигналов снаружи внутрь и изнутри наружу. Клетка. 2002, 110: 599-11. 10.1016/S0092-8674(02)00935-2.

  КАС Статья пабмед Google ученый

• Garcia A, Serrano A, Abril E, Jimenez P, Real LM, Canton J, Garrido F, Ruiz-Cabello F: Дифференциальное влияние на дифференцировку клеток U937 путем нацеливания на транскрипционные факторы, участвующие в ткане- или стадийно-специфическом индуцированном интегрине выражение.эксп Гематол. 1999, 27: 353-364. 10.1016/S0301-472X(98)00038-1.

  КАС Статья пабмед Google ученый

• Чигаев А., Цварц Г., Грейвс С.В., Дуайер Д.К., Цуджи Х., Футц Т.Д., Эдвардс Б.С., Проснитц Э.Р., Ларсон Р.С., Скляр Л.А.: изменения сродства интегрина альфа4бета1 регулируют клеточную адгезию. Дж. Биол. Хим. 2003, 278: 38174-38182. 10.1074/jbc.M210472200.

  КАС Статья пабмед Google ученый

• Зварц Г., Чигаев А., Футц Т., Ларсон Р.С., Познер Р., Скляр Л.А. Взаимосвязь между скоростями молекулярной и клеточной диссоциации для взаимодействия VLA-4/VCAM-1 в отсутствие напряжения сдвига.Биофиз Дж. 2004, 86: 1243-1252.

  Центральный пабмед КАС Статья пабмед Google ученый

• Чигаев А., Буранда Т., Двайер Д.К., Проснитц Э.Р., Скляр Л.А.: Обнаружение FRET конформационной активации клеточного альфа4-интегрина. Биофиз Дж. 2003, 85: 3951-3962.

  Центральный пабмед КАС Статья пабмед Google ученый

• Чигаев А., Зварц Г.Дж., Буранда Т., Эдвардс Б.С., Проснитц Э.Р., Скляр Л.А.: Конформационная регуляция сродства альфа-4-бета-1-интегрина восстановителями.Передача сигналов «наизнанку» не зависит от редукционно-регулируемой активации интегрина и дополняет ее. Дж. Биол. Хим. 2004, 279: 32435-32443. 10.1074/jbc.M404387200.

  КАС Статья пабмед Google ученый

• Чигаев А., Уоллер А., Цварц Г.Дж., Буранда Т., Скляр Л.А. Регуляция клеточной адгезии за счет аффинности и конформационного изгиба интегрина альфа4бета1. Дж Иммунол. 2007, 178: 6828-6839.

  КАС Статья пабмед Google ученый

• Ларсон Р.С., Дэвис Т., Болога С., Семенюк Г., Виджаян С., Ли Ю., Опря Т., Чигаев А., Буранда Т., Вагнер Ц.Р., Скляр Л.А.: диссоциация домена I и глобальные конформационные изменения в LFA-1: уточнение взаимосвязей между структурой и активностью домена малой молекулы-I.Биохимия. 2005, 44: 4322-4331. 10.1021/bi048187k.

  КАС Статья пабмед Google ученый

• Tecoma ES, Motulsky HJ, Traynor AE, Omann GM, Muller H, Sklar LA: Переходная катехоламиновая модуляция активации нейтрофилов: кинетические и внутриклеточные аспекты действия изопротеренола. Дж. Лейкок Биол. 1986, 40: 629-644.

  КАС пабмед Google ученый

• Hughes SA, Gibson WJ, Young JM: Взаимодействие U-73122 с гистаминовым рецептором h2: значение для использования U-73122 в определении сигнальных путей, связанных с рецептором h2.Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 2000, 362: 555-558. 10.1007/s002100000326.

  КАС Статья пабмед Google ученый

• Liggett SB: Бета-адренорецептор-эффекторная система макрофагов человека линии клеток U937. Евр Дж Фармакол. 1989, 163: 171-174. 10.1016/0014-2999(89)

  -7.

  КАС Статья пабмед Google ученый

• Shayo C, Davio C, Brodsky A, Mladovan AG, Legnazzi BL, Rivera E, Baldi A: Гистамин модулирует экспрессию c-fos посредством продукции циклического AMP через рецептор h3 в промоноцитарной клеточной линии человека U937.Мол Фармакол. 1997, 51: 983-990.

  КАС пабмед Google ученый

• van der GH, Timmerman H: Избирательные лиганды как инструменты для изучения гистаминовых рецепторов. Eur J Med Chem. 2000, 35: 5-20. 10.1016/S0223-5234(00)00101-Х.

  Артикул Google ученый

• Чжан Л., Дженсен Р.Т., Матон П.Н.: Характеристика бета-адренорецепторов на гладкомышечных клетках желудка морской свинки.Am J Physiol. 1990, 259: G436-G442.

  КАС пабмед Google ученый

• Скляр Л.А., Оманн Г.М., Пейнтер Р.Г.: Связь полимеризации и деполимеризации актина с рассеянием света в нейтрофилах человека: зависимость от занятости рецепторов и внутриклеточного Ca++. Джей Селл Биол. 1985, 101: 1161-1166. 10.1083/jcb.101.3.1161.

  КАС Статья пабмед Google ученый

• Torphy TJ, Zhou HL, Cieslinski LB: Стимуляция бета-адренорецепторов в клеточной линии моноцитов человека (U937) повышает активность циклической AMP-специфической фосфодиэстеразы.J Pharmacol Exp Ther. 1992, 263: 1195-1205.

  КАС пабмед Google ученый

• Салас А., Симаока М., Коган А.Н., Харвуд С., фон Андриан У.Х., Спрингер Т.А.: Прокатная адгезия за счет расширенной конформации интегрина альфаLбета2 и связь с альфа-I и бета-I-подобным взаимодействием доменов. Иммунитет. 2004, 20: 393-406. 10.1016/S1074-7613(04)00082-2.

  КАС Статья пабмед Google ученый

• Чан Дж. Р., Хайдук С. Дж., Цыбульский М. И.: Обнаружение быстрого и временного усиления аффинности лейкоцитарного интегрина, вызванного хемокинами и хемоаттрактантами.Дж Иммунол Методы. 2003, 273: 43-52. 10.1016/S0022-1759(02)00417-9.

  КАС Статья пабмед Google ученый

• Лин К., Атик Х.С., Сюн С.Х., Чонг Л.Т., Циммерман К.Н., Кастро А., Ли В.К., Хаммонд К.Э., Калкунте С., Чен Л.Л., Пепински Р.Б., Леоне Д.Р., Спраг А.Г., Абрахам В.М., Гилл А., Лобб RR, Adams SP: селективные ингибиторы интегрина альфа4бета1 с плотным связыванием, которые ингибируют аллергические реакции дыхательных путей. J Med Chem. 1999, 42: 920-934.10.1021/jm980673г.

  КАС Статья пабмед Google ученый

• Prossnitz ER: Десенсибилизация опосредованной рецептором N-формилпептида активации зависит от фосфорилирования рецептора. Дж. Биол. Хим. 1997, 272: 15213-15219. 10.1074/jbc.272.24.15213.

  КАС Статья пабмед Google ученый

• Takagi J, Springer TA: Активация интегрина и структурная перестройка.Immunol Rev. 2002, 186: 141-163. 10.1034/j.1600-065X.2002.18613.x.

  КАС Статья пабмед Google ученый

• Bos JL, de Bruyn K, Enserink J, Kuiperij B, Rangarajan S, Rehmann H, Riedl J, de Rooij J, van Mansfeld F, Zwartkruis F: Роль Rap1 в интегрин-опосредованной клеточной адгезии. Биохим Сок Транс. 2003, 31: 83-86.

  КАС Статья пабмед Google ученый

• Палм Д., Ланг К., Ниггеманн Б., Дрелл Т.Л., Мазур К., Заенкер К.С., Энтшладен Ф.: Индуцированное норэпинефрином метастазирование клеток рака предстательной железы человека PC-3 у голых мышей BALB/c ингибируется бета- блокираторы.Инт Джей Рак. 2006, 118: 2744-2749. 10.1002/ijc.21723.

  КАС Статья пабмед Google ученый

• Дрелл Т.Л., Джозеф Дж., Ланг К., Ниггеманн Б., Заенкер К.С., Энтшладен Ф. Влияние нейротрансмиттеров на хемокинез и хемотаксис клеток карциномы молочной железы человека MDA-MB-468. Лечение рака молочной железы. 2003, 80: 63-70. 10.1023/А:10244366.

  КАС Статья пабмед Google ученый

• Ланг К., Дрелл Т.Л., Линдеке А., Ниггеманн Б., Кальчмидт С., Заенкер К.С., Энтшладен Ф.: Индукция метастатогенного типа опухолевых клеток нейротрансмиттерами и ее фармакологическое ингибирование известными препаратами.Инт Джей Рак. 2004, 112: 231-238. 10.1002/ijc.20410.

  КАС Статья пабмед Google ученый

• Masur K, Niggemann B, Zanker KS, Entschladen F: индуцированная норадреналином миграция клеток карциномы толстой кишки SW 480 подавляется бета-блокаторами. Рак рез. 2001, 61: 2866-2869.

  КАС пабмед Google ученый

• Fogler WE, Volker K, McCormick KL, Watanabe M, Ortaldo JR, Wiltrout RH: инфильтрация NK-клеток в легкие, печень и подкожную меланому B16 опосредована взаимодействием VCAM-1/VLA-4.Дж Иммунол. 1996, 156: 4707-4714.

  КАС пабмед Google ученый

• Роуз Д.М., Кардарелли П.М., Кобб Р.Р., Гинзберг М.Х.: Связывание растворимого VCAM-1 с интегринами альфа4 специфично для клеточного типа и зависит от активации и нарушается во время апоптоза в Т-клетках. Кровь. 2000, 95: 602-609.

  КАС пабмед Google ученый

• Hyduk SJ, Oh J, Xiao H, Chen M, Cybulsky MI: Паксилин избирательно связывается с конститутивными и индуцированными хемоаттрактантами высокоаффинными интегринами альфа4бета1: значение для передачи сигналов интегрина.Кровь. 2004, 104: 2818-2824. 10.1182/кровь-2003-12-4402.

  КАС Статья пабмед Google ученый

• Шахар Г., Бен Элиягу С.: Бета-адренергическая стимуляция in vivo подавляет активность естественных киллеров и снижает устойчивость к метастазированию опухоли у крыс. Дж Иммунол. 1998, 160: 3251-3258.

  КАС пабмед Google ученый

• Benschop RJ, Nijkamp FP, Ballieux RE, Heijnen CJ: Влияние стимуляции бета-адренорецепторов на адгезию естественных клеток-киллеров человека к культивируемому эндотелию.Бр Дж. Фармакол. 1994, 113: 1311-1316.

  Центральный пабмед КАС Статья пабмед Google ученый

• Schedlowski M, Hosch W, Oberbeck R, Benschop RJ, Jacobs R, Raab HR, Schmidt RE: Катехоламины модулируют циркуляцию и функцию NK-клеток человека через независимые от селезенки бета-2-адренергические механизмы. Дж Иммунол. 1996, 156: 93-99.

  КАС пабмед Google ученый

• Ben Eliyahu S, Shakhar G, Page GG, Stefanski V, Shakhar K: Подавление активности NK-клеток и устойчивости к метастазированию при стрессе: роль надпочечниковых катехоламинов и бета-адренорецепторов.Нейроиммуномодуляция. 2000, 8: 154-164. 10.1159/000054276.

  КАС Статья пабмед Google ученый

• Kunkel EJ, Butcher EC: Хемокины и тканеспецифическая миграция лимфоцитов. Иммунитет. 2002, 16: 1-4. 10.1016/С1074-7613(01)00261-8.

  КАС Статья пабмед Google ученый

• Springer TA: Сигналы светофора для рециркуляции лимфоцитов и эмиграции лейкоцитов: многоступенчатая парадигма.Клетка. 1994, 76: 301-314. 10.1016/0092-8674(94)

  -9.

  КАС Статья пабмед Google ученый

• Weber C: Новые механистические концепции контроля трансмиграции лейкоцитов: специализация интегринов, хемокинов и соединительных молекул. Дж. Мол Мед. 2003, 81: 4-19.

  КАС пабмед Google ученый

• Hofstra CL, Desai PJ, Thurmond RL, Fung-Leung WP: Рецептор гистамина h5 опосредует хемотаксис и мобилизацию кальция тучными клетками.J Pharmacol Exp Ther. 2003, 305: 1212-1221. 10.1124/жпет.102.046581.

  КАС Статья пабмед Google ученый

• Mirossay L, Chastre E, Callebert J, Launay JM, Housset B, Zimber A, Abita JP, Gespach C: Рецепторы гистамина h3 и гистидиндекарбоксилаза в нормальных и лейкозных моноцитах и ​​макрофагах человека. Am J Physiol. 1994, 267: R602-R611.

  КАС пабмед Google ученый

• Sachs B, Hertl M, Merk HF: Рецепторы гистамина на лимфоцитах: распределение и функциональное значение.Skin Pharmacol Appl Skin Physiol. 2000, 13: 313-323. 10.1159/000029939.

  КАС Статья пабмед Google ученый

• Смит М.Дж., Леурс Р., Шукрула С.Р., Баст А., Тиммерман Х.: Быстрая десенсибилизация рецептора гистамина h3 на моноцитарной клеточной линии человека U937. Евр Дж Фармакол. 1994, 288: 17-25. 10.1016/0922-4106(94)

• -1.

  КАС Статья пабмед Google ученый

• Kew RR, Peng T, DiMartino SJ, Madhavan D, Weinman SJ, Cheng D, Prossnitz ER: Недифференцированные клетки U937, трансфицированные хемоаттрактантными рецепторами: модельная система для исследования хемотаксических механизмов и взаимоотношений структуры и функции рецепторов.Дж. Лейкок Биол. 1997, 61: 329-337.

  КАС пабмед Google ученый

• Booze RM, Crisostomo EA, Davis JN: Видовые различия в локализации и количестве бета-адренергических рецепторов ЦНС: крыса против морской свинки. J Pharmacol Exp Ther. 1989, 249: 911-920.

  КАС пабмед Google ученый

• Ezeamuzie CI, Philips E: Рецепторы гистамина H(2) опосредуют ингибирующее действие гистамина на дегрануляцию эозинофилов человека.Бр Дж. Фармакол. 2000, 131: 482-488. 10.1038/sj.bjp.0703556.

  Центральный пабмед КАС Статья пабмед Google ученый

• Foreman JC, Norris DB, Rising TJ, Webber SE: Исследование h3-рецептора гистамина, стимулирующего аденилатциклазу, в гомогенатах паренхимы легких морской свинки. Бр Дж. Фармакол. 1986, 87: 37-44.

  Центральный пабмед КАС Статья пабмед Google ученый

• Freer RJ, Day AR, Muthukumaraswamy N, Pinon D, Wu A, Showell HJ, Becker EL: Формилпептидные хемоаттрактанты: модель рецептора на нейтрофилах кролика.Биохимия. 1982, 21: 257-263. 10.1021/bi00531a009.

  КАС Статья пабмед Google ученый

• Green SA, Cole G, Jacinto M, Innis M, Liggett SB: полиморфизм человеческого бета-2-адренергического рецептора в пределах четвертого трансмембранного домена изменяет связывание лиганда и функциональные свойства рецептора. Дж. Биол. Хим. 1993, 268: 23116-23121.

  КАС пабмед Google ученый

• Ueda H, Siani MA, Gong W, Thompson DA, Brown GG, Wang JM: Химически синтезированный аналог SDF-1альфа, N33A, является мощным хемотаксическим агентом для CXCR4/Fusin/LESTR-экспрессирующих лейкоцитов человека.Дж. Биол. Хим. 1997, 272: 24966-24970. 10.1074/jbc.272.40.24966.

  КАС Статья пабмед Google ученый

• Hsu MH, Chiang SC, Ye RD, Prossnitz ER: Фосфорилирование рецептора N-формилового пептида необходимо для интернализации рецептора, но не для хемотаксиса. Дж. Биол. Хим. 1997, 272: 29426-29429. 10.1074/jbc.272.47.29426.

  КАС Статья пабмед Google ученый

• Эдвардс Б.С., Кукук Ф.В., Проснитц Э.Р., Окун А., Рэнсом Дж.Т., Склар Л.А.: Цитометрия с поршневым потоком расширяет аналитические возможности в области клеточной адгезии и фармакологии рецепторов.Цитометрия. 2001, 43: 211-216. 10.1002/1097-0320(20010301)43:3<211::AID-CYTO1052>3.0.CO;2-3.

  КАС Статья пабмед Google ученый

Произошла ошибка при настройке пользовательского файла cookie

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности. Если ваш браузер не принимает файлы cookie, вы не можете просматривать этот сайт.

---

Настройка браузера на прием файлов cookie

Существует множество причин, по которым файл cookie не может быть установлен правильно.Ниже приведены наиболее распространенные причины:

• В вашем браузере отключены файлы cookie. Вам необходимо сбросить настройки браузера, чтобы принять файлы cookie, или спросить вас, хотите ли вы принимать файлы cookie.
• Ваш браузер спрашивает, хотите ли вы принимать файлы cookie, и вы отказались. Чтобы принять файлы cookie с этого сайта, нажмите кнопку «Назад» и примите файл cookie.
• Ваш браузер не поддерживает файлы cookie. Попробуйте другой браузер, если вы подозреваете это.
• Дата на вашем компьютере в прошлом.Если часы вашего компьютера показывают дату до 1 января 1970 г., браузер автоматически забудет файл cookie. Чтобы это исправить, установите правильное время и дату на своем компьютере.
• Вы установили приложение, которое отслеживает или блокирует установку файлов cookie. Вы должны отключить приложение при входе в систему или проконсультироваться с системным администратором.

---

Почему этому сайту требуются файлы cookie?

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности, запоминая, что вы вошли в систему, когда переходите со страницы на страницу.Предоставить доступ без файлов cookie потребует от сайта создания нового сеанса для каждой посещаемой вами страницы, что замедляет работу системы до неприемлемого уровня.

---

Что сохраняется в файле cookie?

Этот сайт не хранит ничего, кроме автоматически сгенерированного идентификатора сеанса в файле cookie; никакая другая информация не фиксируется.

Как правило, в файле cookie может храниться только та информация, которую вы предоставляете, или выбор, который вы делаете при посещении веб-сайта.Например, сайт не может определить ваше имя электронной почты, если вы не решите ввести его. Разрешение веб-сайту создавать файлы cookie не дает этому или любому другому сайту доступ к остальной части вашего компьютера, и только сайт, создавший файл cookie, может его прочитать.

Передача сигналов рецептора, связанного с Galphas, активно подавляет сродство альфа4бета1-интегрина: возможный механизм деадгезии клеток

Рисунок 2

Связывание и диссоциация…

Рисунок 2

Связывание и диссоциация зонда LDV-FITC в ответ на Gα _s -coupled…

фигура 2

Связывание и диссоциация зонда LDV-FITC в ответ на Gα _s -связанные агонисты и антагонисты рецептора .A, B, эффект антагонистов Gα _s -связанных рецепторов. Клетки U937, стабильно трансфицированные недесенсибилизирующим мутантом FPR, последовательно обрабатывали зондом LDV-FITC (4 нМ, ниже насыщения), fMLFF (100 нМ) и A, амтамином (500 нМ), тиотодином (10 мкМ), или B, изопротеренол (1 нМ), ICI-118,551 (10 мкМ). B, Дополнительный контрольный образец обрабатывали той же концентрацией LDV-FITC, fMLFF и ICI-118,551 без добавления изопротеренола, чтобы показать эффект антагониста рецептора, связанного с Gα _s , без добавления агониста.Значение MCF, соответствующее автофлуоресценции клеток, указано горизонтальной стрелкой. Данные представлены в виде зависимости MCF от времени. Показан один репрезентативный эксперимент из трех экспериментов. C, D, кинетический анализ связывания и диссоциации зонда LDV-FITC на клетках U937, стабильно трансфицированных недесенсибилизирующим мутантом FPR. Клетки последовательно обрабатывали зондом LDV-FITC (25 нМ, почти насыщение), лигандом рецептора, связанным с Gα _i (fMLFF, 100 нМ), лигандом рецептора, связанным с Gα _s , C, амтамином (500 нМ), или D, изопротеренол (100 нМ).В моменты времени, указанные стрелками, клетки обрабатывали избытком немеченого LDV, содержащего малую молекулу (2 мкМ), и следили за диссоциацией флуоресцентной молекулы. Константы скорости диссоциации (k _от ) были получены путем подгонки кривых диссоциации к одному уравнению экспоненциального распада (как описано в тексте). Эксперименты, показанные на разных панелях, проводились с использованием разных инструментов, поэтому значения MCF не идентичны.

Стехиометрия регуляторного комплекса сплайсинга, выявленная при анализе одиночных молекул

EMBO J.7 июля 2010 г .; 29(13): 2161–2172.

