Разное

11183 лада: 11183 — двигатель ВАЗ 1.6 литра

Содержание

Технические характеристики автомобиля Lada (ВАЗ) 11183 (Калина) 1.6 (2005)

Технические характеристики Lada (ВАЗ) 11183 (Калина) 1.6

Lada (ВАЗ) 11183 (Калина) 1.6

    Пятидверный »седан» ВАЗ 1118 (KALINA) — модель нового семейства автомобилей. Изящные обводы кузова, оригинальная эффективная светотехника придают автомобилю современный элегантный внешний вид. В новом облике представлен также интерьер. Развитое внутреннее пространство салона, его современный оригинальный дизайн, применяемые новые отделочные материалы создают комфортные условия для размещения водителя и пассажиров. Двигатель, оснащенный системой электронного управления впрыском топлива и зажиганием, выполняет самые жесткие требования токсичности. Автомобиль соответствует всем современным требованиям по безопасности и экологии.

    Автомобильный каталог содержит описание, технические характеристики и фотографии автомобиля Lada (ВАЗ) 11183 (Калина) 1.6.

    Продажа подержанных автомобилей Lada (ВАЗ) 111 (Kalina)

    Отзывы владельцев автомобиля Lada (ВАЗ) 111 (Kalina)

    • 28.09.2007

      Мациевский Денис Сергеевич

      Оценка автора

      Объективность

      Ваз 11183 (Клина). Пробег на сегодняшний день 4050 км, машина у меня с 7 августа 2007 г. Брал в автосалоне «Курск-Лада». *** Начну с салона. Пришел в салон 4 августа за 30 минут до закрытия, менеджер сразу повел меня на площадку выбирать машину, изночально хотелось хэтчбэк аспарагус (салатовый) или рислинг (серебристый). Аспаругуса не было совсем, а рислинг было всего две машины — седан и хэтчбэк. Этим мой выбор закончился. Касса была уже закрыта, предоплату оставить нельзя. В машину положили записку, что типа машина зарезервирована. С утра 5 августа принес 20 000 тыс…

      подробнее
    • 30.05.2008

      Иванов Александр Александрович

      Оценка автора

      Объективность

      Моей машине чуть больше года. И пока, слава богу, проблем никаких нет. В целом машина отличная, но есть конечно и недостатки. Порвый недостаток это резиновый скрип в салоне. Прислушивался, приглядывался откуда он исходит, но так и не нашел. Второй недостаток быстро пачкается двигатель (подтекает масло из под головки) хотя в сервисе сказали, что это даже и неподтекает, а так, ерунда. А теперь достоинства. Машина стойкая, особенно по хозяйству. Приходилось своими силами привозить и цемент мешками и ондулин, а сколько мусора всякого вывез на ней. Кстати сказать не всякая инома…

      подробнее
    • 15.11.2007

      Владимир2_15112007

      Оценка автора

      Объективность

      Купил в 2006 году в салоне «Элекс-Полюс» «без денег». Заплатил только 1 500 за регистрацию в ГАИ. Теперь она обходится почти 400 руб в день, если не ездить. (кредит на 5 лет). Машина красивая — тюнинг «Ника». После «семерки» — это что-то! Первый раз «закипел», проехав всего лишь 900 км (!). За пробег 59 000 км. термостат меняли три раза. Эксплуатировал жестко. Меняли рулевые тяги (после 30 000). Тюнинговый бампер оечнь низко — не для дачи. Недавно (57 000) заменили генератор. Не включалась пятая передача на 50 000. Что-то там заменили. Зимой в машине не очень. Термозасл…

      подробнее

    Глазами владельца. LADA KALINA 11183 — журнал За рулем

    Глазами владельца. LADA KALINA 11183

    Здравствуйте уважаемые «За рулевцы». Читаю ваш журнал уже очень давно и иметься подшивка номеров с 1992 года. Правда не все, т.к. некоторые экземпляры по стечению обстоятельств были уничтожены. Так вот пишу вам повествование про эксплуатацию автомобиля ВАЗ 11183 выпуска декабря 2005 г. Комплектация стандартная: Эл. Усилитель руля, перед. стеклоподъемники, двигатель V=1600 см3 8 клапанов. Дополнительно было установлено:

    —Ветровики

    —Мухобойка

    —Локеры на заднюю ось (Зачем делают передние локеры не понятно, там уже стоят стандартные)

    —Защита двигателя

    —Тонировка задних стекол

    —Сигнализация с автозапуском

    —Резиновые коврики в салон

    До Калины я ездил на ВАЗ — 21103. Когда встал выбор, какую машину приобретать, я рассматривал кандидатуру ВАЗ — 2112 или Калину. Прошёл тест драйв Калины в одном из салонов славного города Челябинска, и эта машина запал мне в душу. Причины выбора:

    — Эл усилитель — очень понравилось, особенно жене, т.к. она будет эксплуатировать автомобиль совместно со мной.

    — Более удачная панель приборов, эргономика.

    — Неплохая подвеска (как мне тогда казалось).