Дмитрий Черный

^{1 1} Департамент биохимии, Университет Лестера, Лестера, Великобритата

Клэр Гудинг

² Департамент биохимии, Университет Кембридж, Кембридж, Великобритания

Giles E Eperon

¹ Кафедра биохимии, Университет Лестера, Лестер, Великобритания

Мигель Б. Коэльо

² Кафедра биохимии, Кембриджский университет, Кембридж, Великобритания

Клайв Р. Бэгшоу

¹ Факультет биохимии, Университет Лестера, Leicester, UK

Christopher WJ Smith

² Кафедра биохимии, Кембриджский университет, Кембридж, UK

Ian C Eperon

¹ Факультет биохимии, Университет Лестера, Leicester, 9057 7 9057

1
1 Кафедра биохимии, Лестерский университет, Лестер, Великобритания

² Кафедра биохимии, Кембриджский университет, Кембридж, Великобритания

^a Факультет биохимии, Лестерский университет, здание Генри Велкома, Ланкастер-роуд, Лестер LE1 9HN, Великобритания.Тел.: +44 116 229 7012; Факс: +44 116 229 7018; Электронная почта: [email protected]

Поступила в редакцию 4 сентября 2009 г.; Принято 5 мая 2010 г.

Copyright © 2010, Европейская организация молекулярной биологии

статью, а затем распространять полученную работу под той же или аналогичной лицензией, что и эта. Произведение должно быть отнесено к первоначальному автору, и коммерческое использование не допускается без специального разрешения.

Эта статья была процитирована другими статьями в PMC.

Дополнительные материалы

Дополнительные цифры S1 и S2

GUID: 9418B931-19F8-43A3-9213-2FE738E7B723

Обзор процесса файла

GUID: 00C4F8C8-77DB-4C69-B5AB-BFCDF3DDE158

Абстрактный Сплайсинг регулируется сложными взаимодействиями многочисленных РНК-связывающих белков. Вовлеченные молекулярные механизмы остаются неясными, в значительной степени из-за незнания количества белков в регуляторных комплексах.Белок, связывающий полипиримидиновые пути (PTB), который регулирует тканеспецифический сплайсинг, репрессирует экзон 3 α-тропомиозина через отдаленные пиримидиновые пути во фланкирующих интронах. Текущие модели репрессии включают либо образование петель, опосредованное PTB, либо распространение комплексов между трактами. Чтобы проверить эти модели, мы использовали подходы с одной молекулой для подсчета количества связанных молекул PTB как путем подсчета количества стадий отбеливания молекул GFP, связанных с PTB в комплексах, так и путем анализа их общего выделения.Оба подхода показали, что собирается пять или шесть молекул PTB. Учитывая доменные структуры, это предполагает, что молекулы занимают преимущественно множественные перекрывающиеся потенциальные сайты в полипиримидиновых трактах, исключая модели распространения. В качестве альтернативы прямому образованию петель мы предполагаем, что репрессия включает многостадийный процесс, в котором связывание PTB образует небольшие локальные петли, создавая платформу для рекрутирования др. белков, которые сближают эти петли.

Ключевые слова: альтернативный сплайсинг, белок, связывающий полипиримидиновый тракт, репрессия, одиночная молекула, стехиометрия

Введение

Масштабы альтернативного сплайсинга захватывают дух.На основе высокопроизводительного секвенирования мРНК было подсчитано, что у человека существует около 100 000 значимых событий альтернативного сплайсинга, происходящих примерно из 90% мультиэкзонных генов; это соответствует в среднем семи событиям на мультиэкзонный ген (Pan et al, 2008; Wang et al, 2008). Фактическое количество альтернативных изоформ мРНК зависит от комбинаций, производимых каждым геном, но это число может превышать миллион. Несмотря на такие огромные цифры, кажется, что альтернативный сплайсинг не является результатом ошибок (Pan et al, 2008) и что частота ошибок при сплайсинге настолько низка, что любые ошибки могут быть в значительной степени результатом неправильного включения во время транскрипции (Fox- Уолш и Хертель, 2009).

Многие, возможно, большинство событий альтернативного сплайсинга представлены более обильно в определенных тканях (Castle et al, 2008; Wang et al, 2008). Интроны, фланкирующие тканеспецифические экзоны, обогащены рядом мотивов последовательностей, наиболее распространенные из которых содержат UCUCU (Castle et al, 2008; Wang et al, 2008). Это распознается как сайт или частичный сайт связывания белка, связывающего полипиримидиновый тракт (PTB) (Chan and Black, 1995, 1997). PTB был охарактеризован как PTB (Garcia-Blanco et al, 1989), а затем идентифицирован как возможный репрессор экзона, специфичного для мышц (Mulligan et al, 1992).Впоследствии было показано, что он регулирует экспрессию ряда изоформ мРНК, особенно некоторых, специфичных для нервной и мышечной ткани (Grabowski and Black, 2001; Black and Grabowski, 2003; Boutz et al, 2007; Spellman et al, 2007; Venables). и др., 2008). Поскольку уровень включения экзонов с близлежащими интронными мотивами UCUCU обратно коррелирует между тканями с обилием PTB (Castle et al, 2008), репрессия с помощью PTB, по-видимому, является широко распространенным и важным вкладом в экспрессию тканеспецифических генов.Действительно, полногеномный анализ ассоциации PTB-РНК предполагает, что PTB связан с транскриптами более чем 40% аннотированных генов человека (Xue et al, 2009).

PTB имеет четыре РНК-связывающих домена типа RRM с гибкими линкерами после доменов 1 и 2 (Петоухов и др., 2006). Существует три изоформы PTB, которые отличаются длиной линкера между RRM 2 и 3. PTB4 имеет самый длинный линкер и является наиболее эффективным репрессором экзона 3 Tpm1 (Wollerton et al, 2001).Индивидуальные RRM связывают РНК с низким сродством и слабой специфичностью в отношении коротких пиримидиновых путей (Oberstrass et al, 2005). Структурный анализ отдельных RRM и RRM 3 и 4 вместе позволяет предположить, что первые три RRM могут связывать последовательную последовательность из не менее 15 нуклеотидов, но четвертому RRM потребуются связывающие последовательности перед связыванием с коротким пиримидиновым трактом (Oberstrass et al., 2005; Ламичане и др., 2010). Напротив, размер закрытого сайта связывания на поли(U) для интактного белка был оценен в 5 нт (Perez et al., 1997).В ходе селекционных экспериментов было обнаружено, что этот белок распознает богатый пиримидинами консенсус из 26 нуклеотидов (Singh et al, 1995), хотя эксперименты с природными субстратами идентифицировали более короткие высокоаффинные мотивы UCUCUCU (Chan and Black, 1997) или UCUU (Perez et al. др., 1997). В отсутствие других белков PTB связывается с РНК с каноническими мотивами, образуя небольшие комплексы с наномолярным сродством, а затем некооперативно более крупные комплексы (Singh et al, 1995; Amir-Ahmady et al, 2005; Clerte and Hall, 2006). .Количество молекул PTB в более крупных комплексах было трудно предсказать, но, по-видимому, оно больше коррелировало с общей длиной пиримидинового тракта, чем со специфическими мотивами. Анализ полногеномных сайтов связывания показал, что уровень пиримидинов остается повышенным на протяжении десятков нуклеотидов вокруг каждого сайта (Xue et al, 2009).

Механизмы, с помощью которых ассоциация PTB подавляет сплайсинг, неясны. В некоторых случаях участки, богатые пиримидином, расположены по обе стороны от регулируемого экзона или сайта сплайсинга (Wagner and Garcia-Blanco, 2001; Amir-Ahmady et al, 2005).В случае нейрального экзона гена Src, который репрессирован в большинстве тканей за счет связывания PTB, два отдельных пиримидиновых тракта по обе стороны от экзона кооперируются, образуя АТФ-устойчивый комплекс, содержащий неизвестное количество белков (Chou et al. др., 2000). Эффект этого заключается в предотвращении взаимодействия мяРНП U1, связанных с 5′-сайтом сплайсинга экзона, с компонентами в нижележащем 3′-сайте сплайсинга (Sharma et al, 2005, 2008), но природа препятствия заключается в следующем. неизвестный. Пиримидиновые тракты обнаружены по обе стороны от альтернативного экзона 3 α-тропомиозина ( TPM1 ), но по сравнению с геном Src они длиннее и характер регуляции иной.Экзоны 2 и 3 TPM1 являются взаимоисключающими (). Экзон 3 используется в большинстве тканей, потому что он содержит сильные сигналы сплайсинга (Mullen et al, 1991), а переключение на экзон 2 в гладкомышечных клетках является главным образом результатом репрессии экзона 3 через богатые пиримидином тракты в фланкирующих интронах. (Гудинг и др., 1994; Перес и др., 1997). Вполне вероятно, что более длинные пиримидиновые пути (P3 и DY) связаны с PTB во всех клетках (Singh et al, 1995; Perez et al, 1997; Gooding et al, 1998), но сильные сигналы сплайсинга преобладают над этим, за исключением гладкомышечные клетки.Когда сайт разветвления ослабляется мутациями, экзон 3 сильно репрессируется в клетках HeLa (Gooding et al, 2006) P3 и DY PTB-связывающими элементами (CG и CWJS, неопубликованные данные).

Последовательности, участвующие в альтернативном сплайсинге экзонов 2 и 3 TPM1 . ( A ) Схема альтернативных паттернов сплайсинга экзонов 2 и 3. Нижний паттерн является паттерном по умолчанию, а верхний преобладает в гладких мышцах. Экзоны (боксы) и интроны не в масштабе; числа относятся к длине в нуклеотидах.Сплайсинг экзона 2 с экзоном 3 предотвращается, потому что сайт ветвления (круг) в интроне 2 находится слишком близко к экзону 2. ( B ) Схема транскриптов, использованных в этой работе. TM1 (562 нуклеотида) содержит все элементы вокруг экзона 3, которые, как было показано, участвуют в регуляции сплайсинга: P3, 50-нуклеотидный полипиримидиновый тракт, обеспечивающий сайты связывания фактора сплайсинга U2AF65 и регуляторного белка PTB; URE, восходящий регуляторный элемент повторяющихся мотивов UGC; DUGC, повторяющиеся мотивы UGC на 3′-стороне экзона; DY, полипиримидиновый участок из 40 нуклеотидов, также связанный PTB.TM2 содержит мутации, превращающие три предполагаемых высокоаффинных мотива UCUU в P3 в UUUU, UUUU и CCUU; TM3 содержит две делеции общей длиной 12 нуклеотидов в DY-тракте; TM4 объединяет эти мутации; Усечение TM1 усекается, как показано.

Хотя ясно, что PTB предпочитает связываться с пиримидиновыми путями, связь между связыванием PTB и ингибированием остается неясной. В мышлении доминировали две спекулятивные модели, обе из которых использовались также для объяснения активности другого репрессора, hnRNP A1.Одно из предположений состоит в том, что молекулы-репрессоры, связанные с последовательностями, фланкирующими регулируемые сайты, связываются в комплекс, превращая экзон или сайт в петлю (Blanchette and Chabot, 1999; Chou et al, 2000; Eperon et al, 2000; Wagner and Garcia-Blanco). , 2001; Насим и др., 2002; Оберштрасс и др., 2005; Спеллман и Смит, 2006). Однако прямые доказательства этому отсутствуют. Более того, петлеобразование нелегко согласовать с данными о том, что некоторые другие экзоны регулируются одиночными пиримидиновыми путями (Shen et al, 2004; Izquierdo et al, 2005), а альтернативная модель состоит в том, что вытянутые комплексы распространяются вдоль РНК от начальной высокой — сайт(ы) аффинности (Eperon et al, 2000; Wagner and Garcia-Blanco, 2001; Zhu et al, 2001; Spellman and Smith, 2006).Учитывая, что оценки длины последовательности, связанной или распознаваемой чистым PTB, сильно различаются и что существует сильная зависящая от концентрации способность образовывать большие комплексы, невозможно сделать вывод о природе репрессорных комплексов по свойствам чистого белка. .

Критическим фактором при разработке механистических моделей любых регулируемых реакций сплайсинга будет возможность определить количество белков, связанных с РНК в комплексах, образующихся в условиях сплайсинга.Однако для этого нет доступных методов, будь то очищенные комплексы или неочищенные экстракты, из-за сложности реакций: комплексы перед сплайсингом собираются в присутствии многочисленных конкурирующих РНК-связывающих белков, многие из которых обладают низкой специфичностью и низкой специфичностью. скорее всего, связываются динамически, а иногда и совместно. Такая сложность может затруднить установление общих принципов регуляции, потому что разные сайты могут включать разные конфигурации связанных белков.Несмотря на значительный прогресс в идентификации регуляторных белков и их сайтов-мишеней, мы находимся в печальной ситуации, когда не знаем молекулярных механизмов, действующих даже в одном сайте.

Чтобы устранить это критическое ограничение, мы разработали одномолекулярные методы анализа стехиометрии комплексов белок-РНК, образующихся в ядерных экстрактах. Мы показываем здесь, что пять или шесть молекул PTB собираются вокруг экзона 3 пре-мРНК крысы Tpm1 , и мы предлагаем модель организации комплекса.Это первый отчет, описывающий измерение стехиометрии белков в комплексах ядерных экстрактов, и этот метод будет широко использоваться в исследованиях многих аспектов экспрессии генов.

Results

Ранее было показано, что PTB связывается с богатыми пиримидинами путями, фланкирующими экзон 3, и что эти пути необходимы для репрессии (Gooding et al, 1994, 1998; Perez et al, 1997). Чтобы проследить связывание PTB с РНК среди всех других белков в ядерных экстрактах, меченный GFP PTB (изоформа 4) экспрессировали в клетках HEK 293T и готовили ядерные экстракты.Транскрипты РНК, соответствующие различным частям экзона 3 и последовательностям его фланкирующих интронов (), были транскрибированы с геномных фрагментов, клонированных в плазмиде pGEM4Z (Gooding et al., 1998; Gromak et al., 2003a), вырезанных с помощью EcoRI или AccI (TM1 Trunc) и отожженных до аналог олигорибонуклеотида, комплементарный первым девяти нуклеотидам транскрипта, который был конъюгирован с флуоресцентной меткой (Cy5) и биотином. Конструкции TM2 и TM4 содержат мутации в трех мотивах UCUU в элементе P3 (Gromak et al, 2003a), а конструкции TM3 и TM4 содержат делеции двух коротких U-богатых участков в элементе DY (Gooding et al, 1998).Транскрипты инкубировали в экстрактах в условиях сплайсинга, а образовавшиеся комплексы улавливали из разбавленных реакционных смесей на предметных стеклах, обработанных стрептавидином. Сигналы от флуорофоров GFP и Cy5 были обнаружены с помощью флуоресцентной микроскопии полного внутреннего отражения (TIRF) (Conibear and Bagshaw, 2000), разделены с помощью светоделителя и записаны на двух половинах чипа emCCD (4). Типичные временные ходы флуоресценции GFP от одиночных молекул РНК показаны в.Время выживания флуоресценции одиночных молекул было не короче, чем у молекул GFP, нанесенных непосредственно на поверхность, что указывает на то, что флуоресценция прекращалась при обесцвечивании, а не при диссоциации от комплекса.

Репрезентативное изображение, показывающее совместную локализацию РНК (красный) и белка PTB (зеленый). Ядерный экстракт, содержащий GFP-PTB, инкубировали с РНК TM1, предварительно гибридизированной с Cy5-меченым биотинилированным олигонуклеотидом. Смесь разбавляли и вводили в камеру на приготовленном предметном стекле из кремнезема.Флуоресценцию молекул, прикрепленных к поверхности, регистрировали с помощью TIRF. Наложены изображения, полученные в каналах Cy5 и GFP. Белые кружки показывают совместно локализованные сигналы Cy5 и GFP.

Запись времени молекул GFP-PTB. ( A ) След от GFP-PTB в ядерном экстракте в отсутствие добавленной РНК, показывающий количество фотонов, собранных в кадрах 300 мс, в зависимости от времени наблюдения. Примерно через 23 с молекула обесцвечивалась за одну стадию. ( B ) След от GFP-PTB, локализованный совместно с РНК TM1.Пять возможных дискретных шагов отмечены линиями. ( C ) То же, что и в ( B ), но в этом случае нельзя назначать дискретные шаги.

Количественное определение молекул PTB в каждом комплексе транскриптов с помощью одноэтапного фотообесцвечивания

Потребовались новые стратегии для количественного определения количества молекул GFP-PTB, связанных с каждой молекулой транскрипта. В отличие от анализов, проведенных с мембранными белками (Leake et al, 2006; Ulbrich and Isacoff, 2007) или небольшими органическими флуорофорами (Shu et al, 2007), подсчет количества стадий постепенного обесцвечивания молекул GFP был нецелесообразен, поскольку колебания амплитуды между отдельными молекулами GFP (см. ниже) во многих случаях эффективно маскировали отдельные шаги (сравните).Выбор только тех точек, которые давали четкие ступеньки, оставил бы открытой возможность случайного смещения. Однако было легко отличить комплексы только с одним GFP-PTB, которые вели себя как отдельные молекулы GFP, видимые в отсутствие РНК (), от комплексов, содержащих более одной, которые можно было идентифицировать по продолжительности сигнала и большие интенсивности (). Это позволило подсчитать количество комплексов с одним GFP-PTB и комплексов с более чем одним. Общее количество молекул PTB в комплексах можно было рассчитать, предполагая, что (1) общее количество связанных молекул PTB было постоянным и (2) пропорции PTB и GFP-PTB следовали биномиальному распределению.Вероятность ( p ) того, что молекула PTB, связанная с РНК, представляет собой GFP-PTB, а не эндогенный немеченый PTB, была определена путем перекрестного связывания белка в экстракте с радиоактивной укороченной РНК TM1 () и составила около 0,45. .

Сшивание PTB и GFP-PTB в ядерных экстрактах. SDS-PAGE анализ белков, меченных ³² P, путем перекрестного связывания с радиоактивной РНК. Ядерный экстракт из клеток 293T, трансфицированных плазмидой, экспрессирующей GFP-PTB, был таким же, как тот, который использовался в этой работе.Как показано, другие ядерные экстракты были получены из нетрансфицированных клеток HeLa и 293T. Субстрат TPM1 был укороченным TM1; на дорожках, обозначенных C, экстракты инкубировали с пре-мРНК аденовируса, используемой в качестве субстрата для сплайсинга in vitro .

Результаты анализа около 1600 молекул () показывают, что доля молекул РНК, связанных с обесцвечиванием GFP-PTB за одну стадию, увеличилась с 18% при самом длинном транскрипте дикого типа до 68% при самом коротком.показывает долю молекул, которые, как ожидается, продемонстрируют одностадийное обесцвечивание с p =0,45. Наблюдаемое значение 18% для транскрипта TM1 дикого типа находится между значениями, ожидаемыми для 5 или 6 молекул PTB. Точно так же комплексы, образованные на TM2 и TM3, содержат 4–5 молекул, комплексы на TM4 содержат 3–4, а комплексы на trunc TM1 содержат 2. Наблюдение, что удаление трех высокоаффинных мотивов UCUU из элемента P3 (TM2) снижает количество связанных молекул PTB только на одну было неожиданным и предполагало, что обычная практика предсказания сайтов связывания PTB с помощью высокоаффинных мотивов вводит в заблуждение.

Таблица 1а

Наблюдаемые пропорции Cy5 (РНК) молекул, в которых связанные с ними GFP-РТВ отбеливают в одну стадию

субстрат	ТМ1	TM2	ТМ3	ТМ4	ТМ1 TRUNC
% один шаг	18 (26%)	28 (36%)	29 (39%)	40 (47%)	68 (71%)
Нет. измерено	472	288	319	342	159
Доля пятен GFP, которые протестированы совместно с пятнами Cy5, показана для каждого шага обесцвечивания в процентах от одного шага.Значения в круглых скобках показывают максимальное значение доли при включении неоднозначных назначений (см. Материалы и методы). Показано общее количество измерений с каждым РНК-субстратом.

Таблица 1b

пропорции молекул, показывающие одноступенчатое отбеливание, предсказанные с различными значениями N

9

Общее количество PTB / РНК ( B )	5	5	5	4	3	2	1
p =0.45	14	14	22	22	39	49	49	49	49	71	71	71	100	100
Теоретические значения для доли пятен, демонстрирующие одно отбеливание Молекулы ПТБ с долей молекул ПТБ-GFP, равной 0,45. Доля пятен GFP, проявляющих однократное обесцвечивание в экстракте в отсутствие какого-либо РНК-субстрата, составляла >90%.

показывает долю меченых молекул РНК, совместно локализованных с GFP-PTB (), что отражает аффинность взаимодействий.Фракции постепенно уменьшались за счет мутаций в любом полипиримидиновом тракте (TM2 и TM3), в обоих трактах (TM4) и за счет усечения РНК непосредственно ниже P3 (усечение TM1). Эти результаты обеспечивают независимое подтверждение значимости результатов одностадийного фотообесцвечивания в .

Таблица 2

Эффективность образования комплексов для различных субстратов

олигонуклеотид

		ТМ1 ТМ2		ТМ3 ТМ4	ТМ1 Trunc
No.Су5 видит	334	657	866	1 344	824	1724
%, связанные с GFP-PTB	66	47	52	32	23	<5
№ измеренные	334	657	657	866	1344	1344	1724	1724	1724	1724	1724
Фракция пятен Cy5, которые совместно локализованы с GFP, относительно общего числа CY5, обнаруженные в визуализации площадь показана для каждого тестируемого субстрата.

Количественная оценка молекул PTB в каждом комплексе транскриптов путем измерения интегральных интенсивностей

Наша вторая стратегия включала подсчет общего количества обнаруженных фотонов (TNP) от GFP в каждом комплексе перед обесцвечиванием. Для одиночных молекул GFP-PTB в отсутствие РНК функция плотности вероятности для TNP соответствует нормальной функции плотности вероятности (). На этой основе была рассчитана функция плотности вероятности, предполагая, что TNP будет гауссовым для каждого GFP-PTB в комплексе и что количество комплексов с i связанными молекулами GFP-PTB ( i =1,2,3 … b ) будет следовать биномиальному распределению, как указано выше.Наблюдаемый TNP для всех молекул в каждом эксперименте был преобразован в кумулятивное распределение и подогнан под соответствующее кумулятивное распределение, рассчитанное по описанной выше функции (). Процедуру подгонки проводили с различными значениями p , вероятности того, что молекула PTB, связанная с РНК, была помечена GFP. Наилучшее глобальное соответствие было получено с p , близким к 0,45 (), предполагая, что TM1 связывает 5–6 молекул, TM2 и TM3 связывают 4–5, TM4 связывает 3–4, а TM1 trunc связывает 1–2.Эти результаты хорошо согласуются с результатами первого метода ( и ), хотя первая стратегия более чувствительна к количеству молекул в меньших комплексах, а вторая стратегия более чувствительна к количеству молекул в более крупных комплексах.

Кумулятивное распределение общего числа фотонов. ( A ) Наблюдаемые кумулятивные распределения общего количества фотонов, собранных для каждой РНК в ядерном экстракте. Числа были нормализованы к общему количеству пятен, проанализированных для каждого транскрипта, как показано на рис.По оси абсцисс отсчитывается количество отсчетов на пиксель, то есть общее количество отсчетов в области 8 × 8 на пиксель. ( B ) Кумулятивное распределение GFP-PTB в экстракте в отсутствие добавленной РНК, с построенной кривой при условии, что каждое пятно содержит только одну молекулу флуоресцентного белка. Вставка, график остатков. Абсцисса как в ( A ). ( C – ​​ G ) Совокупное распределение для GFP-PTB, связанного с транскриптами, с различными подборами при условии, что общее количество связанных молекул PTB было таким, как показано в отдельных легендах.

Вместе наши результаты показывают, что пять или шесть молекул PTB связаны с РНК α-тропомиозина дикого типа. Несмотря на то, что эти результаты были получены с использованием немышечных экстрактов, комплексы, вероятно, отражают репрессированное состояние экзона 3. Мутации, ослабляющие участок разветвления экзона 3, приводят к высоким уровням репрессии экзона 3 в клетках HeLa (Gooding et al, 2006). ), который остается зависимым от PTB-связывающих элементов P3 и DY (CG и CWJS, рукопись в процессе подготовки). Поскольку наши транскрипты не содержат сайта ветвления, не будет вмешательства в формирование репрессированного комплекса.

Подгонка PTB к полипиримидиновым путям

Принимая во внимание, что только пять или шесть молекул PTB связаны с TM1 и что первые три домена RRM каждой молекулы PTB в общей сложности контактируют лишь примерно с 15 нуклеотидами (Oberstrass et al, 2005 ), с дополнительным связыванием с помощью RRM4 в другом месте, наш первый вывод заключается в том, что мы можем исключить модели, в которых молекулы PTB непрерывно занимают РНК на протяжении 500 нуклеотидов между верхним и нижним сайтами. Вместо этого PTB должен действовать напрямую через отдельные восходящие и нисходящие области, которые он распознает напрямую.

Поскольку назначение сайтов с высоким сродством не предсказывает ни количество связанных молекул PTB, ни их сайтов связывания, мы объединили данные со специфичностью последовательности, полученной для каждого домена из структур (Oberstrass et al, 2005). чтобы смоделировать PTB в репрессированном комплексе, предполагая, что в ядерном экстракте конкуренция с др. белками имеет тенденцию усиливать связывание только с оптимальными сайтами. Мы позволили междоменному разделению находиться в диапазоне от 1 до 6 нуклеотидов (на основе среднего междоменного расстояния 4.5 нм (Петоухов и др., 2006). RRM4 обладает низкой специфичностью связывания (YCN) и из-за взаимной упаковки RRM3 и RRM4 он предпочтительно связывается на расстоянии 15 или более нуклеотидов от RRM 1–3 (Oberstrass et al, 2005; Lamichhane et al, 2010). Поскольку последовательность YC должна находиться на расстоянии> 15 нуклеотидов от любого возможного сайта для RRM 1-3, связывание RRM4 не обеспечивает ограничения и не принималось во внимание. Анализ всей последовательности TM1 показал наличие многочисленных перекрывающихся сайтов-кандидатов, почти полностью расположенных в пределах известных P3 и DY-связывающих элементов (10).Максимальное количество белков, которые могли быть размещены одновременно в P3, равнялось трем, хотя существует ряд возможных компоновок (11). Чтобы проверить, могут ли связываться до трех белков на практике, были проведены анализы сдвига геля с укороченной РНК TM1 и различными пропорциями рекомбинантных укороченных с N-конца белков PTB1 и полноразмерных белков PTB4 при насыщающей общей концентрации PTB 4 мкМ, в отсутствие ядерной вытяжки. Результаты подтверждают, что в этой области могут разместиться три молекулы PTB (1).

Способы размещения пяти молекул PTB на пре-мРНК TM1 . ( A ) Возможные сайты связывания мономеров PTB (домены 1–3), основанные на специфичности последовательности, выведенной из структур (Oberstrass et al, 2005). Каждая вертикальная линия представляет собой первый нуклеотид в потенциальном сайте связывания. Ордината показывает количество потенциальных сайтов связывания, начинающихся с одного и того же нуклеотида; такие сайты возникают из-за допустимого диапазона значений расстояния между мотивами, распознаваемыми каждым доменом.По оси абсцисс показано положение в регуляторной области с очерченными элементами P3 и DY и экзоном 3. ( B ) Возможные схемы связывания трех молекул PTB с элементом P3. Каждая горизонтальная линия показывает одно возможное расположение. Цветные полосы показывают область, связанную тремя отдельными молекулами в каждом расположении. Идентичные расположения возникают на разных горизонтальных линиях, когда предсказано, что RRM2 связывается в разных положениях внутри мономера, но домены RRM 1 и 3 находятся в одних и тех же положениях.Отмеченная область заканчивается на последнем конкретном нуклеотиде, распознаваемом доменом 3, и не включает два дополнительных нуклеотида, связанных доменом (Oberstrass et al., 2005). ( C ) Анализ сдвига геля способности связывания PTB укороченной РНК TM1. Левая дорожка содержала только РНК. Другие дорожки слева содержали РНК, инкубированную с His-меченым PTB4 при 4, 3,5, 3, 2,5, 2, 1,5, 1, 0,5 и 0 мкМ, и достаточным количеством His-меченого PTB1-N (содержащего делецию N-концевые 54 аминокислоты) для поддержания общей концентрации PTB на уровне 4 мкМ.Электрофорез проводили на 4% полиакриламидном геле. Надписи справа от изображения показывают нашу интерпретацию композиций групп. ( D ) Анализ сдвига геля способности связывания PTB мутантной укороченной РНК TM1. Субстрат происходит от TM2 и содержит мутации в элементе P3, которые изменяют три предполагаемых высокоаффинных мотива UCUU в P3 на UUUU, UUUU и CCUU и сильно снижают репрессию. Концентрации белка и условия электрофореза такие же, как и в . ( E ) Возможные схемы связывания двух молекул PTB с элементом DY, помеченные как в ( B ), в которых обе молекулы расположены в оптимальных местах.( F ) Анализ сдвига геля способности связывания PTB РНК из элемента DY. Транскрипт содержит нуклеотиды 449–562, то есть весь элемент DY, показанный на рис. Концентрации белка и условия электрофореза такие же, как и в . Показаны возможные задания.

Таблица 3

9

значения N , количество молекул PTB на молекулу РНК, выведено из лучших подходящих для кумулятивных распределений общего фотоната

субстрат	TM1	TM2	TM2	TM2	TM2	TM2	TM2	TM2	TM2	TM2	TM2	TM2	TM3	TM4	TM4	TM1 TRUNC
N	5-6	4-5	4-5	4-4	3-4	2	0
результаты и.

Соответствие между связыванием, которое мы наблюдали в ядерном экстракте, и предсказаниями, основанными на структуре, было подчеркнуто мутантным TM2, в котором мутации изменили все три мотива последовательности UCUU, которые ранее считались сайтами связывания с высоким сродством в P3 (Перес и др., 1997). Эти мутации уменьшают репрессию экзона 3 в клетках гладких мышц (Gromak et al, 2003b) и HeLa (CG и CWJS, рукопись в процессе подготовки). Наши результаты показали уменьшение на единицу количества молекул PTB, связанных в ядерном экстракте, и количество молекул, которые, согласно описанию выше, связываются с P3, также уменьшилось на единицу.Напротив, анализы сдвига в геле показали, что мутации не влияли на связывание чистого PTB с trunc TM1 (2). Это несоответствие в анализе сдвига в геле объясняется использованием очень высоких концентраций чистого PTB и высоким соотношением белок: РНК, используемым для измерения стехиометрии с помощью сдвига в геле, в которых условия и в отсутствие конкурирующих или дополнительных ядерных белков белок может связываться с субоптимальными сайтами.

Если три молекулы PTB связаны с элементом P3 в TM1, то только две или три могут быть связаны с DY.Мутации в TM3 вызывают потерю только одного PTB из DY. Предсказания, основанные на структурах доменов, как указано выше, предполагают, что до двух молекул могут одновременно связываться с DY в оптимальных сайтах связывания (), и что только одна молекула способна связываться с этой областью в TM3. Анализы сдвига в геле DY с рекомбинантным PTB, по-видимому, показали две полосы с укороченным на N-конце PTB1-N (), но при добавлении PTB4 появилось до трех дополнительных полос. Кроме того, фон был более заметным, что позволяет предположить, что комплексы были менее дискретными или менее стабильными, чем комплексы на P3.Одна из интерпретаций этого состоит в том, что каждая молекула DY РНК была связана либо с двумя, либо с тремя молекулами PTB. Это может быть объяснено субоптимальным расположением трех молекул, которое предпочтительно при использовании высоких концентраций чистого белка, как отмечено выше для занятости мутантных последовательностей P3. Если бы это происходило в некоторой степени в ядерных экстрактах, то присутствие комплексов, содержащих либо две, либо три молекулы PTB в DY, могло бы объяснить наблюдение, что все транскрипты, кроме TM1 trunc (в котором отсутствует DY), по-видимому, связаны либо , либо или n +1 молекул PTB.

Мы пришли к выводу, что использование методов одиночных молекул позволило нам измерить количество белков в комплексе репрессора сплайсинга, собранном в ядерных экстрактах на последовательностях дикого типа и мутантных последовательностях. Эти измерения позволили нам применить данные доменных структур для определения вероятных участков связывания белков и проверить способность модели учитывать эффекты мутаций.

Обсуждение

Здесь мы описали первое использование методов одиночных молекул для измерения количества молекул белка в комплексе, собранном в ядерном экстракте.Это необходимая информация для любых механистических моделей, но она полностью отсутствовала во всех более ранних исследованиях регуляции сплайсинга пре-мРНК и других этапов генной экспрессии. Трудность возникает частично из-за природы вовлеченных белков и из-за сложности реакций. Биоинформационные и селекционные подходы к идентификации мотивов последовательности, влияющих на селекцию или использование сайтов сплайсинга, позволили получить очень много мотивов (Coulter et al, 1997; Liu et al, 1998; Schaal and Maniatis, 1999; Fairbrother et al, 2002; Wang et al. , 2004, 2005, 2008; Zhang and Chasin, 2004; Han et al, 2005; Zhang et al, 2005, 2008; Castle et al, 2008), что около трех четвертей всех нуклеотидов в экзоне (Zhang et al, 2009 ) или четверть всех возможных гексамерных мотивов (Wang and Burge, 2008), вероятно, влияют на сплайсинг.Это подтверждается экспериментами (Pagani et al, 2003; Singh et al, 2004). Предполагается, что большинство этих последовательностей распознаются белками, но предсказать, какие белки где связываются, непросто. Многочисленные белки связывают пре-мРНК (Gabut et al, 2008), но очень мало случаев, когда их последовательности-мишени четко определены. Даже в тех случаях, когда свойства были тщательно изучены, сайты связывания, приписываемые важному белку, такому как SF2/ASF, зависят от того, анализируются ли они с чистым белком (Tacke and Manley, 1995), функциональным отбором (Liu et al, 1998; Smith et al, 2006) или сшивки в клетках (Sanford et al, 2008) и во всех случаях они разнообразны.Таким образом, вполне вероятно, что состав пре-мРНП является результатом конкуренции между белками с перекрывающимися предпочтениями в отношении связывания, каждый из которых имеет диапазон сродства к различным последовательностям (Abdul-Manan and Williams, 1996) и иногда способен связываться кооперативно. Таким образом, предсказание затруднено, экспериментальная валидация массовых анализов требует очистки со всеми сопутствующими артефактами, а очищенные белки будут иметь возможности, которые были бы недоступны для них в ядре. Однако проблема состава пре-мРНП может быть решена с помощью одномолекулярных методов.

Мы ожидали, что сможем подсчитать количество флуоресцентных белков, присоединенных к пре-мРНК, следуя шагам обесцвечивания (). Однако это оказалось неосуществимым и субъективным для большой доли молекул из-за различий в амплитудах излучения отдельных молекул. Наличие значительной доли немеченого PTB в экстракте было преимуществом, поскольку оно позволяло формировать большую часть комплексов только с одной молекулой GFP-PTB, которую можно было легко идентифицировать.Мы предположили, что пропорции комплексов, содержащих разное количество меченых и немеченых ПТБ, подчиняются биномиальному распределению. Этот подход был подтвержден открытием того, что доли комплексов, содержащих один GFP-PTB, увеличивались, как и ожидалось, с увеличением количества мутаций в субстратах, которые нарушали связывание PTB (14). Более того, как и предполагалось, существовала обратная связь между этой пропорцией и долей молекул РНК, связанных с GFP-PTB. Кроме того, мы измерили TNP от совместно локализованных пятен GFP-PTB/РНК до их обесцвечивания, что дало модифицированное распределение Гаусса (см. Материалы и методы).Это дало результаты, которые почти полностью соответствовали первому методу ().

Эти подходы позволили определить количество связанных белков в пределах ошибок из-за неопределенностей, присущих комплексу сплайсинга и TIRF-микроскопии. Например, мы моделировали распределение комплексов, предполагая, что каждая молекула каждого типа транскрипта содержит одинаковое количество молекул PTB. Это частично подтверждается анализами гель-сдвига TM1 в ядерном экстракте, которые дают единственную четко очерченную полосу (дополнительный рисунок S1), и исследованиями отдельных молекул с рекомбинантным PTB, которые показывают, что TM1 имеет 5–6 сайтов связывания для PTB. (Y Kafasla и DC, данные не показаны).Другой источник неопределенности возник из-за больших вариаций амплитуд излучения. Это может быть результатом ограниченного движения связанных комплексов, случайно ориентированных на поверхности изображения, сильной поляризации эванесцентного поля и функции эффективности сбора объектива. Близкое расположение связанных молекул PTB друг к другу (расстояния <10 нм) не исключает наличия гомоFRET между молекулами GFP. Последний может модулировать (нелинейным образом) общую интенсивность молекул GFP и время их жизни (Lachowski et al, 2008).Доля комплексов с одиночными молекулами GFP-PTB может быть уменьшена за счет небольшой склонности eGFP к димеризации, хотя наши результаты в отсутствие РНК предполагают, что это влияет на <10% комплексов. Тем не менее, мы считаем, что эти неопределенности относительно малы, и наши простые модели дают хорошие аппроксимации экспериментальных данных.

Зная, что TM1 содержит пять или шесть молекул PTB, стало возможным предсказать сайты связывания на субстрате. Потенциальные сайты были картированы путем объединения предпочтений связывания отдельных доменов (Oberstrass et al, 2005) с оценками длин гибких линкеров между ними (Petoukhov et al, 2006).Интересно, что этот подход выявил множественность компоновок, удовлетворяющих условиям, но в лучшем случае было возможно разместить только три оптимально связанные молекулы на P3 и две на DY. Множественность возможных сайтов для белка в P3 и DY и множественность возможных расположений для трех доменов в каждом сайте могут способствовать гораздо более высокому очевидному сродству к связыванию первой молекулы PTB. Отсутствие экспериментальных доказательств связывания с другими последовательностями-кандидатами в TM1 (~340 и 410 нуклеотидов в ) может быть результатом более слабого очевидного связывания, поскольку уровень множественности значительно снижен, а также конкуренции с другими белками.Первая молекула PTB, связанная с P3 или DY, может мешать последующему связыванию дополнительных молекул. Однако PTB включает гибко связанные домены, каждый из которых распознает только два специфических нуклеотида (Oberstrass et al, 2005), и мы предполагаем, что такое расположение может обеспечивать относительно легкое перетасовку на пиримидиновых путях, тем самым уменьшая вмешательство в связывание второй и третьей молекул.

Наши результаты дают важную информацию о природе репрессорного комплекса.представляет модели, в которых репрессорные комплексы используют кооперативные взаимодействия для распространения вдоль РНК от высокоаффинных сайтов (Wagner and Garcia-Blanco, 2001; Spellman and Smith, 2006). PTB сам по себе не проявляет сильных белок-белковых взаимодействий, но Raver1 способствует репрессии экзона 3 (Gromak et al, 2003a) и может выполнять эту функцию. Он имеет четыре потенциальных PTB-связывающих мотива, которые взаимодействуют с α-спиральной стороной RRM2 (Rideau et al, 2006), и возможно, что он может способствовать образованию протяженных комплексов.Однако длины РНК, связанной с одной молекулой PTB, совершенно недостаточно для того, чтобы пять молекул охватили более 500 нуклеотидов, и мы считаем, что эта модель может быть отвергнута для PTB.

Модели репрессии экзона 3 с помощью PTB и ассоциированных белков. ( A ) Распространение расширенных комплексов из сайтов с высоким сродством (Wagner and Garcia-Blanco, 2001; Spellman and Smith, 2006). Элементы P3 и DY показаны синими линиями. Молекулы ПТБ представлены овалами. ( B ) Образование петли между элементами P3 и DY, каждый из которых связан доменами RRM 3 или 4 (Wagner and Garcia-Blanco, 2001; Oberstrass et al, 2005; Spellman and Smith, 2006).PTB показан черным цветом; каждый домен RRM представлен овалом, RRM 1, 2 и 3 соединены линкерами и контактируют с РНК, а RRM4 тесно контактирует с RRM3 через их α-спиральные поверхности. ( C ) Модель на основе наших результатов. Слева с транскриптом связаны пять или шесть молекул PTB; три связаны через домены 1–3 с P3 и два или три аналогично с DY. Предполагается, что RRM4 каждой молекулы PTB контактирует с относительно близким C-богатым трактом. Правильно, raver1 может взаимодействовать с RRM2 каждого мономера PTB, тем самым стабилизируя сборку PTB либо на каждом элементе, либо, как показано стрелкой, между элементами.Мультимеры MBNL1 могут дополнительно способствовать репрессии, связывая мотивы UGC в петлях, образованных комплексом PTB.

Поскольку и P3, и DY необходимы для репрессии посредством связывания PTB, были предложены модели, в которых существуют петлевые взаимодействия между белками, связанными с двумя областями. Петли могут репрессировать сплайсинг, как видно из эффектов вторичных структур вокруг экзонов in vitro (Solnick, 1985). RRM-домены 3 и 4 PTB связываются спина к спине и связывают РНК в противоположных ориентациях с предпочтительным расстоянием между ними не менее 15 нуклеотидов (Oberstrass et al, 2005; Lamichhane et al, 2010).Таким образом, естественным предположением является то, что 450 нуклеотидов между P3 и DY расположены в такой петле (Oberstrass et al, 2005; Spellman and Smith, 2006). Трудно предсказать вероятность столкновения между PTB, присоединенными к одной цепи, со второй последовательностью РНК, потому что связывание белков с последовательностями внутри петли, потенциально содержащей экзон, будет влиять на гибкость РНК. Тем не менее, мы отмечаем, что другие взаимодействия, которые могут включать образование петель, ограничены диапазоном <300 н.о. (Lavigueur et al, 1993; Graveley et al, 1998), и можно было бы ожидать, что более короткие петли будут формироваться с большей вероятностью.

Поскольку единственными известными требованиями для образования петли RRM4 являются расстояние от RRM3 15 нуклеотидов или более и домен связывает YC (Oberstrass et al, 2005; Lamichhane et al, 2010), невозможно предсказать ни с каким уверенность, где RRM4 может связываться. Известно, что RRM4 необходим для репрессии сплайсинга, но вносит небольшой вклад или вообще не вносит вклад в аффинность PTB (Liu et al, 2002). Если вероятность связывания RRM4 увеличивается за счет близости (более 15 нуклеотидов) к RRM3 и обилия цитозинов, то возможно, что он гетерогенно связывается с любым из ряда C-богатых участков ниже P3 и выше DY. , образуя небольшие петли, как показано на рис.Raver1 может взаимодействовать с белками PTB на каждой стороне экзона, или он может перекрывать уже меньшее расстояние через экзон. Небольшие циклы будут содержать элементы URE и DUGC, богатые пользовательским контентом. Известно, что мышечно-слепой белок (MBNL) связывает эти последовательности, и у нас есть доказательства того, что он способствует репрессии экзона 3 (CG и CWJS, рукопись в процессе подготовки). MBNL связывает структурированные области (Warf and Berglund, 2007; Yuan et al, 2007), и может быть, что одной из функций PTB является облегчение реструктуризации РНК.MBNL может самоассоциироваться и даже образовывать большие кольца (Yuan et al, 2007), и это был бы хороший кандидат для стабилизации петли, которая изолировала 3′- и 5′-сайты сплайсинга экзона (14). Таким образом, мы предполагаем, что сборка происходит по крайней мере в две стадии, и что ассоциация PTB обеспечивает платформу для последующего рекрутирования Raver1 и/или MBNL или др. регуляторных белков. В настоящее время важной и практической задачей является определение количества молекул Raver1 и MBNL в этих комплексах.Мы полагаем, что описанные здесь одномолекулярные подходы окажутся широко применимыми для выявления стехиометрии многих других комплексов, участвующих в экспрессии генов.

Материалы и методы.

Плазмиды, олигонуклеотиды и экстракты. Для транскрипции плазмиды расщепляли EcoRI (полноразмерные РНК) или AccI (TM1 trunc) и очищали экстракцией фенолом/хлороформом.Транскрипцию проводили с помощью РНК-полимеразы Т7 (Epicentre) в 40 мМ Tris-HCl, pH 7,9, 20 мМ MgCl

₂ , 10 мМ NaCl, 2 мМ спермидина, 10 мМ DTT и НТФ по 4 мМ, с инкубацией при 37°. С в течение 4–5 часов. Транскрипты очищали обработкой ДНКазой 1, экстракцией фенолом/хлороформом, разделением на колонке S-300 MicroSpin (GE Healthcare; для полноразмерных транскриптов) и осаждением этанолом. Качество транскриптов проверяли с помощью гель-электрофореза.

Для прикрепления РНК к поверхности использовали олигонуклеотид Cy5-5′-TUGUCCCAU-3′-биотин (Eurogentec, Бельгия), где подчеркнутые основания представляют собой аналоги LNA, а остальные — аналоги 2′-OMe.Олигонуклеотид был комплементарен первым девяти нуклеотидам любой пре-мРНК. Его очищали гель-электрофорезом, электроэлюировали, обессоливали и лиофилизировали.

Отжиг проводили с РНК и олигонуклеотидом в концентрации 1 мкМ в 10 мМ Hepes, pH 8,0, 100 мМ NaCl путем нагревания смеси до 80°C в течение 5 мин, охлаждения в течение 1,5 ч до 50°C и помещения на лед на 1,5–2 ч. Наличие любого остаточного неотожженного олигонуклеотида (<10%) проверяли с помощью гель-электрофореза с последующей визуализацией флуоресценции Cy5 на PhosphorImager 9400 (Typhoon, GE Healthcare).Обратите внимание, что его присутствие мало влияет на данные, поскольку <5% молекул совместно локализуются с GFP-PTB (см.).

Ядерные экстракты готовили из трансфицированных клеток HEK293T, как описано (Lee et al., 1988). Вестерн-блоты показали, что GFP-PTB составляет около 70% от общего количества PTB в клетках (данные не показаны). Сшивку проводили в ядерных экстрактах, как описано (Eperon et al., 2000), используя РНК, транскрибированную с помощью [α- ³² P]UTP. Для анализа сдвига в геле транскрипты инкубировали с очищенным рекомбинантным белком (Wollerton et al., 2001) и анализировали, как описано выше (Gooding et al., 1998).Анализы сдвига геля РНК TM1, инкубированной в ядерном экстракте, не показали признаков грубой гетерогенности в комплексообразовании (дополнительная фигура S1).

Подготовка образцов

Комплексы для сплайсинга собирали путем инкубации отожженной РНК при 50 нМ в стандартных условиях сплайсинга, а затем разбавляли буфером А (10 мМ Hepes, pH 7,5, 50 мМ NaCl) до конечной концентрации РНК около 3 пМ . Образцы анализировали с использованием проточной камеры, как описано (Conibear and Bagshaw, 2000).Сначала биотинилированный БСА (Sigma) разводили в буфере А до 10 мкг/мл и вводили в камеру, затем промывали в том же буфере А, вводили стрептавидин (Pierce), разведенный до 10 мкг/мл, снова промывали и промывка тем же буфером, содержащим РНКазин. Затем в проточную камеру вводили 25 мкл разбавленной инкубационной смеси. При появлении достаточного количества флуоресцентных пятен на обеих половинах чипа emCCD камеру снова промывали тем же буфером.

Получение данных

Отдельные молекулы были обнаружены с помощью специального призматического флуоресцентного микроскопа полного внутреннего отражения (Conibear and Bagshaw, 2000).Возбуждение проводилось аргоновым ионным лазером на длине волны 488 нм с падающей мощностью на призме ~100 Вт/см ² и гелий-неоновым лазером на длине волны 633 нм с падающей мощностью ~50 Вт/см ² . Флуоресцентное излучение собирали с помощью водно-иммерсионного объектива Zeiss C-апохромат с числовой апертурой 63x 1,2, разделяли дихроичным зеркалом (540DCLP, Omega) и проецировали на две половины детекторного чипа (камера iXon DV887 emCCD, Andor Technology, Великобритания) через эмиссионные фильтры. специфичен для хромофоров eGFP и Cy5 (510DF23 и 670DF40, Omega соответственно) с использованием самодельного светоделителя.Скорость сбора данных составляла 300 мс на временной интервал. Флуоресценцию Cy5 получали до тех пор, пока молекулы не обесцвечивались (около 15–30 кадров), а затем продолжали визуализацию с возбуждением лазером 488 нм в течение 300–400 кадров. Коэффициент преобразования камеры (отсчеты/фотон) определяли, как описано (Черный и др., 2009). Пространственное разрешение микроскопа составляло ~130 нм/пиксель в плоскости изображения.

Для каждого временного ряда вычислялось накопленное изображение для выявления совместно локализованных пятен. Обычно> 23% сигналов Cy5 были локализованы совместно с сигналами GFP.В присутствии одного олигонуклеотида доля совместно локализованных пятен Су5 составляла <5%. Интенсивности временных рядов были проанализированы для совместно локализованных пятен с использованием площади 8 × 8 пикселей, поскольку средняя видимая ширина (FWHM аппроксимации по Гауссу) пятен составляла 2,6–2,8 пикселя. Пятна, которые значительно отклонялись от аппроксимации Гаусса, не учитывались (<5%).

Анализ стадий обесцвечивания

Более 90% сигналов от отдельных молекул GFP-PTB в отсутствие экзогенной РНК показали стадию одиночного обесцвечивания.Длительность эмиссии существенно варьировала в диапазоне 2–30 с, в среднем около 10 с. Эмиссия GFP-PTB, связанная с РНК, меченной Cy5, показала заметно большую продолжительность, с резким увеличением количества очевидных стадий обесцвечивания, но снижением их разрешения. Выбросы части этих молекул GFP-PTB демонстрировали поведение однократного обесцвечивания, аналогичное наблюдаемому в отсутствие РНК. Предполагая, что количество связанных молекул PTB, b , является постоянным, но специфичным для каждой тестируемой РНК, и принимая во внимание, что комплексы, образованные только с немеченым PTB, не обнаруживаются, доля комплексов только с одной связанной молекулой GFP-PTB, P _{b ,exp} ¹ можно рассчитать с использованием биномиального распределения,

, где p — вероятность того, что связанный PTB помечен GFP ( p близок к 0.5). Расчет доли комплексов, проявляющих сингулярное поведение при отбеливании, позволяет оценить b для каждого типа комплекса.

Возможно, есть несколько неопределенностей в b . Один из них – частичное обесцвечивание ЗФП в начале эксперимента (<10%). Из приведенной выше формулы следует, что

и, следовательно, ∣Δ P _{b ,exp} ¹ ∣ находится в диапазоне 0,04–0,06, когда P близко к 0.5 и б =2–6. Последнее можно перевести в ошибку b , используя

. Это означает, что b может быть недооценен из-за частичного обесцвечивания GFP на ∼0,6 для b =5, ∼0,45 для b =4, ∼0,3 для b =3 и ∼0,15 для b = =5. Другим источником ошибок является большой разброс интенсивности и/или продолжительности свечения отдельных молекул GFP (см. ниже), затрудняющий обнаружение комплексов, проявляющих одноступенчатое обесцвечивание.Эти неопределенности (приведенные в ) приводят к таким же ошибкам в оценке b , как и выше, но с обратным знаком.

Анализ TNP

Большинство сигналов (>90%) от отдельных молекул GFP-PTB в отсутствие экзогенной РНК демонстрировали характерное для одиночных молекул поведение одиночной ступени обесцвечивания, хотя и с широким диапазоном амплитуд от От 50 до 250 фотонов на временной интервал с большой дисперсией. Выбросы от GFP-PTB, связанные с РНК, меченной Cy5, показали гораздо большую амплитуду и дисперсию, указывающие на несколько молекул GFP-PTB в каждом комплексе.Для расчета TNP интенсивности для каждой временной трассы были скорректированы с учетом фонового сигнала. Последнюю рассчитывали как среднее с той же площади после тотального отбеливания GFP. Если до окончания съемки не было явного обесцвечивания, для расчета фона использовались соседние области 8 × 8. В отсутствие РНК распределение TNP имеет гауссову форму, охватывающую область от ~ 200 до 10 000 фотонов, с максимумом около ~ 1200 фотонов (дополнительный рисунок S2), тогда как в присутствии субстратной РНК TM1, распределение намного шире с видимым максимумом около ~3500 фотонов.Чтобы получить представление об этом распределении, мы применили статистику Колмогорова-Смирнова (KS), которая лучше подходит для небольших размеров выборки (Lilliefors, 1967). Отметим, что из анализа была исключена небольшая часть молекул (<10%), которые не проявляли поведения при однократном отбеливании. Вкратце, мы взяли диапазон интенсивностей от 0 до 10 000 фотонов, разделили его на 2000 шагов и соответственно бинировали данные. Нормирование по N , количеству измеренных пятен GFP, дало дискретную функцию плотности, e ( i ), i =1, m ( m =2000 в нашем случае).Такая плотность распределения связана с гауссовой функцией плотности распределения. переменной I , с μ и дисперсией, σ ² :

Совокупное распределение экспериментальных данных,

, соответствовало кумулятивному распределению функции g ( I I , σ):

Наилучшее соответствие, варьируя μ и σ, было получено путем минимизации статистики KS:

Значение D было найдено (с использованием Mathematica 5 и модуля Global Optimization) равным ∼0.70, что ниже уровня значимости 0,20 ( D _0,20 = 0,736; Lilliefors, 1967), подразумевая, что экспериментальное распределение TNP может соответствовать нормальной функции плотности вероятности. Распределение ТНП не зависело от интенсивности лазера 488 нм в диапазоне от 20 до 50 мВт. Отметим, что нашей целью было определить модель, описывающую распределение TNP, а не абсолютные значения среднего и дисперсии.

Аналогично строились кумулятивные распределения для данных каждого эксперимента с ТМ РНК.Используя приведенные выше предположения, то есть (1) количество связанных молекул PTB, b , постоянно ( b >1), но специфично для каждой РНК, (2) доля комплексов с 0, 1, 2… , b Молекулы PTB-GFP подчиняются биномиальному закону, (3) комплексы, в которых отсутствуют молекулы PTB-GFP, не обнаруживаются и (4) PTB и GFP-PTB проявляют одинаковое сродство к определенным сайтам, скорректированная доля для комплексов с i ( i =1, 2,… b ) молекул PTB-GFP равно

Предполагая, что каждая молекула GFP-PTB в комплексе будет вести себя аналогично, p.д.ф. для комплексов с i связанными молекулами PTB-GFP будет:

p.d.f. для популяции комплексов, содержащих b связанных молекул PTB, будет:

Кумулятивное распределение GFP( I , μ, σ, b ) будет: варьируя μ, σ и b с p около 0,45 для оценки b . Стало ясно, что b соответствует 5–6 для TM1, 4–5 для TM2 и TM3, 3–4 для TM4 и ~2 для укороченной РНК TM1.Комбинация 5, 4, 4, 3 и 2 для укороченной РНК TM1, TM2, TM3, TM4 и TM1, соответственно, лучше соответствует несколько более высоким значениям p (например, 0,47, как показано на рис.), тогда как комбинация 6 , 5, 5, 4 и 2 лучше соответствуют немного более низким значениям, таким как 0,42. Поскольку каждое экспериментальное кумулятивное распределение демонстрирует небольшие отклонения от ожидаемого распределения, наблюдаемые как дефицит при меньших количествах TNP и перенаселенность при средних значениях, ожидаемые распределения со значениями b , которые наиболее точно подходят для каждого субстрата с тем же значения для μ, σ и p показаны на ).Отметим, что предположение об однородности комплексов, т.е. b постоянно для каждого субстрата, не является очень строгим. Простые расчеты показывают, что неоднородность комплексов, то есть наличие комплексов, содержащих -1 или +1 связанных молекул ПТБ в количестве до 20-30%, будет эффективно приводить к кумулятивным распределениям в указанных границах. Распределение TNP также может быть проанализировано новым методом с использованием экспоненциальной аппроксимации данных за пределами максимума (DC, неопубликованные результаты).Это дает аналогичные результаты.

Предсказание сайтов и механизмов связывания

Предпочтения связывания для RRM-доменов 1–4 PTB были выведены из структур ЯМР как YCU, CU(N)N, YCUNN и YCN, соответственно (Oberstrass et al, 2005). На основании среднего междоменного расстояния 4,5 нм для доменов 1, 2 и 3 (Петоухов и др., 2006) мы ограничили их расстояние 1–6 нуклеотидами. RRM4 был исключен из-за отсутствия четкого ограничения расстояния (Oberstrass et al, 2005; Lamichhane et al, 2010).Таким образом, оптимальным сайтом связывания был выбран YCUN _(1–6) CUN _(3–8) YCU, где N — любой нуклеотид. Общее количество конфигураций составляет 144, что является произведением переменных длин спейсеров и двух пиримидинов (Y). Массив из 22 оснований был определен в C++, и были сгенерированы все допустимые конфигурации, которые затем сравнивались с последовательностью РНК в каждой позиции. Каждому положению нуклеотида, совпадающему с оптимальным сайтом, присваивалось значение 1, а их сумма принималась в качестве балла, максимально возможный балл равнялся 8.Выравнивания были ранжированы в соответствии с их оценкой. На рисунках показаны позиции, набравшие максимальное количество баллов. Для определения того, подходят ли две или три молекулы PTB к последовательности, подсчитывали первоначальный массив, и те, которые демонстрировали идеальное совпадение, удерживались, пока подсчитывался второй массив, и так далее. При этом требовались промежутки не менее трех оснований между соседними массивами. Были нанесены конфигурации, набравшие максимально возможное количество баллов (24).

Дополнительный материал

Дополнительные рисунки S1 и S2:

Благодарности

Мы благодарим Y Kafasla (Кембридж) за очищенный белок PTB1-N, использованный в .Эта работа была поддержана BBSRC (проектный грант BBS/B/0367X, ICE и CRB), Wellcome Trust (программный грант 077877, CWJS), премией Wellcome Trust VIP (DC) и грантом ЕС EURASNET-LSHG-CT. -2005-518238 (Европейская сеть передового опыта в области альтернативного сращивания; CWJS и ICE).

Сноски

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Ссылки

• Abdul-Manan N, Williams KR (1996) hnRNP A1 беспорядочно связывается с олигорибонуклеотидами: использование случайных и гомоолигонуклеотидов для различения последовательности от связывания, специфичного для оснований.Nucleic Acids Res 24: 4063–4070 [бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Амир-Ахмади Б., Бутц П.Л., Марковцов В., Филлипс М.Л., Блэк Д.Л. (2005) Репрессия экзона белком, связывающим полипиримидиновый тракт. RNA 11: 699–716 [бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Black DL, Grabowski PJ (2003)Альтернативный сплайсинг пре-мРНК и функция нейронов. Prog Mol Subcell Biol 31: 187–216 [PubMed] [Google Scholar]
• Blanchette M, Chabot B (1999) Модуляция пропуска экзонов высокоаффинными сайтами связывания hnRNP A1 и интронными элементами, которые подавляют использование сайта сплайсинга.EMBO J 18: 1939–1952 [бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Буц П.Л., Стойлов П., Ли К., Лин Ч., Чавла Г., Остров К., Шиуэ Л., Арес М. младший, Блэк Д.Л. (2007 ) Посттранскрипционный регуляторный переключатель в белках, связывающих полипиримидиновый тракт, перепрограммирует альтернативный сплайсинг в развивающихся нейронах. Genes Dev 21: 1636–1652 [бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Castle JC, Zhang C, Shah JK, Kulkarni AV, Kalsotra A, Cooper TA, Johnson JM (2008) Выражение 24 426 человеческих альтернатив события сплайсинга и предсказанная цис-регуляция в 48 тканях и клеточных линиях.Nat Genet 40: 1416–1425 [бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Chan RC, Black DL (1995) Консервативные интронные элементы подавляют сплайсинг нейрон-специфического c-src xon in vitro . Mol Cell Biol 15: 6377–6385 [бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Chan RC, Black DL (1997) Белок, связывающий полипиримидиновый тракт, связывается выше экзона N1 c-src, специфичного для нервных клеток, для подавления сплайсинг интрона вниз по течению. Mol Cell Biol 17: 4667–4676 [бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Черный Д.И., Эперон И.С., Бэгшоу С.Р. (2009) Зондирующие комплексы с одиночными флуорофорами: факторы, способствующие дисперсии FRET в дуплексах ДНК/РНК .Eur Biophys J 38: 395–405 [PubMed] [Google Scholar]
• Chou MY, Underwood JG, Nikolic J, Luu MH, Black DL (2000) Связывание многосайтовой РНК и высвобождение белка, связывающего полипиримидиновый тракт, во время регуляции c- src специфичный для нейронов сплайсинг. Mol Cell 5: 949–957 [PubMed] [Google Scholar]
• Clerte C, Hall KB (2006) Характеристика мультимерных комплексов, образованных белком PTB1 человека на РНК. RNA 12: 457–475 [бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Conibear PB, Bagshaw CR (2000) Сравнение оптических геометрий для комбинированного импульсного фотолиза и флуоресцентной микроскопии полного внутреннего отражения.J Microsc 200: 218–229 [PubMed] [Google Scholar]
• Coulter LR, Landree MA, Cooper TA (1997) Идентификация нового класса энхансеров экзонного сплайсинга путем отбора in vivo . Mol Cell Biol 17: 2143–2150 [бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Eperon IC, Makarova OV, Mayeda A, Munroe SH, Caceres JF, Hayward DG, Krainer AR (2000) Выбор альтернативы 5′ сайты сплайсинга: роль U1 snRNP и модели антагонистических эффектов SF2/ASF и hnRNP A1. Mol Cell Biol 20: 8303–8318 [бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Fairbrother WG, Yeh RF, Sharp PA, Burge CB (2002) Прогнозирующая идентификация экзонных энхансеров сплайсинга в генах человека.Science 297: 1007–1013 [PubMed] [Google Scholar]
• Fox-Walsh KL, Hertel KJ (2009) Спаривание сайтов сплайсинга — это процесс с высокой точностью. Proc Natl Acad Sci USA 106: 1766–1771 [бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Gabut M, Chaudhry S, Blencowe BJ (2008) SnapShot: механизм регулирования сплайсинга. Ячейка 133: 192.e1. [PubMed] [Google Scholar]
• Garcia-Blanco MA, Jamison SF, Sharp PA (1989) Идентификация и очистка белка массой 62 000 дальтон, который специфически связывается с полипиримидиновым трактом интронов.Genes Dev 3: 1874–1886 [PubMed] [Google Scholar]
• Gooding C, Clark F, Wollerton MC, Grellscheid SN, Groom H, Smith CW (2006) Класс экзонов человека с предсказанными удаленными точками ветвления, выявленными путем анализа Зоны исключения динуклеотидов AG. Геном Биол 7: R1. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Gooding C, Roberts GC, Moreau G, Nadal-Ginard B, Smith CW (1994) Специфическое для гладких мышц переключение альфа-тропомиозина, взаимоисключающий отбор экзонов путем специфического ингибирования сильный экзон по умолчанию.EMBO J 13: 3861–3872 [бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Gooding C, Roberts GC, Smith CW (1998) Роль ингибиторного пиримидинового элемента и белка, связывающего полипиримидиновый тракт, в репрессии регулируемого альфа- экзон тропомиозина. RNA 4: 85–100 [бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Grabowski PJ, Black DL (2001)Альтернативный сплайсинг РНК в нервной системе. Prog Neurobiol 65: 289–308 [PubMed] [Google Scholar]
• Graveley BR, Hertel KJ, Maniatis T (1998) Систематический анализ факторов, определяющих силу энхансеров сплайсинга пре-мРНК.EMBO J 17: 6747–6756 [бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Громак Н., Матлин А.Дж., Купер Т.А., Смит К.В. (2003a) Антагонистическая регуляция альтернативного сплайсинга альфа-актинина белками CELF и связывание полипиримидинового тракта белок. RNA 9: 443–456 [бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Gromak N, Rideau A, Southby J, Scadden AD, Gooding C, Huttelmaier S, Singer RH, Smith CW (2003b) Белок, взаимодействующий с PTB raver1 регулирует альтернативный сплайсинг альфа-тропомиозина.EMBO J 22: 6356–6364 [бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Han K, Yeo G, An P, Burge CB, Grabowski PJ (2005) Комбинаторный код для сплайсинга сайленсинга: мотивы UAGG и GGGG. PLoS Биол 3: e158. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Izquierdo JM, Majos N, Bonnal S, Martinez C, Castelo R, Guigo R, Bilbao D, Valcarcel J (2005) Регуляция альтернативного сплайсинга Fas посредством антагонистических эффектов TIA -1 и PTB по определению экзона. Mol Cell 19: 475–484 [PubMed] [Google Scholar]
• Ламичхейн Р., Добнер Г.М., Томас-Круселлс Дж., Ауветер С.Д., Маначал С., Остин К.С., Вальнюк О., Аллен Ф.Х., Руэда Д. (2010) Петля РНК PTB: доказательства роли спектроскопии FRET и ЯМР в репрессии сплайсинга.Proc Natl Acad Sci USA 107: 4105–4110 [бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Lavigueur A, La Branche H, Kornblihtt AR, Chabot B (1993) Усилитель сплайсинга в альтернативном экзоне ED1 фибронектина человека взаимодействует с белками SR и стимулирует связывание U2 snRNP. Genes Dev 7: 2405–2417 [PubMed] [Google Scholar]
• Leake MC, Chandler JH, Wadhams GH, Bai F, Berry RM, Armitage JP (2006) Стехиометрия и обмен в одиночных функционирующих мембранных белковых комплексах. Nature 443: 355–358 [PubMed] [Google Scholar]
• Lee KA, Bindereif A, Green MR (1988) Мелкомасштабная процедура приготовления ядерных экстрактов, поддерживающих эффективную транскрипцию и сплайсинг пре-мРНК.Gene Anal Tech 5: 22–31 [PubMed] [Google Scholar]
• Lilliefors H (1967) О тесте Колмогорова-Смирнова на нормальность с неизвестными средним значением и дисперсией. J Am Stat A 62: 399–402 [Google Scholar]
• Liu H, Zhang W, Reed RB, Liu W, Grabowski PJ (2002) Мутации в RRM4 разъединяют репрессию сплайсинга и РНК-связывающую активность белка, связывающего полипиримидиновый тракт. RNA 8: 137–149 [Статья бесплатно PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Liu HX, Zhang M, Krainer AR (1998) Идентификация функциональных мотивов энхансеров экзонного сплайсинга, распознаваемых отдельными белками SR.Genes Dev 12: 1998–2012 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Лучовский Р., Матвеева Е.Г., Грычинский И., Терпецниг Е.А., Паценкер Л., Лацко Г., Борейдо Дж., Гричинский З. (2008) Исследования одиночных молекул антител, меченных множественными флуорофорами. Влияние гомо-FRET на количество фотонов, доступных до фотообесцвечивания. Curr Pharm Biotechnol 9: 411–420 [бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Mullen MP, Smith CW, Patton JG, Nadal-Ginard B (1991) Альфа-тропомиозин, взаимоисключающий отбор экзонов: конкуренция между точками ветвления/ полипиримидиновые тракты определяют выбор экзона по умолчанию.Genes Dev 5: 642–655 [PubMed] [Google Scholar]
• Mulligan GJ, Guo W, Wormsley S, Helfman DM (1992) Белок, связывающий полипиримидиновый тракт, взаимодействует с последовательностями, участвующими в альтернативном сплайсинге пре-мРНК бета-тропомиозина. J Biol Chem 267: 25480–25487 [PubMed] [Google Scholar]
• Nasim FU, Hutchison S, Cordeau M, Chabot B (2002) Высокоаффинные сайты связывания hnRNP A1 и инвертированные повторы, образующие дуплекс, оказывают сходное влияние на 5′-конец. выбор сайта сплайсинга в поддержку общего механизма образования петель и репрессии.RNA 8: 1078–1089 [бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Oberstrass FC, Auweter SD, Erat M, Hargous Y, Henning A, Wenter P, Reymond L, Amir-Ahmady B, Pitsch S, Black DL, Allain FH (2005)Структура PTB, связанного с РНК: специфическое связывание и последствия для регуляции сплайсинга. Science 309: 2054–2057 [PubMed] [Google Scholar]
• Pagani F, Buratti E, Stuani C, Baralle FE (2003) Миссенс, нонсенс и нейтральные мутации определяют соседние регуляторные элементы сплайсинга в экзоне 9 трансмембранного регулятора муковисцидоза.J Biol Chem 278: 26580–26588 [PubMed] [Google Scholar]
• Pan Q, Shai O, Lee LJ, Frey BJ, Blencowe BJ (2008) Глубокое исследование сложности альтернативного сплайсинга в транскриптоме человека с помощью высокопроизводительного секвенирования. Nat Genet 40: 1413–1415 [PubMed] [Google Scholar]
• Perez I, Lin CH, McAfee JG, Patton JG (1997) Мутация сайтов связывания PTB вызывает неправильную регуляцию выбора альтернативного 3′-сайта сплайсинга in vivo . RNA 3: 764–778 [бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Петухов М.В., Мони Т.П., Аллен Ф.Х., Мэтьюз С., Карри С., Свергун Д.И. (2006) Конформация белка, связывающего полипиримидиновый тракт, в растворе.Structure 14: 1021–1027 [PubMed] [Google Scholar]
• Rideau AP, Gooding C, Simpson PJ, Monie TP, Lorenz M, Huttelmaier S, Singer RH, Matthews S, Curry S, Smith CW (2006) Пептидный мотив в Raver1 опосредует репрессию сплайсинга путем взаимодействия с доменом PTB RRM2. Nat Struct Mol Biol 13: 839–848 [PubMed] [Google Scholar]
• Sanford JR, Coutinho P, Hackett JA, Wang X, Ranahan W, Caceres JF (2008) Идентификация ядерных и цитоплазматических мРНК-мишеней для челночного белка SF2 /АСФ.PLoS One 3: e3369. [Статья бесплатно PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Schaal TD, Maniatis T (1999) Отбор и характеристика энхансеров сплайсинга пре-мРНК: идентификация новых последовательностей энхансеров, специфичных для белка SR. Mol Cell Biol 19: 1705–1719 [бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Sharma S, Falick AM, Black DL (2005) Белок, связывающий полипиримидиновый тракт, блокирует 5′-сайт-зависимую сборку U2AF и пресплайцеосомальный комплекс Е. Mol Cell 19: 485–496 [бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Sharma S, Kohlstaedt LA, Damianov A, Rio DC, Black DL (2008) Белок, связывающий полипиримидиновый тракт, контролирует переход от определения экзона к сплайсосома, определяемая интроном.Nat Struct Mol Biol 15: 183–191 [бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Shen H, Kan JL, Ghigna C, Biamonti G, Green MR (2004) Связывание белка, связывающего один полипиримидиновый тракт (PTB) сайт опосредует ингибирование сплайсинга в экзонах M1 и M2 IgM мыши. RNA 10: 787–794 [бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Shu D, Zhang H, Jin J, Guo P (2007) Подсчет шести pRNAs двигателя phi29 ДНК-упаковки с индивидуальной двойной молекулой -система просмотра. EMBO J 26: 527–537 [бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Singh NN, Androphy EJ, Singh RN (2004) Отбор in vivo выявил комбинаторные контроли, которые определяют критический экзон при спинальной мышечной атрофии гены.RNA 10: 1291–1305 [бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Singh R, Valcarcel J, Green MR (1995) Различная специфичность связывания и функции белков, связывающих полипиримидиновый тракт высших эукариот. Science 268: 1173–1176 [PubMed] [Google Scholar]
• Smith PJ, Zhang C, Wang J, Chew SL, Zhang MQ, Krainer AR (2006) Матрица показателей повышенной специфичности для прогнозирования экзонических вирусов, специфичных для SF2/ASF усилители сплайсинга. Hum Mol Genet 15: 2490–2508 [PubMed] [Google Scholar]
• Solnick D (1985) Альтернативный сплайсинг, вызванный вторичной структурой РНК.Cell 43: 667–676 [PubMed] [Google Scholar]
• Spellman R, Llorian M, Smith CW (2007) Перекрестная регуляция и функциональная избыточность между регулятором сплайсинга PTB и его паралогами nPTB и ROD1. Mol Cell 27: 420–434 [бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Spellman R, Smith CW (2006) Новые способы подавления сплайсинга с помощью PTB. Trends Biochem Sci 31: 73–76 [PubMed] [Google Scholar]
• Tacke R, Manley JL (1995) Факторы сплайсинга человека ASF/SF2 и SC35 обладают отчетливой функционально значимой специфичностью связывания РНК.EMBO J 14: 3540–3551 [бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Ulbrich MH, Isacoff EY (2007) Подсчет субъединиц в мембраносвязанных белках. Nat Methods 4: 319–321 [бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Venables JP, Koh CS, Froehlich U, Lapointe E, Couture S, Inkel L, Bramard A, Paquet ER, Watier V, Durand M , Lucier JF, Gervais-Bird J, Tremblay K, Prinos P, Klinck R, Elela SA, Chabot B (2008) Множественные и специфические мишени процессинга мРНК для основных белков hnRNP человека.Mol Cell Biol 28: 6033–6043 [бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Wagner EJ, Garcia-Blanco MA (2001) Белок, связывающий полипиримидиновый тракт, препятствует определению экзона. Mol Cell Biol 21: 3281–3288 [бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Wang ET, Sandberg R, Luo S, Khrebtukova I, Zhang L, Mayr C, Kingsmore SF, Schroth GP, Burge CB (2008 ) Альтернативная регуляция изоформ в транскриптомах тканей человека. Nature 456: 470–476 [бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Wang J, Smith PJ, Krainer AR, Zhang MQ (2005) Распространение мотивов энхансеров экзонного сплайсинга белка SR в кодирующих белок генах человека.Nucleic Acids Res 33: 5053–5062 [бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Wang Z, Burge CB (2008) Регламент сплайсинга: от списка частей регулирующих элементов до интегрированного кода сплайсинга. RNA 14: 802–813 [бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Wang Z, Rolish ME, Yeo G, Tung V, Mawson M, Burge CB (2004) Систематическая идентификация и анализ сайленсеров экзонного сплайсинга. Cell 119: 831–845 [PubMed] [Google Scholar]
• Warf MB, Berglund JA (2007) MBNL связывает сходные структуры РНК в повторах CUG миотонической дистрофии и его пре-мРНК-субстрате сердечном тропонине Т.RNA 13: 2238–2251 [бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Wollerton MC, Gooding C, Robinson F, Brown EC, Jackson RJ, Smith CW (2001) Дифференциальная активность альтернативного сплайсинга изоформ связывания полипиримидинового тракта белок (ПТБ). RNA 7: 819–832 [бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Xue Y, Zhou Y, Wu T, Zhu T, Ji X, Kwon YS, Zhang C, Yeo G, Black DL, Sun H, Fu XD, Zhang Y (2009) Полногеномный анализ взаимодействий PTB-РНК выявляет стратегию, используемую общим репрессором сплайсинга для модулирования включения или пропуска экзонов.Mol Cell 36: 996–1006 [бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Yuan Y, Compton SA, Sobczak K, Stenberg MG, Thornton CA, Griffith JD, Swanson MS (2007) Muscleblind-like 1 взаимодействует с Шпильки РНК при сплайсинге целевой и патогенной РНК. Nucleic Acids Res 35: 5474–5486 [бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Zhang C, Li WH, Krainer AR, Zhang MQ (2008) Ландшафт эволюции РНК для оптимальной дискриминации экзонов и интронов. Proc Natl Acad Sci USA 105: 5797–5802 [бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Zhang XH, Arias MA, Ke S, Chasin LA (2009) Сплайсинг дизайнерских экзонов обнаруживает неожиданную сложность сплайсинга пре-мРНК .RNA 15: 367–376 [бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Zhang XH, Chasin LA (2004) Компьютерное определение мотивов последовательности, управляющих конститутивным сплайсингом экзонов. Genes Dev 18: 1241–1250 [бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Zhang XH, Leslie CS, Chasin LA (2005) Сигналы дихотомического сплайсинга во флангах экзонов. Genome Res 15: 768–779 [бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Zhu J, Mayeda A, Krainer AR (2001) Экзонная идентичность, установленная посредством дифференциального антагонизма между экзонным сплайсингом, связанным с сайленсером hnRNP A1, и связанным с энхансером белки СР.Mol Cell 8: 1351–1361 [PubMed] [Google Scholar]

Лучшие гитары Taylor 2022 года: наш выбор лучших акустических гитар Taylor, которые можно купить сегодня

Составление списка лучших гитар Taylor никогда не было легкой задачей — их так много. С момента своего основания Бобом Тейлором и Куртом Листугом в 1974 году компания Taylor стала одним из самых уважаемых в мире производителей гитар, зарекомендовавшим себя благодаря инновациям, высоким стандартам сборки и лидирующей в отрасли приверженности использованию экологически чистых пород древесины.Теперь под руководством гуру дизайна Энди Пауэрса калифорнийская компания взмывает к еще большим высотам.

Наш путеводитель по лучшим гитарам Taylor, доступным на сегодняшний день, отражает стремление фирмы совершенствовать и совершенствовать свое мастерство, предлагая музыкантам широкий выбор моделей для дома, сцены и студии.

Лучшие гитары Taylor: руководство по продукту

(изображение кредит: Тейлор)

1. Taylor Builder’s Edition 517E

Различный вид Dreadnound

Технические характеристики

7 Запуск Цена: $ 2,899 / £ 2100

Тип: Гранд Pacific Roundered Dreadnound

7 Длина масштаба: 25½ «

Top: Torrefied Sitka Erce

• 7 Back & сторон

• 7 Back & сторон: тропический красного дерева

  7 шея: тропический Mahogany

  Peake: Tropical Mahogany

  GEEN: Tropical Mahogany

• 7 Gameboard: West African Crelicam Ebony

  Frets: 20

  Электроника: Taylor Expression System 2

  Колки: Taylor Nickel

  Для левшей?: №

  Отделка: Silent Satin

  Причины для покупки

  +

  Превосходная отделка и ощущение

  +

  Усовершенствованная распорка V-класса и составной вырезной профиль грифа

  +

  Сбалансированные звуки с округлой тональностью 

  Причины, по которым следует избегать

  —

  hi-fi trebles 

  Когда компания Taylor выпустила модель Builder’s Edition 517e Grand Pacific в 2019 году, для многих это стало неожиданностью.Это был винтажный дредноут с круглыми плечами, который был перенесен в 21-й век с помощью инновационной распорки V-класса Энди Пауэрса (подробнее об этом читайте в нашем совете по покупке внизу страницы).

  Верхняя дека из торрефицированной ситхинской ели и отделка Silent Satin помогают воспроизвести зрелый, обкатанный звук без тех тактильных «скрипов», которые обычно ожидаются от новой глянцевой гитары. Между тем, составной вырезной профиль грифа переходит от тонкой буквы «V» у порожка к закругленной букве «C», обеспечивая превосходный комфорт и облегчая работу с более высокими ладами.

  Эта распорка V-класса обеспечивает удивительно стабильный сустейн по всему грифу, а также безупречную интонацию, что означает меньше шансов попасть в кислую ноту при игре пальцами.

  (Image Credit: Taylor)

  2. Taylor Builder’s Edition 324CE

  924CE

• 7 Устойчивое развитие Premium 40021

  Технические характеристики

  Спецификации

  37 Запуск Цена: $ 2,999 / £ 2,172

• 7 Тип: Большой аудитории Электрозаписи

  Длина масштаба: 25½ «

  TOP: COLD MAHOGANY

  Back & сторон: городской ясень

  шея: Mahogany

  Глажок: Западноафриканский Crelicam Ebony

  Фреты: 20

  Электроника: Тейлор Система экспрессии 2

  Тюнгеры: GOTOH 510

  Отделка: Silent Satin

  Причины для покупки

  +

  Впечатляющий дебют для Urban Ash

  +

  Назначения Builder’s Edition улучшают играбельность

  +

  Сильная тональность средних частот это дорого для гитары, сделанной из восстановленного дерева тонов 

  Инновационная приверженность Тейлора использованию Его гитарный корпус является краеугольным камнем его индивидуальности, и 324ce продемонстрировал новую главу в этой истории, будучи построенным из городского ясеня — ясеня Шамела из поврежденных деревьев, растущих в городских районах Калифорнии.

  Производитель назвал Urban Ash похожим на желанное гондурасское красное дерево, и, если сравнивать, в этом Grand Auditorium есть сильный средний голос с превосходной четкостью сустейна при игре пальцами.

  Комплектация Builder’s Edition скорее утонченная, чем эффектная, но она определенно имеет значение: подлокотник в верхней части и скошенные края корпуса/накладки на грифе добавляют комфорта, а соотношение колков Gotoh 510 21:1 обеспечивает выдающуюся точность.

  Читать полностью Taylor Builder’s Edition 324ce обзор

  (Изображение предоставлено Тейлором)

  3.Taylor GS Mini-e Koa

  Эталон гитар для путешествий

  Характеристики

  Стартовая цена: 799 долл. США/579 фунтов стерлингов

  Тип: Grand Symphony в уменьшенном размере

  Длина мензуры: 23½ дюйма

  90 0

  Верхняя дека: цельная Нижняя дека и обечайки: ламинат Koa

  Гриф: Sapele

  Накладка на гриф: West African Crelicam Ebony

  Лады: 20

  Электроника: Taylor ES-B

  Колки: Taylor Chrome

  Исполнение для левшей: 9002?: Да 9002? Лак

  Причины купить

  +

  Прекрасная портативность для путешествий

  +

  Мощный звук в маленьком корпусе

  +

  Система ES-B делает его громоздким

  Причины, по которым следует избегать

  —

  Дизайн GS Mini в вырезе

  1

  1

  1

  1

  1

  1 Спустя более десяти лет после своего появления GS Mini остается стандартом для дорожных гитар, обеспечивая воспроизведение, которое противоречит его уменьшенным размерам.

  Отличный выбор для тех, кому нужна акустическая система, которую можно носить дома и в дороге (в комплект входит высококачественный чехол), GS Mini-e Koa предлагает простоту игры в сочетании с потрясающей фигурной зернистостью.

  Его универсальность еще больше повышается за счет комбинации звукоснимателя и предусилителя ES-B, которая поставляется с удобным встроенным тюнером — идеально подходит для выступлений гитаристов.

  (кредит Кредит: Тейлор)

  4. Taylor AD17E Blacktop

  Удивительная ценность для Pro-Spec Guitar

  Технические характеристики

  7 Запуск Цена: $ 1,699 / £ 1,230

• 7 Тип: Гранд Тихоокеанский

  Длина шкалы: 25½ «

  Top: Solidy Sitka Erce

• 7 Списка & Стороны: сплошной овангкол

  шея: Mahogany

  Глажок: Eucalyptus

  Фреты: 20

  Electronics: система экспрессии Тейлора 2

  : №

  Отделка: матовый черный

  Причины для покупки

  +

  Предлагает профессиональные характеристики по конкурентоспособной цене

  +

  Отличный универсальный продукт

  +

  Expression System 2 хорошо сочетает сильные стороны 

  Причины, по которым следует избегать

• 7 —
• 7 —
• 7 — Внешний вид Blacktop может не понравиться поклонникам традиционной эстетики 

  Несмотря на то, что Everly Brothers и Johnny Cash выдвинули черную акустическую отделку на первый план, они редко встречаются в состав Тейлор.Тем не менее, этим дредноутом Grand Pacific можно восхищаться гораздо больше, чем скрытой внешностью.

  В серии American Dream вы найдете самую доступную акустику Taylor из цельного дерева. Тем не менее, несмотря на свою ценность, AD17e Blacktop предлагает профессиональные характеристики, его распорка V-класса обеспечивает удивительно детальный отклик одной ноты на верхних ладах, а также характер игры, напоминающий J-45 Gibson.

  Добавьте восхитительно сладкие высокие частоты, и вы получите акустическую гитару, от которой невозможно оторваться.

  (кредит Кредит: Тейлор)

  5. Taylor GTE Urban Ash

  Новая среда

  Спецификации

  Спецификации

  7 Запуск Цена: $ 1,599 / £ 1 158

  7 / £ 1 158

  37 Тип: Снижение Шкалы Длина: 24 «

  Top: Solid Sitka Ersume

• 7 Back & сторон: городской пепел

• 7 шея: тропическая красного дерева

  7 гриф: Eucalyptus

  Frets: 20

  Электроника: Тейлор Система экспрессии 2

• 7 Тюнгеры: Тейлор Никель Mini

  для рук?: №

  Покрытие: матовое

  Причины купить

  +

  Эта новая шкала приятна на ощупь и может стать предпочтительной для многих

  +

  Распорка C-класса обеспечивает превосходный отклик на грифе

  +

  Простой игрок

  Причины, по которым следует избегать

  —

  Вариант с вырезом тоже имеет смысл

  Оснащенный адаптированной версией системы крепления V-класса, называемой C-классом, GTe Urban Ash представляет собой более дорогой и крупный преемник GS Mini; акустика среднего размера, которая находится где-то между этой дорожной гитарой и полноценным Тейлором.

  Новая мензура 24⅛” работает очень хорошо. Компактный, но прекрасно играбельный, он вполне может стать любимым размером акустической гитары для многих, кто его попробует. Распорка C-класса означает, что компромиссы с более высокой тональностью ладов, которые вы часто получаете с акустикой меньшего размера, здесь неприменимы — и это действительно вдохновляет вашу игру с прекрасным резонансом высоких частот и без намека на мертвые зоны.

  Включение нот Urban Ash и эвкалипта демонстрирует устойчивый подход Тейлора к созданию гитары, гаммы сродни игре с каподастром на первом ладу, а чистые средние частоты и сильный баланс эквалайзера создают убедительную комбинацию.

  прочитал полный Taylor GTE Urban Ass Review

  (изображение кредит: Тейлор)

  6. Taylor 512CE 12-FRET

  Мечта

  Технические характеристики

  7 Price: $ 2,799 / £ 2,027

  9027

  Тип: Большой концерт

• 7 Длина в масштабе: 24⅞ «

  Top: Red Wester Ceedar

  Back: Tropical Mahogany

• 7 шея: Тропическое Mahogany

  Peak: Tropical Mahogany

  Главен: Западноафриканский Crelicam Ebony

  Frets: 18

  Электроника: Taylor Expression System 2

  Колки: Taylor Slot Head

  Левша?: Да

  Отделка: Глянец

  Причины для покупки размер

  +

  Доступны дополнительные опции 

  Тейлор разработал эту модель Grand Concert с головкой грифа с прорезями для пальцев. стиль гитаристов, и если это ваш любимый стиль, это один из самых лучших вариантов в текущей линейке.Компания также предлагает ряд специальных вариантов отделки, в том числе ситхинскую ель, табак и медовые солнечные лучи, хотя за них придется заплатить больше.

  Даже стандартный вариант представляет собой значительные инвестиции, хотя вы будете вознаграждены интимным игровым опытом благодаря размеру корпуса, который находится между салоном и гигантом, и удобному шейку с атласной отделкой.

  Тональность кажется богатой и зрелой, а громкость удивит. Отдельные ноты имеют колоколообразный резонанс и чистоту, а аккорды полны и артикулированы, а ощущение короткой гаммы приносит большое удовольствие при игре пальцами.

  (Image Credit: Taylor)

  7. Taylor Academy 12e-N

  Classical Classic

  Спецификации

  Спецификации

• 7 Запуск Price: $ 749 / £ 542

• 7 Тип: Большой концерт

• 7 Длина: 25½ «

  Верхняя дека: ель для лутца

  Нижняя дека и обечайка: ламинат Sapele

  Гриф: красное дерево

  Накладка на гриф: западноафриканское эбеновое дерево Crelicam

  Лады: 17

  Электроника: Taylor ES-B, левая рука

  Колки ?: Да

  Покрытие: Лак

  Причины для покупки

  +

  Классические тембры со стальными струнами, гриф в акустическом стиле

  +

  Дружелюбный опыт, если вы новичок в использовании нейлоновых струн

  +

  ES-B отлично подойдет job 

  Причины, по которым следует избегать

  —

  У него много конкурентов в этом ценовом диапазоне

  Если вы хотите начать играть классическую музыку с отличной базовой гитарой, то 12e-N трудно превзойти.Являясь частью линейки Academy, направленной на то, чтобы дать новым музыкантам положительный первый опыт, ее играбельность — это то, от чего могут извлечь выгоду все гитаристы, хотя по стандартам Тейлора она поставляется в относительно утилитарной упаковке.

  Форма Grand Concert прекрасно сочетается с классическими нейлоновыми струнами, но гриф у нее уже, чем у обычных классических струн, что делает ее хорошим вариантом для тех, кто хочет перейти от электрогитары к акустике со стальными струнами. Тонкий матовый лак помогает усилить резонанс, хотя делает корпус более восприимчивым к ударам.

  Открытая середина демонстрирует звучание в латинском стиле, которое идеально подходит для четких сложных аккордов и даже для фламенко при более жесткой игре. Taylor ES-B — это система предусилителя начального уровня компании, но она предлагает сбалансированное и четкое представление акустической силы 12e-N с низкими частотами, которые не требуют укрощения.

  (кредит Кредит: Тейлор)

  8. Taylor 562CE

  8. Taylor 562CE

  Shimmer Me Tickers

  7

  Спецификации

  9

  Спецификации

• 7 Запуск Цена: $ 2,999 / £ 2 172

  Тип: Grand Concert 12-String Sutaway

  Длина масштаба: 24.8 «

  Top: Mahogany

  Back & сторон: Mahogany

  7 шея: Mahogany

  шея: Mahogany

  Глажок: Ebony

  Фреты: 18

  Electronics: 18

  Electronics: система экспрессии Тейлора 2

• 7 левша?: Да

  Отделка: затенено Edge Burst

  Причины купить

  +

  По-настоящему свежий взгляд на 12-струнную акустическую систему, которая звучит фантастически

  +

  Меньший корпус очень удобен

  +

  Стильный, сдержанный внешний вид

  Причины, по которым следует избегать

  —

  Значительная инвестиция, если вы только изредка играете на 12-струнной гитаре

  Тейлор упрощает переход на 12-струнную гитару, выбирая соединение грифа на 12-м ладу, чтобы бридж мог располагаться дальше от корпуса гитары для большего резонанса.

  Две струны имеют общий стержень, чтобы сохранить компактность бриджа и постоянный угол излома поперек седла. Говорят, что это помогает парам реагировать более равномерно, что улучшает настройку и отклик.

  Удобный для коленей корпус Grand Concert гитары 562ce приятно держать в руках, а распорка гитары V-класса помогает создать гармоничное мерцание, приятное для ушей. Это прекрасный, тщательно спроектированный Энди Пауэрсом звук, хотя и недешевый.

  Лучшие предложения гитар Taylor на сегодняшний день

  Лучшие гитары Taylor: советы по покупке

  (Изображение предоставлено Тейлором)

  Характеристики:  

  Распорка V-Класса 

  Распорка — это название, данное внутреннему каркасу акустической гитары, и она может оказывать существенное влияние на звук.В производстве гитар со стальными струнами традиционно преобладали Х-образные крепления, но в 2018 году Тейлор представил новый подход под названием V-Class. V-образная распорка Энди Пауэрса изменяет способ вибрации деки гитары, что приводит к «более упорядоченному раскачиванию по обеим сторонам деки» для большего сустейна и нот, которые «больше гармонируют друг с другом». Утверждения Тейлора об улучшении сустейна для нас неоспоримы, при этом более высокий регистр особенно выигрывает от более приятной ясности и резонанса.

  Распорки V-класса теперь используются в существующих линиях Taylor серии 300 и выше, а также в новых конструкциях.

  Expression System 2 

  В то время как многие гитарные компании используют предусилители и звукосниматели сторонних производителей для своих электроакустических моделей, компания Taylor решила разработать свои собственные. Неизменно высокая производительность текущей системы Expression System 2 добавляет универсальности ее инструментам.

  Expression System 2 использует три регулируемых датчика под седлом гитары, в отличие от традиционного одиночного пьезодатчика.Они работают вместе с предусилителем Taylor, предлагая громкость, высокие и низкие частоты, чтобы обеспечить встроенное формирование тона для игроков.

  Система ES-B, используемая в моделях, включая GS Mini-e и серию Academy, включает цифровой хроматический тюнер, но имеет только регуляторы тембра и громкости.

  (Изображение предоставлено Тейлором)

  Формы 

  Форма и размер гитары могут существенно повлиять на ее звучание и удобство игры. Taylor предлагает пять отличительных форм, которые являются уникальными для компании и должны учитываться при принятии любого решения о покупке:

  Большой театр: Самая компактная форма кузова Taylor, она используется для GTe Urban Ash, GT 811e и GT. K21e

  Grand Concert: Расположенный где-то между уменьшенным Grand Theatre и Grand Auditorium, это самая компактная полноразмерная форма тела Тейлора, идеально подходящая для фингерстайла

  Grand Auditorium: Before the Grand Pacific прибыл в 2019 году, это была основная «универсальная» форма тела Тейлора. теперь включает вырез звукового порта, а его изгибы являются основой для уменьшенного размера GS Mini

  Grand Orchestra: Самая большая форма корпуса Тейлора , Grand Orchestra подходит для низких частот и большей громкости  

  Экологичность 

  Taylor — разумный выбор для тех, кто беспокоится о влиянии своих покупок на окружающую среду.Производитель стремится использовать экологически чистые сорта древесины и в 2011 году стал совладельцем проекта Ebony Project , масштабной инициативы по повторной посадке в Камеруне, Африка, которая обеспечивает занятость всему сообществу.

  Совсем недавно Тейлор заключил партнерство с West Coast Arborists Inc., калифорнийской службой ухода за деревьями и управления ими. В рамках сотрудничества производитель гитар перерабатывает древесину ясеня, вырубленного в городских районах Калифорнии из-за возраста, безопасности и других факторов.

  Новое поколение датчиков FRET для надежного измерения кинетики активации Gαi1, Gαi2 и Gαi3 в отдельных клетках

  Abstract

  Рецепторы, связанные с G-белком (GPCR), могут активировать гетеротримерный комплекс G-белка с кинетикой менее секунды. Генетически кодируемые биосенсоры, основанные на переносе энергии резонанса Фёрстера (FRET), идеально подходят для изучения таких быстрых сигнальных событий в отдельных живых клетках. Здесь мы сообщаем о конструкции и характеристике трех биосенсоров FRET для измерения активации Gα _i1 , Gα _i2 и Gα _i3 .Чтобы обеспечить количественную долгосрочную визуализацию биосенсоров FRET с высоким динамическим диапазоном, необходимы флуоресцентные белки с улучшенными фотофизическими свойствами. Поэтому в качестве донора, слитого с субъединицей Gα _i , мы используем самый яркий и фотостабильный на данный момент вариант CFP, mTurquoise2, а в качестве акцептора cp173Venus, слитый с субъединицей Gγ ₂ . Конструкции биосенсоров Gα _и FRET экспрессируются вместе с Gβ ₁ из одной плазмиды, обеспечивая предпочтительные относительные уровни экспрессии с уменьшенной изменчивостью в клетках млекопитающих.Датчики Gα _и FRET продемонстрировали сильный ответ на активацию эндогенных или сверхэкспрессированных альфа-2А-адренорецепторов, которая ингибировалась коклюшным токсином. Более того, мы наблюдали активацию сенсора Gα _и FRET в одиночных клетках при стимуляции нескольких GPCR, включая рецепторы LPA ₂ , M ₃ и BK ₂ . Кроме того, мы показываем, что датчики хорошо подходят для извлечения кинетических параметров из быстрых измерений в миллисекундном временном диапазоне.Это новое поколение биосенсоров FRET для активации Gα _i1 , Gα _i2 и Gα _i3 будет ценным для измерений живых клеток, которые исследуют активацию Gα _i .

  Образец цитирования: van Unen J, Stumpf AD, Schmid B, Reinhard NR, Hordijk PL, Hoffmann C, et al. (2016) Новое поколение датчиков FRET для надежного измерения кинетики активации Gα _i1 , Gα _i2 и Gα _i3 в одиночных клетках. ПЛОС ОДИН 11(1): e0146789.https://doi.org/10.1371/journal.pone.0146789

  Редактор: Микель Гарсия-Маркос, Школа медицины Бостонского университета, США

  Получено: 25 сентября 2015 г.; Принято: 22 декабря 2015 г.; Опубликовано: 22 января 2016 г.

  Авторское право: © 2016 van Unen et al. Это статья с открытым доступом, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.

  Доступность данных: Все соответствующие данные находятся в документе и в его файлах вспомогательной информации.

  Финансирование: Авторы не имеют поддержки или финансирования для отчета.

  Конкурирующие интересы: Авторы заявили об отсутствии конкурирующих интересов.

  Введение

  Подкласс Gα _i гетеротримерных G-белков состоит из 3 членов у человека, Gα _i1,2,3 кодируется генами GNAI1, GNAI2, GNAI3 [1] и активируется широким спектром Рецепторы, связанные с G-белком.Семейство Gα _и G-белков вовлечено в многочисленные патологии, от участия в ожирении и диабете [2], функций в иммунной системе [3] до их критических ролей на нескольких стадиях биологии рака [4–7]. . Активация Gα _и преимущественно связана с ингибированием аденилатциклаз, что приводит к снижению накопления цАМФ в клетках. Однако активация Gα _и совсем недавно была связана с несколькими другими молекулярными эффекторами, включая PI3K/Akt [8,9], ERK [10] и c-Src [5].

  Измерение активации Gα _и классически проводят путем измерения ингибирования индуцированной форсколином продукции цАМФ. Подобно анализам фосфорилирования, расположенным ниже по течению, такие измерения не имеют пространственного разрешения, имеют ограниченное временное разрешение и могут зависеть от значительных перекрестных помех и усиления или десенсибилизации сигнала [11-13].

  Для прямого исследования активации G-белка с высоким пространственно-временным разрешением можно использовать генетически кодируемые биосенсоры FRET (Förster Resonance Energy Transfer) или BRET (Bioluminescent Resonance Energy Transfer) [14].Эти методы основаны на измерении безызлучательной передачи энергии от молекулы-донора к молекуле-акцептору, которая имеет место только тогда, когда донор и акцептор находятся в непосредственной близости друг от друга (<10 нм). Изменения расстояния или ориентации между донорным и акцепторным диполем приводят к изменениям эффективности RET, которые можно измерить количественно.

  Методы RET позволяют регистрировать кинетику отдельных клеток с разрешением в миллисекунды, что можно использовать для выявления межклеточной гетерогенности и записи фармакокинетических параметров.Более того, этот подход может регистрировать активацию GPCR в физиологических условиях in vivo [15].

  Gα _i был успешно помечен в различных внутренних сайтах люциферазой и использован для измерений BRET между различными субъединицами Gα _i и GPCR [16–19] или Gγ [19]. Также были выполнены измерения FRET между флуоресцентно меченными Gα _i1 , Gα _i2 и Gα _i3 и Gβ [20] или Gγ [21].

  Для выполнения измерений FRET необходима спектрально перекрывающаяся пара донора и акцептора [24], и ранее было показано, что использование более ярких флуоресцентных белков может улучшить чувствительность измерений биосенсора FRET [22,23].Чтобы получить надежные измерения FRET, которые исследуют активацию Gα _i , мы сделали слияние Gα _i1 Gα _i2 и Gα _i3 с самым ярким и наиболее фотостабильным мономерным голубым флуоресцентным белком (CFP), доступным в настоящее время, mTurquoise2. (mTq2) [25]. В качестве акцептора мы использовали кольцевую пермутантную Венеру (cpVenus), слитую с Gγ ₂ , которая ранее использовалась в качестве акцептора в одиночном плазмидном сенсоре Gα _q FRET [26]. Мы используем единую плазмидную стратегию, чтобы облегчить протоколы трансфекции и обеспечить четко определенное соотношение экспрессии донора и акцептора в клетках [27].Эта стратегия выражения должна значительно облегчить использование и воспроизводимость результатов этих датчиков. Мы представляем стратегию построения, проверку и характеристику этого нового поколения датчиков FRET для активации Gα _i1 Gα _i2 и Gα _i3 . Эти биосенсоры очень хорошо подходят для микроскопии живых клеток и могут использоваться для быстрых кинетических измерений в миллисекундном диапазоне, что позволяет характеризовать фармакологические препараты и определять включение и выключение агонистов и антагонистов GPCR, связанных с Gα _и .

  Результаты

  Генерация конструкций

  Мономерный вариант CFP mTurquoise2, предпочтительный донор в парах CFP-YFP FRET из-за его высокого квантового выхода и фотостабильности [25], был вставлен в Gα _i1 после аланина в положении 121 в петле αB-αC. Ранее было показано, что этот сайт встраивания сохраняет нуклеотидный обмен и скорость реакции GTPase, сравнимую с белком дикого типа [20]. Gα _i1 -mTq2 демонстрирует локализацию в плазматической мембране при экспрессии в клетках HeLa (рис. 1А).Были проведены пробные эксперименты для проверки того, подходит ли Gα _i1 -mTq2 для измерения с помощью FRET активации гетеротримерного комплекса G-белка при активации GPCR. С этой целью как Gβ, так и Gγ могут быть помечены акцептором для измерения активации гетеротримерного G-белка с помощью FRET [20,21]. Ранее мы показали, что самый высокий контраст FRET для Gα _q достигается с cpVenus-Gγ ₂ [26]. Поскольку Gα _i имеет высокую структурную гомологию с Gα _q , а сайт, в который вставляется mTurquoise2, аналогичен, мы решили использовать здесь тот же акцептор FRET.Поэтому для введения в клетки меченого гетеротримерного комплекса G-белка мы коэкспрессировали Gα _i1 -mTq2 вместе с акцептором FRET cpVenus-Gγ ₂ и немеченым Gβ ₁ [26]. Стимуляция коэкспрессированного адренергического рецептора α ₂ (α ₂ AR) с помощью UK14,304 показывает быстрое увеличение флуоресценции CFP и сопутствующую потерю сенсибилизированной эмиссии из канала YFP, что отражает потерю FRET. Утрату FRET можно интерпретировать как диссоциацию гетеротримера или изменение относительной конформации донора и акцептора.Чтобы обеспечить надежную совместную экспрессию различных компонентов мультимерного сенсора FRET, мы ввели субъединицы в одну и ту же плазмиду, как сообщалось ранее для сенсора Gα _q (рис. 1B) [26]. Эта стратегия использует вирусный пептид 2A и последовательность IRES для обеспечения оптимальных относительных уровней донора (Gα _i1 -mTq2) и акцептора (cpVenus-Gγ ₂ ) в отдельных клетках, минимизируя гетерогенность межклеточной экспрессии. в образце. После создания нашего первого варианта мы заметили, что Gα _i1 -mTq2 был неправильно локализован в цитоплазме во многих клетках (рис. 1C).Субъединица Gα _i1 миристоилирована и требует остатка глицина сразу после исходного метионина. Детальный анализ последовательности плазмиды выявил дополнительный стартовый кодон для Gα _i1 -mTq2 выше нативного стартового кодона, генерируемый последовательностью IRES (фиг. 1B). Мы предположили, что в нашем первом варианте сенсора большая часть продуцируемого белка Gα _i1 -mTq2 была транслирована с вышестоящего метионина в последовательности IRES, что не приводит к миристоилированному белку.Мы удалили восходящий метионин с помощью полновекторной ПЦР (см. материалы и методы), которая оставляет только нативный стартовый кодон Gα _i1 -mTq2, за которым следует глицин, обеспечивающий консенсусную последовательность для миристоилирования. Действительно, после трансфекции клеток новой плазмидой мы наблюдали правильно локализованные Gα _i1 -mTq2 (рис. 1B и 1C). Аналогичным образом были сконструированы датчик Gα _i2 и датчик Gα _i3 . Чтобы изучить совместную экспрессию трех субъединиц (Gα _i1 -mTq2, Gβ ₁ и cpVenus-Gγ ₂ ) из одной плазмиды по сравнению с тремя отдельными плазмидами, мы количественно оценили флуоресценцию CFP и YFP в этих двух экспериментальных условия (рис. 1D).Флуоресценция CFP и YFP в стратегии трансфекции с одной плазмидой имела коэффициент детерминации r ² , равный 0,64, тогда как трансфекции тремя отдельными плазмидами показали коэффициент детерминации r ² , равный 0,36, между интенсивностью CFP и интенсивностью YFP. Другими словами, корреляция между экспрессией CFP и YFP лучше в конфигурации с одной плазмидой, что указывает на явное преимущество этой конструкции. Дополнительным преимуществом этой плазмиды является экспрессия белка 3:1 выше и ниже последовательности IRES, что, как было показано ранее, приводит к предпочтительному соотношению экспрессии донора (CFP) и акцептора (YFP) для аналогичного Gα _q FRET. датчик [27].Наконец, конструкции с одной плазмидой упростят введение в первичные клетки, получение стабильных клеточных линий или трансгенных организмов с Gα _i -сенсорами.

  Рис. 1. Разработка и характеристика нового датчика Gα _i1 .

  (A) Репрезентативное изображение, показывающее локализацию на плазматической мембране Gα _i1 , слитого с mTurquoise2-Δ9, экспрессированного в клетках HeLa. (B) Схематический обзор плазмиды, содержащей pGβ-2A-YFP-Gγ ₂ -IRES-Gα _i1 -CFP, управляемой промотором CMV.На вставке показана последовательность ДНК, кодирующая конец последовательности IRES и начало последовательности Gα _i1 . Предлагаемая трансляция белка показана в строке ниже последовательности ДНК (однобуквенные сокращения аминокислот). (C) Конфокальные изображения локализации Gα _i1 -mTurquoise2-Δ9 ( верхний ряд ) и cp173Venus-Gγ ₂ ( нижний ряд ) в клетках HeLa, для варианта 1.0 ( левый столбец ) и вариант 2.0 ( правая колонка ) датчика Gα _i1 .(D) Количественный анализ коэкспрессии каналов CFP и YFP трансфекций cp173Venus-Gγ ₂ и Gα _i1 -mTurquoise2-Δ9 в клетках HeLa. Трансфекция одной плазмидой ( слева ) по сравнению с трансфекцией отдельными плазмидами ( справа ). Точки изображают интенсивность CFP и YFP, количественно определяемую по отдельным одиночным клеткам. r ² – коэффициент детерминации. Ширина отдельных изображений в A и C составляет 143 мкм.

  https://дои.org/10.1371/journal.pone.0146789.g001

  Эффективность в анализах активации GPCR

  Чтобы протестировать новый биосенсор Gα _i1 при визуализации живых клеток, мы использовали хорошо охарактеризованный GPCR, который, как известно, связывается с Gα _i1 , адренергическим рецептором α ₂ (α ₂ AR). Клетки HeLa, для которых ранее было показано, что они эндогенно содержат α ₂ AR [20], трансфицировали биосенсором Gα _i1 . При добавлении 10 мкМ UK14,304 мы наблюдали устойчивую потерю FRET, измеряя соотношение между флуоресценцией YFP и CFP биосенсора Gα _i1 , которое возвращалось к исходному уровню при добавлении 60 мкМ α ₂ AR. антагонист йохимбин (рис. 2А).Было показано, что коклюшный токсин (PTX) инактивирует передачу сигналов Gα _i в клетках посредством АДФ-рибозилирования субъединицы Gα _i [28], что предотвращает ее взаимодействие с GPCR. Активация Gα _i1 полностью прекращалась при инкубации в течение ночи с PTX, показывая, что слитый белок Gα _i1 -mTq2 по-прежнему чувствителен к PTX (фиг. 2A). Чтобы подтвердить, что датчик можно использовать для анализа активации Gα _i1 эндогенных рецепторов в первичных клетках, мы повторили этот эксперимент в HUVEC (эндотелиальные клетки пупочной вены человека).Добавление хорошо известного стимулятора HUVEC, S1P [29], вызывало устойчивое снижение отношения FRET сенсора Gα _i1 (рис. 2B), ночная обработка PTX полностью устраняла этот ответ. Затем, чтобы исследовать, насколько устойчив сенсор Gα _i1 к другим анализам активации GPCR, мы протестировали множество GPCR, которые, как было показано, связываются с Gα _i . Рецептор брадикинина 2B (BK _2B ) [30], рецептор лизофосфатидной кислоты 2 (LPA ₂ ) [31, 32] и рецептор мускаринового ацетилхолина 3 (M ₃ ) [33, 34] котрансфицировали с биосенсор Gα _i1 в клетках HeLa.При стимуляции соответствующими агонистами все три рецептора показали устойчивое снижение отношения FRET биосенсора Gα _i1 (рис. 2C). Рецептор M ₃ также показал полное восстановление отношения FRET до исходного уровня после добавления антагониста атропина. Рецептор M ₃ в основном известен своей передачей сигналов через Gα _q . Тем не менее, предыдущие исследования показали активацию Gα _i через рецептор M ₃ [19,33–36], что соответствует нашим наблюдениям.

  Рис. 2. Характеристики Gα _i -сенсоров в анализах передачи сигналов GPCR в отдельных клетках.

  (A) Эксперименты по визуализации отношения FRET в клетках HeLa, трансфицированных с помощью датчика Gα _i1 . Быстрая потеря FRET, наблюдаемая по уменьшению соотношения YFP/CFP, после стимуляции клеток 10 мкМ UK-14,304, специфичного агониста α ₂ AR, добавление 60 мкМ йохимбина возвращает соотношение FRET к исходным уровням. Ночная обработка РТХ (100 нг/мл) устраняет ответ на Gα _i1 -сенсор в клетках, стимулированных UK-14304.(B) Эксперименты по визуализации соотношения FRET у Huvecs, трансфицированных датчиком Gα _i1 . Устойчивая потеря FRET наблюдается после стимуляции 500 нМ S1P (сфингозин-1-фосфат). Ночная обработка РТХ (100 нг/мл) устраняет ответ на Gα _i1 -сенсор в S1P-стимулированных клетках. (C) Эксперименты с визуализацией отношения FRET клеток HeLa, трансфицированных датчиком Gα _i1 и BK _2B ( вверху справа ), LPA ₂ ( вверху слева ), M ₃ ( внизу справа ) и β ₂ AR-2A2-mCherry ( внизу слева ) стимулировали 1 мкМ брадикинина (BK _2B ), 1 мкМ лизофосфатидной кислоты (LPA _{1 мкМ 2}

  8 мкМ карбахола и

  ). (M

  ₃ ) или 10 мкМ изопротеренола и 10 мкМ пропранолола (β ₂ AR).Клетки HeLa, трансфицированные рецепторами BK _2B , LPA ₂ и M ₃ , демонстрируют явное изменение отношения FRET YFP/CFP при добавлении соответствующих агонистов, тогда как стимуляция β ₂ AR не изменяет FRET. отношение датчика Gα _i1 . В контрольных условиях клетки HeLa с трансфицированным только Gα _i1 -сенсором получали идентичные стимуляции. (D) Эксперименты по визуализации отношения FRET в клетках HeLa, трансфицированных датчиком Gα _i2 или датчиком Gα _i3 .Быстрая потеря FRET наблюдается после стимуляции клеток 10 мкМ UK-14,304, последующее добавление 60 мкМ йохимбина возвращает соотношение FRET к исходным уровням. Ночная обработка коклюшным токсином (PTX) (100 нг/мл) устраняет реакцию биосенсоров Gα _i2 и Gα _i3 в стимулированных клетках UK-14304. Клетки HeLa стимулировали агонистом при t = 32 с, а антагонист добавляли при t = 152 с, где указано. Клетки Huvec стимулировали S1P при t = 55 с.Кривые времени показывают среднее изменение соотношения флуоресценции YFP/CFP (± sem). Средние кривые состоят из данных по крайней мере 3 независимых экспериментов, проведенных в разные дни, с указанным количеством клеток ( n ) на условие.

  https://doi.org/10.1371/journal.pone.0146789.g002

  В условиях контроля, т.е. В отсутствие сверхэкспрессии GPCR мы стимулировали клетки HeLa соответствующим агонистом и антагонистом и наблюдали лишь очень незначительный ответ на сенсоре Gα _i1 в случае стимуляции LPA.Скорее всего, это связано с активацией эндогенных LPA-рецепторов в клетках HeLa [37]. Когда мы совместно трансфицировали адренергический рецептор β ₂ (β ₂ AR), ни одна из клеток не показала активации Gα _i1 в ответ на лечение агонистом и антагонистом (рис. 2C). Следует отметить, что β ₂ AR является классическим активатором Gα _s , но при определенных условиях сообщалось о переключении на Gα _i [38]. Наши результаты согласуются с единственным известным нам исследованием, в котором используются аналогичные инструменты (сенсоры на основе BRET) и аналогичные условия (сверхэкспрессированные β ₂ AR и гетеротримерные сенсоры G-белка) [19].Также в этом случае не наблюдалось активации Gα _i1 при стимуляции β ₂ AR (и лишь небольшая активация Gα _i2 и Gα _i3 , которая была более чем в 10 раз ниже, чем активация альфа-2C). адренергический рецептор, сильный активатор Gα _i ).

  Чтобы проверить работу биосенсоров Gα _i2 и Gα _i3 , мы трансфицировали клетки HeLa соответствующими плазмидами. Подобно эксперименту с биосенсором Gα _i1 на рис. 2А, мы наблюдали устойчивую потерю FRET после добавления 10 мкМ UK14,304, а сигнал возвращался к исходному уровню после добавления 60 мкМ йохимбина (рис. 2D).В этих экспериментальных условиях мы не наблюдали существенных различий в кинетике активации или амплитуде ответов между тремя различными субъединицами Gα _и . Как Gα _i2 -mTq2, так и Gα _i3 -mTq2 по-прежнему чувствительны к лечению PTX, о чем свидетельствует исчезновение ответа FRET после инкубации в течение ночи с PTX (рис. 2D).

  Быстрые кинетические измерения

  Чтобы более подробно изучить кинетику активации Gα _i1 в живых клетках за доли секунды, клетки HEK293 котрансфицировали сенсором Gα _i1 и α ₂ AR или рецептором аденозина A1, соответственно.Используя систему быстрой перфузии для нанесения лиганда, измерения FRET для отдельных клеток показывают быструю потерю коэффициента FRET более чем на 15% после кратковременного применения 20 мкМ норэпинефрина. После вымывания лиганда сигнал FRET возвращается к базовым уровням. Это можно было воспроизвести несколько раз без видимой потери амплитуды сигнала (рис. 3А). Аналогичный ответ наблюдался для аденозинового рецептора A1 после кратковременного применения эндогенного лиганда аденозина (30 мкМ) (рис. 3В).

  Рис. 3.Характеристики датчика Gα _i1 при кинетических измерениях.

  (A) Клетки HEK293, трансфицированные Gα _i1 -сенсором и α ₂ AR, неоднократно стимулировали 20 мкМ норадреналина в течение интервалов, которые обозначены короткими горизонтальными линиями. Представленные данные являются репрезентативными по крайней мере для шести различных трансфекций, проведенных в течение шести экспериментальных дней. Верхняя панель: эмиссия YFP, центральная панель: эмиссия CFP, нижняя панель: скорректированное и нормализованное отношение FRET.(B) Клетки HEK293, трансфицированные Gα _i1 -сенсором и аденозиновым A1-рецептором, стимулировали 30 мкМ аденозина, что обозначено короткой горизонтальной линией. Представленные данные являются репрезентативными по крайней мере для шести различных трансфекций, проведенных в течение шести экспериментальных дней. Верхняя панель: эмиссия YFP, центральная панель: эмиссия CFP, нижняя панель: скорректированное и нормализованное отношение FRET. (C) Крупный план он-кинетики активации Gα _i1 , показывающий нормализованное отношение FRET во время первой стимуляции эксперимента в (A), приспособленное к однокомпонентной экспоненциальной функции затухания с tau = 1160 мс и амплитудой = 0.18 (R = 0,99). (D) Диаграмма рассеяния, показывающая средние экспоненциальные константы времени (tau) объединенных данных из (n = 10) отдельных подборок клеток HEK293, трансфицированных сенсором Gα _i1 , и AR α ₂ , стимулированных 100 мкМ норадреналина, или объединенных данные (n = 14) из отдельных подходов Gα _i1 -сенсора и аденозинового A1-рецептора, стимулированного 30 мкМ аденозина, соответственно. Столбики погрешностей указывают на 95% ДИ.

  https://doi.org/10.1371/journal.pone.0146789.g003

  Эти быстрые измерения FRET можно использовать для оценки кинетики активации Gα _i1 с разрешением менее секунды (рис. 3C), как показано крупным планом первой стимуляции в эксперименте, показанном на рис. 3А. Кривая была подогнана под однокомпонентную экспоненциальную функцию затухания, как описано ранее [39], в результате чего экспоненциальная постоянная времени (τ) составила 1160 мс.

  Для оценки точной кинетики скорости включения Gα _i1 -сенсора клетки стимулировали насыщающими концентрациями лиганда (100 мкМ норадреналина или 30 мкМ аденозина).Каждый отдельный ответ был подогнан под однокомпонентную экспоненту, в результате чего средние значения τ для α ₂ AR составили 887 мс, а для аденозина A1 – 963 мс (рис. 3D), что соответствует периодам полураспада 614 мс и 668 мс соответственно. Эти значения хорошо согласуются с более ранними наблюдениями за активацией G-белка с помощью FRET [21,40,41].

  Заключительные замечания

  В этой рукописи мы описываем дизайн, конструкцию и характеристики трех новых биосенсоров FRET для измерения активации Gα _i1 , Gα _i2 , Gα _i3 .Новые сенсоры содержат субъединицу Gα, слитую с донорным флуорофором, mTurquoise2, и субъединицу Gγ, слитую с cp173Venus, поскольку ранее было показано, что эта комбинация для сенсора Gα _q FRET обеспечивает наибольший динамический диапазон [26]. Три субъединицы гетеротримера (Gα _i -mTq2, Gβ ₁ и cpVenus-Gγ ₂ ) были сконфигурированы на одной плазмиде, обеспечивая надежную коэкспрессию с предпочтительной стехиометрией. Мы показываем, что эти датчики хорошо подходят для микроскопии живых клеток и извлечения кинетических параметров с помощью одноклеточной логометрической визуализации FRET.Стандартизированная компоновка этих биосенсоров FRET для активации G-белка повысит надежность и воспроизводимость экспериментов внутри и между лабораториями. В данной статье это иллюстрируется надежной работой датчика Gα _i1 в трех разных лабораториях без оптимизации условий эксперимента.

  Одним из ограничений биосенсоров на основе переноса энергии для гетеротримерных G-белков является то, что они зависят от сверхэкспрессии гетеротримера, что может повлиять на естественное предпочтение GPCR для определенного класса гетеротримерных G-белков.Мечение эндогенных субъединиц флуоресцентными белками потенциально может облегчить это.

  Исключительная чувствительность этих сенсоров позволяет надежно обнаруживать активацию Gα _и в первичных клетках посредством эндогенных GPCR. Более того, эти биосенсоры можно использовать для прямого сравнения предпочтительных паттернов активации Gα _i1 , Gα _i2 и Gα _i3 между различными Gα _и , связанными GPCR, что может помочь в разработке терапевтических стратегий, нацеленных на Gα _и . сигнальные пути [42].

  Методы

  Конструирование слияний флуоресцентных белков

  Чтобы вставить mTurquoise2-Δ9 (сокращенно mTq2) [25] в белки Gα _i1 , Gα _i2 и Gα _i3 , вариант mTq2 с сайтами рестрикции Age1 на его N-конце и C-конце был сконструирован путем амплификации mTurquoise2 с прямым праймером 5′-ATaccggttctATGGTGAGCAAGGGCG-3′ и обратным праймером 5′-TAaccggtGATCCCGGCGGC-3′. Для введения Age1-сайта в Gα _i1 -цитрин мы провели полновекторную ПЦР на матрице RnGalpha _i1 -цитрин [20] с прямым праймером 5′-ATaccggtGAACTCGCCGGCGTCATA-3′ и обратным праймером 5′-ATaccggtCGCGGTCATAAAGCCTTC. -3′.Для введения Age1-сайта в Gα _i2 -цитрин мы провели полновекторную ПЦР на матрице HsGalpha _i2 -цитрин [20] с прямым праймером 5′-ATaccggtGAGGAGCAAGGCGTGCT-3′ и обратным праймером 5′-TAaccggtGGCGGTGCAGGACAGT. -3′. кДНК, содержащая кодирующую последовательность для HsGalpha _i3 с сайтом Age1, была синтезирована компанией Eurofins (www.eurofins.nl). Разрезание продукта ПЦР mTq2 и новых векторов Gα _i1 , Gα _i2 и Gα _i3 с Age1 и последующее лигирование привело к получению RnGalpha _i1 , меченного mTq2 после положения 121, и HsGalpha _{i2,3 90, меченного mTq2 после положения 114, аналогично ранее описанному функционально меченому Gα i1,2,3 [20].}

  Для конструирования варианта 1.0 сенсора Gα _i1 была проведена ПЦР на плазмиде mTq2-Gα _i1 с прямым праймером 5′-AGGTCTATATAAGCAGAGC-3′ и обратным праймером 5′-TATggatccAGCTTAGAAGAGACCACAGTC-3′ для введения Сайт BamHI на С-конце и сайт NcoI на N-конце. Затем проводили тройное лигирование с продуктом ПЦР (вырезанным BamHI и NcoI), вектором, содержащим pGβ ₁ -T2A-cp173Venus-Gγ ₂ [43] (вырезанным BamHI и SacII), и вектором, содержащим pPRIG. -IRES [44] (вырезано NcoI и SacII).Полученная плазмида, pGβ ₁ -2A-YFP-Gγ ₂ -IRES-MATT-Gα _i1 -CFP, коэкспрессирует MATT-Gα _i1 -mTurquoise2-Δ9 (нарушение локализации в плазматической мембране), pGβ ₁ и cp173Venus-Gγ ₂ (рис. 1B).

  Чтобы сконструировать вариант 2.0 Gα _i1 -сенсора, мы провели мутагенезную ПЦР с вариантом 1.0 в качестве матрицы путем амплификации с прямыми 5′-GAAAAACACGATGATAATATGGGCTGCACACTGAGC-‘3 и 5′-GCTCAGTGTGCAGCCCATATTATCGTGTTTTTC-3’.Полученная плазмида, pGβ ₁ -2A-cp173Venus-Gγ ₂ -IRES-Gα _i1 -mTurquoise2-Δ9, коэкспрессирует Gα _i1 -mTq2 (правильно расположен на плазматической мембране), pG7 905 и cpVenus-Gγ ₂ (рис. 1В).

  Чтобы создать единый плазмидный сенсор для Gα _i2 и Gα _i3 , мы провели ПЦР с удлинением с перекрытием [45]. Gα _i2 -mTq2 амплифицировали с прямым праймером ‘5-acgatgataatATGGGCTGCACCGTGA-3’ и обратным праймером ‘5-TATtctagaAGCTCAGAAGAGGCCGCAGT-3’, а Gα _i3 -mTq2 амплифицировали с прямым праймером ‘5-acgatgataatATGG3GCTG’CACG и обратным праймером праймер «5-TATtctagaAGCTTAATAAAGTCCACATTCCT-3».Еще одну ПЦР проводили на ранее описанном [26] одиночном плазмидном Gα _q -сенсоре с прямым праймером «5-GAAGTTTTTCTGTGCCATCC-3» и обратным праймером «5-GCAGCCCATattatcatcgtgtttttcaaag-3». Затем описанный выше продукт ПЦР Gα _i2 -mTq2 или Gα _i3 -mTq2 смешивали с продуктом ПЦР сенсора Gα _q и использовали в качестве матрицы для третьей ПЦР с прямым праймером ‘5-GAAGTTTTTCTGTGCCATCC. -3’ и обратный праймер ‘5-TATtctagaAGCTCAGAAGAGGCCGCAGT-3’, а также прямой праймер ‘5-GAAGTTTTTCTGTGCCATCC-3’ и обратный праймер ‘5-TATtctagaAGCTTAATAAAGTCCACATTCCT-3’ соответственно.Затем полученные продукты ПЦР лигировали в костяк сенсора Gα _q с помощью SacII и XbaI, в результате чего получали pGβ-2A-cp173Venus-Gγ ₂ -IRES-Gα _i2 -mTurquoise2-Δ9 и pGβ ₁ — 2A-cp173Venus-Gγ2-IRES-Gα _i3 -mTurquoise2-Δ9 соответственно. Последовательности плазмид доступны по запросу. Плазмиды будут распространяться через Addgene: http://www.addgene.org/Dorus_Gadella/. RnGα _i1 -mCitrine и HsGα _i2 -mCitrine были любезным подарком Скотта Гибсона [20].Обратите внимание, что кодирующая последовательность RnGα _i1 отличается только одной аминокислотой от последовательности Gα _i1 человека (S98A). Рецептор LPA ₂ был получен с сайта cDNA.org. Ранее были описаны BK ₂ R [46], α ₂ AR [21], M ₃ R [47] и рецептор A1 [48]. β ₂ AR-P2A-mCherry был любезным подарком Анны Петрашевской (Университет Амстердама).

  Культура клеток и подготовка образцов

  Клетки

  HeLa (Американская коллекция культур тканей: Манассас, Вирджиния, США) культивировали в Университете Амстердама (Амстердам, Нидерланды) с использованием модифицированной среды Игла Дульбекко (DMEM), снабженной глутамаксом, 10% FBS, пенициллином (100 ед/мл). ) и стрептомицин (100 мкг/мл).Все среды для культивирования клеток были получены от Invitrogen (Bleiswijk, NL).

  Клетки трансфицировали в чашке диаметром 35 мм, содержащей покровное стекло диаметром 24 мм № 1 (Menzel-Gläser, Брауншвейг, Германия), с использованием 1–2 мкл липофектамина 2000 в соответствии с протоколом производителя (Invitrogen), 0,5–1 мкг плазмидной кДНК и 50 мкл. OptiMeM (Life Technologies, Блейсвейк, Нидерланды). После инкубации в течение ночи при 37°C и 5% CO ₂ покровные стекла помещали в камеру для клеток Attofluor (Invitrogen, Breda, NL) и погружали в среду для микроскопии (20 мМ HEPES (PH = 7.4), 137 мМ NaCL, 5,4 мМ KCL, 1,8 мМ CaCL ₂ , 0,8 мМ MgCl ₂ и 20 мМ глюкозы). Всю микроскопию живых клеток проводили при 37°C.

  Эндотелиальные клетки пупочной вены человека (HUVEC) были приобретены у Lonza и культивированы в Sanquin Blood Supply (Амстердам, Нидерланды) на чашках, покрытых FN, в среде EGM-2 с добавлением одиночных клеток (Lonza, Вервье, Бельгия). HUVEC использовали при пассаже номер 4 или 5. В качестве метода трансфекции использовали систему трансфекции Neon (MPK5000, Invitrogen) и соответствующий набор для трансфекции Neon (Invitrogen).Генерировали одиночный импульс при 1300 В в течение 30 мс для микропорирования HUVEC с 2 мкг кДНК, затем клетки высевали на покровные стекла, покрытые FN.

  Для быстрого кинетического измерения активации Gα _i1 клетки HEK293 культивировали в Вюрцбургском университете (Вюрцбург, Германия) в среде Игла, модифицированной Дульбекко (DMEM), с добавлением 10% фетальной телячьей сыворотки, L-глютамина (2 мМ). (PAN Biotech GmbH, Айденбах, Германия), пенициллин (100 ЕД/мл) и стрептомицин (100 мкг/мл) и хранили при 37°С в атмосфере с 7% СО2.Клетки собирали и высевали на покрытые D-полилизином покровные стекла диаметром 24 мм при слиянии ~40%. Через три часа клетки временно трансфицировали 1,0 мкг рецептора (α ₂ AR или аденозина A1) и 3,0 мкг кДНК pGβ ₁ -2A-YFP-Gγ ₂ -IRES-Gα _i1 -mTq2 на 6 -луночный планшет с использованием реагента для трансфекции Effectene ^® (Qiagen) в соответствии с протоколом производителя. Среду для выращивания обновляли через 24 часа, а измерения проводили после общего времени инкубации 48 часов.Клетки содержали в среде для микроскопии (140 мМ NaCl, 5,4 мМ KCl, 2 мМ CaCl2, 1 мМ MgCl2, 10 мМ HEPES, pH 7,3) и постоянно суперфузировали этим буфером или буфером, дополненным соответствующим лигандом, с использованием компьютеризированного устройство быстрой суперфузии, управляемое электромагнитным клапаном (ValveLink 8.2, Automate Scientific).

  Широкопольная микроскопия

  Ратиометрические измерения FRET в клетках HeLa (результаты представлены на рис. 2A, 2C и 2D) были выполнены с использованием широкопольного флуоресцентного микроскопа (Axiovert 200 M; Carl Zeiss GmbH, Германия) в Университете Амстердама (Амстердам, Нидерланды), хранили при 37°С, снабжены масляным иммерсионным объективом (План-Неофлюор 40×/1.30; Carl Zeiss GmbH) и ксеноновой дуговой лампе с монохроматором (Cairn Research, Faversham, Kent, UK). Изображения были записаны с помощью охлаждаемой камеры устройства с зарядовой связью (Coolsnap HQ, Roper Scientific, Тусон, Аризона, США). Типичное время экспозиции варьировалось от 75 мс до 150 мс, а биннинг камеры был установлен на 4×4. Флуорофоры возбуждали светом с длиной волны 420 нм (ширина щели 30 нм) и отражали на образец с помощью дихроичного зеркала 455DCLP, эмиссию CFP регистрировали с помощью фильтра BP470/30, а эмиссию YFP регистрировали с помощью фильтра BP535/30, вращая колесо фильтров. .В экспериментах по совместной экспрессии YFP возбуждали светом с длиной волны 500 нм (ширина щели 30 нм) и отражали на образец с помощью дихроика 515DCXR, а эмиссию регистрировали с помощью фильтра BP535/30. Полученные данные были скорректированы на фоновый сигнал и, для изображения отношения FRET, на просачивание эмиссии CFP в канале YFP ​​(55% интенсивности, измеренной в канале CFP).

  Для экспериментов FRET в HUVEC (результаты представлены на рис. 2B) в Sanquin Blood Supply (Амстердам, Нидерланды) использовали микроскоп Zeiss Observer Z1 с числовой апертурой 1 40x.3 масляно-иммерсионным объективом и источником возбуждающего света HXP 120 В. CFP возбуждали через куб фильтра FRET (Exciter ET 436/20x и дихроичное зеркало 455 DCLP (Chroma, Bellows Falls, Вермонт, США)). Излучение направлялось на присоединенный адаптер для двух камер (Carl Zeiss GmbH, Германия), управляющий дихроичным зеркалом 510 DCSP (Chroma, Bellows Falls, Вермонт, США). Волны излучения в диапазоне 455–510 нм направляются на эмиссионный фильтр ET 480/40 (Chroma, Bellows Falls, Вермонт, США), а затем фиксируются камерой Hamamatsu ORCA-R2.Излучение с длиной волны 510 нм и выше направляется на эмиссионный фильтр ET 540/40m (Ludl Electronic Products, Нью-Йорк, США) и затем захватывается второй камерой Hamamatsu ORCA-R2. Получение изображений было выполнено с использованием программного обеспечения микроскопа Zeiss-Zen 2011. Все полученные данные были скорректированы на фоновый сигнал. Полученные данные были скорректированы на фоновый сигнал и просачивание излучения CFP в канале YFP ​​(62% интенсивности, измеренной в канале CFP).

  Для быстрых кинетических измерений активации Gα _i1 (результаты представлены на рис. 3) визуализацию выполняли на инвертированном микроскопе Zeiss Axiovert 200 в Вюрцбургском университете (Вюрцбург, Германия), оснащенном масляным иммерсионным объективом с увеличением 63x и двухэмиссионная фотометрическая система (Till Photonics), как описано ранее [21].Трансфицированные клетки возбуждали светом полихрома IV (Till Photonics). Освещение было установлено на 40 мс из общего времени интеграции 100 мс. Сигналы CFP (480 ± 20 нм), YFP (535 ± 15 нм) и отношения FRET (YFP/CFP) регистрировали одновременно (светоделитель DCLP 505 нм) при возбуждении на 436 ± 10 нм (светоделитель DCLP 460 нм). Сигналы флуоресценции регистрировали фотодиодами и оцифровывали с помощью аналого-цифрового преобразователя (Digidata 1440A, Axon Instruments). Все данные были записаны на ПК под управлением Clampex 10.3 программного обеспечения (Axon Instruments). Полученные отдельные трассы были приспособлены к однокомпонентной экспоненциальной функции затухания для извлечения экспоненциальной постоянной времени, тау [39]. Полупериод активации (t _1/2 ) определяется как τ*ln2. В динамических экспериментах клетки стимулировали UK14,304 (10 мкМ), йохимбином (60 мкМ), брадикинином (1 мкМ), LPA (1 мкМ), карбахолом (100 мкМ), атропином (10 мкМ), изопротеренолом (10 мкМ), пропранололом (10 мкМ). S1P (500 нМ), 20 мкМ или 100 мкМ норэпинефрина или 30 мкМ аденозина в указанные моменты времени.ImageJ (Национальный институт здравоохранения) использовался для анализа необработанных микроскопических изображений. Дальнейшая обработка данных проводилась в Excel (Microsoft Office), а графики и статистика проводились с использованием Graphpad версии 6.0 для Mac, GraphPad Software, La Jolla California USA, www.graphpad.com.

  Конфокальная микроскопия

  клеток HeLa, трансфицированных указанными конструкциями, визуализировали с помощью конфокального микроскопа Nikon A1, оснащенного масляным иммерсионным объективом 60x (Plan Apochromat VC, NA 1.4). Размер пинхола был установлен на 1 единицу Эйри (<0,8 мкм).

  Образцы последовательно возбуждались лазерной линией 457 нм и 514 нм и отражались на образец дихроичным зеркалом 457/514. Эмиссия CFP фильтровалась через фильтр эмиссии BP482/35; Эмиссия YFP фильтровалась через эмиссионный фильтр BP540/30. Во избежание просачивания изображения были получены в режиме последовательного строчного сканирования. Все полученные данные были скорректированы на фоновый сигнал.

  Благодарности

  Мы благодарим Eelco Hoogendoorn (Амстердамский университет) и Marten Postma (Амстердамский университет) за помощь в анализе данных.Мы благодарим Йоррита Броертьеса (студента магистра наук Амстердамского университета) и Денниса Ботмана (студента магистра наук Амстердамского университета) за создание Gα _i1 -mTurquoise2 и Gα _i2 -mTurquoise2 соответственно. Мы благодарим Мерел Аджобо-Херманс, Анну Петрашевскую и Скотта Гибсона за предоставление плазмид.

  Вклад авторов

  Задумал и разработал эксперименты: JvU PLH CH JG TWG. Выполнены опыты: JvU ADS BS NRR. Проанализированы данные: JvU ADS BS NRR CH JG.Написал статью: JvU ADS BS NRR PLH CH TWG JG.

  Каталожные номера

  1. 1. Суки В.Н., Абрамовиц Дж., Маттера Р., Кодина Дж., Бирнбаумер Л. Геном человека кодирует по крайней мере три неаллельных G-белка с субъединицами альфа-i-типа. ФЭБС лат. 1987; 220: 187–192. пмид:2440724
  2. 2. Кимпл М.Э., Нойман Дж.К., Линнеманн А.К., Кейси П.Дж. Ингибирующие G-белки и их рецепторы: новые терапевтические мишени при ожирении и диабете. Эксп Мол Мед. 2014;46: e102. пмид:24946790
  3. 3.Ван Ю, Ли Ю, Ши Г. Регулирующая функция гетеротримерных G-белков в иммунной системе. Arch Immunol Ther Exp (Warsz). 2013; 61: 309–319.
  4. 4. Дорсам РТ, Гуткинд Дж.С. Рецепторы, связанные с G-белком, и рак. Нат Рев Рак. 2007;7: 79–94. пмид:17251915
  5. 5. Белки Daaka Y. G при раке: парадигма рака предстательной железы. наук СТКЭ. 2004; 2004: вып.2. пмид:14734786
  6. 6. Appleton KM, Bigham KJ, Lindsey CC, Hazard S, Lirjoni J, Parnham S, et al.Разработка ингибиторов гетеротримерных субъединиц Gαi. Биоорг Мед Хим. 2014; 22: 3423–3434. пмид:24818958
  7. 7. Рэймонд Дж. Р., Эпплтон К. М., Пирс Дж. Ю., Петерсон Ю. К. Подавление сообщения GNAI2 при раке яичников. J Яичник Res. 2014;7:6. pmid:24423449
  8. 8. Гарсия А., Ким С., Бхавараю К., Шенвальдер С.М., Кунапули С.П. Роль фосфоинозитид-3-киназы бета в агрегации тромбоцитов и образовании тромбоксана А2, опосредованная сигнальными путями Gi. Биохим Дж.2010; 429: 369–377. пмид:20441566
  9. 9. Ла Сала А., Гадина М., Келсолл Б.Л. Зависимое от G(i)-белка ингибирование продукции IL-12 опосредовано активацией пути фосфатидилинозитол-3-киназа-протеин-3-киназа B/Akt и JNK. Дж Иммунол. 2005; 175: 2994–2999. пмид:16116186
  10. 10. Kue PF, Daaka Y. Существенная роль G-белков в росте клеток рака предстательной железы и передаче сигналов. Дж Урол. 2000; 164: 2162–2167. пмид:11061948
  11. 11. Хур Э.М., Ким К.Т.Передача сигналов рецептора, связанного с G-белком, и перекрестные помехи: достижение скорости и специфичности. Сотовый сигнал. 2002; 14: 397–405. пмид:11882384
  12. 12. Брюс ДЖИ, Штрауб С.В., Юл Д.И. Перекрестные помехи между сигналами цАМФ и Ca2+ в невозбудимых клетках. Клеточный кальций. 2003; 34: 431–444. пмид:14572802
  13. 13. Фей Д., Краучер Д.Р., Колх В., Холоденко Б.Н. Перекрестные помехи и сигнальные переключатели в каскадах митоген-активируемых протеинкиназ. Фронт Физиол. 2012;3: 355. pmid:23060802
  14. 14.Лохсе М.Дж., Нубер С., Хоффманн С. Методы резонансной передачи энергии флуоресценции/биолюминесценции для изучения активации и передачи сигналов рецепторов, связанных с G-белком. Pharmacol Rev. 2012; 64: 299–336. пмид:22407612
  15. 15. Ван Унен Дж., Вулард Дж., Ринкен А., Хоффманн С., Хилл С., Годхарт Дж. и др. Перспектива изучения передачи сигналов GPCR с помощью биосенсоров RET в живых организмах. Мол Фармакол. 2015;88(3): 589–595.
  16. 16. Gales C, Van Durm JJJ, Schaak S, Pontier S, Percherancier Y, Audet M, et al.Исследование структурных перестроек, вызванных активацией, в предварительно собранных комплексах рецептор-G-белок. Nat Struct Mol Biol. 2006; 13: 778–786. пмид:16

      8

  17. 17. Gales C, Rebois RV, Hogue M, Trieu P, Breit A, Hébert TE, et al. Мониторинг взаимодействия рецепторов и G-белков в живых клетках в режиме реального времени. Нат Методы. 2005;2: 177–184. пмид:15782186
  18. 18. Аюб М.А., Морел Д., Бине В., Финк М., Презо Л., Ансанай Х. и др. Анализ в реальном времени индуцированной агонистом активации активируемого протеазой рецептора 1/белкового комплекса Galphai1, измеренный с помощью резонансного переноса энергии биолюминесценции в живых клетках.Мол Фармакол. 2007; 71: 1329–1340. пмид:17267663
  19. 19. Сольер А., Беллот М., Пэрис Х., Денис С., Финана Ф., Хансен Дж. Т. и др. Расшифровка сложности предвзятого агонизма выявляет новый активный объект рецептора AT1. Nat Chem Biol. Издательская группа «Природа»; 2012;8: 623–631.
  20. 20. Гибсон СК, Гилман АГ. Субъединицы Giα и Gβ определяют селективность активации G-белка α2-адренорецепторами. Proc Natl Acad Sci USA. Национальная академия наук; 2006; 103: 212.
  21. 21. Бюнеманн М., Франк М., Лозе М.Дж. С обложки: Активация белка Gi в интактных клетках включает перестройку субъединиц, а не диссоциацию. Proc Natl Acad Sci USA. Национальная академия наук; 2003;100: 16077.
  22. 22. Klarenbeek JB, Goedhart J, Hink MA, Gadella TWJ, Jalink K. Датчик цАМФ на основе mTurquoise как для FLIM, так и для логометрического считывания имеет расширенный динамический диапазон. ПЛОС ОДИН. 2011;6: e19170. пмид:21559477
  23. 23. Спарта Б., Паргетт М., Минге М., Дистор К., Белл Г., Альбек Дж.Г.Механизмы на уровне рецепторов необходимы для импульсов активности киназы, регулируемой внеклеточным сигналом (ERK), стимулируемой эпидермальным фактором роста (EGF). Дж. Биол. Хим. 2015; 290: 24784–24792. пмид:26304118
  24. 24. Hamers D, van Voorst Vader L, Borst JW, Goedhart J. Разработка биосенсоров FRET для систем млекопитающих и растений. Протоплазма. 2014; 251: 333–347. пмид:24337770
  25. 25. Goedhart J, Stetten von D, Noirclerc-Savoye M, Lelimousin M, Joosen L, Hink MA, et al.Структурно-управляемая эволюция голубых флуоресцентных белков с квантовым выходом 93%. Связь с природой. 2012;3: 751. pmid:22434194
  26. 26. Adjobo-Hermans MJW, Goedhart J, van Weeren L, Nijmeijer S, Manders EMM, Offermanns S, et al. Визуализация в реальном времени активации гетеротримерного G-белка Gq в живых клетках. БМС Биол. 2011;9:32. pmid:21619590
  27. 27. Гоэдхарт Дж., Ван Верен Л., Аджобо-Херманс М.Дж.В., Эльзенаар И., Хинк М.А., Гаделла Т.В.Дж. Количественная коэкспрессия белков на уровне отдельных клеток – приложение к мультимерному датчику FRET.Дельпрато AM, редактор. ПЛОС ОДИН. 2011;6: e27321. пмид:22114669
  28. 28. Бернс ДЛ. Субъединичная структура и ферментативная активность коклюшного токсина. микробиол. наук. 1988; 5: 285–287. пмид:28
  29. 29. Wang F, Van Brocklyn JR, Hobson JP, Movafagh S, Zukowska-Grojec Z, Milstien S, et al. Сфингозин-1-фосфат стимулирует миграцию клеток через G(i)-связанный рецептор клеточной поверхности. Возможное участие в ангиогенезе. Дж. Биол. Хим. 1999; 274: 35343–35350. пмид:10585401
  30. 30.Ляо Дж. К., Хомси С. Дж. Белки G семейства G альфа i и G альфа q связывают рецептор брадикинина с высвобождением эндотелиального релаксирующего фактора. Джей Клин Инвест. 1993; 92: 2168–2172. пмид:8227332
  31. 31. ван Корвен Э.Дж., Грунинк А., Ялинк К., Эйхгольц Т., Муленаар В.Х. Лизофосфатидат-индуцированная пролиферация клеток: идентификация и анализ сигнальных путей, опосредованных G-белками. Клетка. 1989; 59: 45–54. пмид:2551506
  32. 32. An S, Bleu T, Hallmark OG, Goetzl EJ.Характеристика нового подтипа рецептора лизофосфатидной кислоты, связанного с G-белком человека. Дж. Биол. Хим. 1998; 273: 7906–7910. пмид:9525886
  33. 33. Офферманнс С., Виланд Т., Хоманн Д., Сандманн Дж., Бомбьен Э., Спичер К. и др. Трансфицированные мускариновые ацетилхолиновые рецепторы избирательно связываются с G-белками Gi-типа и Gq/11. Мол Фармакол. 1994; 45: 890–898. пмид:81

  34. 34. Акам EC, Challiss RA, Nahorski SR. Профили активации G(q/11) и G(i/o) в клетках СНО, экспрессирующих человеческие мускариновые ацетилхолиновые рецепторы: зависимость от агониста, а также от подтипа рецептора.Бр Дж. Фармакол. 2001; 132: 950–958. пмид:11181437
  35. 35. Хорниголд Д.С., Мистри Р., Раймонд П.Д., Бланк Дж.Л., Чаллисс Р.Дж. Доказательства перекрестного взаимодействия между мускариновыми ацетилхолиновыми рецепторами M2 и M3 в регуляции путей передачи сигналов вторичных мессенджеров и киназ, регулируемых внеклеточными сигналами, в клетках яичников китайского хомяка. Бр Дж. Фармакол. 2003; 138: 1340–1350. пмид:12711635
  36. 36. Блаукат А., Барак А., Кросс М.Дж., Офферманнс С., Дикич И. Активация протеинкиназы, активируемой митоген-активируемой протеинкиназой, опосредованной рецептором, связанным с G-белком, посредством взаимодействия сигналов Galpha(q) и Galpha(i).Молекулярная и клеточная биология. 2000; 20: 6837–6848. пмид:10958680
  37. 37. Йонгсма М., Матас-Рико Э., Рзадковски А., Джалинк К., Муленаар В.Х. LPA является химиопеллентом для клеток меланомы B16: действие через цАМФ-повышающий рецептор LPA5. ПЛОС ОДИН. 2011;6: e29260. пмид:22195035
  38. 38. Хилл С.Дж., Бейкер Дж.Г. Взлеты и падения переключения Gs-белка на Gi. Бр Дж. Фармакол. 2003; 138: 1188–1189. пмид:12711616
  39. 39. Хоффманн С., Гайетта Г., Бюнеманн М., Адамс С.Р., Обердорф-Маасс С., Бер Б. и др.Подход FRET на основе FlAsH для определения активации рецептора, связанного с G-белком, в живых клетках. Нат Методы. 2005;2: 171–176. пмид:15782185
  40. 40. Хайн П., Роше Ф., Хоффманн С., Дорш С., Николаев В.О., Энгельхардт С. и др. Активация GS ограничена по времени в инициации опосредованной рецептором передачи сигналов. Журнал биологической химии. 2006; 281: 33345–33351. пмид:16963443
  41. 41. Хоффманн С., Нубер С., Забель У., Циглер Н., Винклер С., Хайн П. и др. Сравнение кинетики активации М3-АХ-рецептора и конститутивно-активного мутантного рецептора в живых клетках.Мол Фармакол. 2012;82(2): 236–245 pmid:22564786
  42. 42. Деванатан В., Хагедорн И., Келер Д., Пекса К., Черпокова Д., Крафт П. и др. Белок Gi тромбоцитов Gαi2 является важным медиатором тромбовоспалительного повреждения органов у мышей. Proc Natl Acad Sci USA. 2015; 112: 6491–6496. пмид:25944935
  43. 43. Нагаи Т., Ямада С., Томинага Т., Итикава М., Мияваки А. Расширенный динамический диапазон флуоресцентных индикаторов для Ca (2+) с помощью желтых флуоресцентных белков с круговой перестановкой.Proc Natl Acad Sci USA. 2004; 101: 10554–10559. пмид:15247428
  44. 44. Martin P, Albagli O, Poggi MC, Boulukos KE, Pognonec P. Разработка нового бицистронного ретровирусного вектора с сильной активностью IRES. БМС Биотехнология. 2006;6:4. pmid:16409632
  45. 45. Хекман К.Л., Пиз Л.Р. Сплайсинг генов и мутагенез путем удлинения перекрывания, управляемого ПЦР. Нат Проток. 2007; 2: 924–932. пмид:17446874
  46. 46. Adjobo-Hermans MJW, Goedhart J, Gadella TWJ.Регуляция закрепления мембраны PLCbeta1a ее субстратом фосфатидилинозитол (4,5)-бисфосфатом. Журнал клеточной науки. 2008; 121: 3770–3777. пмид:18957514
  47. 47. Ziegler N, Bätz J, Zabel U, Lohse MJ, Hoffmann C. Датчики на основе FRET для человеческих M1-, M3- и M5-ацетилхолиновых рецепторов. Биоорг Мед Хим. 2011;19: 1048–1054. пмид:20716489
  48. 48. Клотц К.Н., Хесслинг Дж., Хеглер Дж., Оуман С., Кулл Б., Фредхольм Б.Б. и др. Сравнительная фармакология подтипов аденозиновых рецепторов человека — характеристика стабильно трансфицированных рецепторов в клетках CHO.