    После приобретения авто некоторое время мы находились в некоторой эйфории (два месяца), все таки новый автомобиль. Сейчас на данный момент пройдено 20 000 км ТО-1,2 в лицензированном АВТОВАЗОМ сервисе.

    Все было хорошо но недолго. Понравилось в автомобиле следующее:

    — Мощная печка

    — Двигатель прогревается очень быстро

    — Запуск авто в мороз при —30С

    — Расход топлива в пределах 8,5 л/100км

    — Мягкая подвеска

    — В багажник входит больше чем в десятку

    Не понравилось:

    — Потеки масла в двигатели

    — Плохо включались передачи

    — На мелкой гребенке все рулевое пело свою песню, ощущение было, что все рулевое болтается

    — Стойки стучали (все) при переезде даже не больших препятствий типа лежачего полицейского

    — Двигатель тарахтел громче дизельного (У десятки двигатель просто пел)

    — Невнятный руль

    И вот началось.

    Первое моё посещение гарантии (совместил с ТО1 февраль 2006) и устранение неполадок.

    1.Сняли коробку помазали валы. Итог легкое включение скоростей. Вопрос на заводе это проконтролировать можно было?

    2.Замена сальников распредвала 7 РАЗ, только после этого была устранена течь масла.

    3. На стук стоек ответили что стук не является заводским дефектом, потекут поменяем.

    4.Тарахтение двигателя было обусловлено бракованным натяжным роликом ремня генератора. Сделан заказ на новый.

    Далее в один прекрасный день после ночной стоянки машина перестали реагировать на сигналку и тд. Итог сел аккумулятор. Стоянщики сказали, что всю ночь авто само по себе заводилось и глохло пока не умер аккумулятор. Отгоняю свою ласточку на гарантию и мне говорят что комп умер. Хорошо жду 5 дней и проблема решена. Параллельно ищу людей которые могут довести до ума стойки.

    В мае месяце приезжаю на замену натяжного ролика ремня генератора поменяли и увы снова бракованный и еще в добавок полуживой ремень генератора. Хорошо заказываю новый ролик. Через месяц оказывается что заявка утеряна. Заказываю заново. Так продолжается несколько раз. Итог замена ремня и натяжного ролика в октябре 2006 г. Ремень оказался изношен настолько что еще немного и он просто бы развалился. И о чудо двигатель зашептал (если можно так сказать все равно шумноват). Заодно поменяли трещащий стеклоподъемник. Далее я настоял что бы мне устранили стук в рулевом управлении. Заменили сначала Эл. усилитель хотя тот работал без нареканий. Новый усилитель работает слабее старого. Не помогло. Дальше снова проезжаю на гарантию говорю не помогло. Итог поменяли карданчики рулевого управления. Стук стал меньше но ответ с рулевым то же что и со стойками стук не является дефектом. Понял борьба бесполезна.

    Итог:

    1.Стук в рулевом остался

    2.Стойки гремят

    3.Все на гарантии меня узнают в лицо от механиков до начальника смены.

    4.Нашел контору которая занимается переделкой любых стоек и рейки. В итоге за 5000 рос. убитых енотов машина изменилась. Стуки пропали, машина хорошо держит дорогу. К 20 000 км шаровые почти умерли. Да вот она ягодка.

    Описанные дефекты присутствуют на многих машинах (выяснилось путем общения на гарантии). Зачем нужно было потратить год чтобы довести машину до ума и наслаждаться вождением.?

    Двигатель ВАЗ 11183-1000260 в сборе для Лада Калина ВАЗ 1117, 1118, 1119, Калина 2 ВАЗ 2192, 2194, Гранта ВАЗ 2190, 2191.

    Название:

    Артикул:

    Текст:

    Выберите категорию:
    Все RSPROдажа Двигатель » Двигатели ВАЗ в сборе » Блоки цилиндров » Головки блока цилиндров (ГБЦ) » Коленвалы » Распредвалы 16V » Распредвалы 8V » Распредвалы Классика » Шкивы / звезды / шестерни » Шатуны облегченные » Поршни » Кольца поршневые » Клапана облегченные » Тарелки клапанов » Направляющие клапанов » Толкатели клапанов жесткие » Ремни ГРМ / ролики / натяжители цепи » Маховики облегченные » Прокладки » Буст-контроллеры » Шатуны стандартные и комплектующие » Подогрев тосола » Комплекты для ТО Впускная система » Спортивные ресиверы » Дроссельные заслонки спорт » Карбюраторы спорт » Воздушные фильтры инжекторные » Фильтры нулевого сопротивления карбюраторные » Кронштейн нулевого фильтра » Регулятор давления топлива » 4-х дроссельный впуск Выхлопная система » Комплекты выхлопной системы »» Лада Веста »» Лада Приора »» Лада Гранта »» Лада Калина 1/2 »» Лада Нива 4×4 »» ВАЗ 2108-2109-21099 »» ВАЗ 2110-2111-2112 »» ВАЗ 2113-2114-2115 »» ВАЗ 2101-2105-2107 (Классика) » Пауки (выпускной коллектор) » Вставки для замены катализатора » Резонаторы (приемные трубы) » Глушители »» Лада Веста »» Лада Икс Рей »» Лада Гранта, Гранта FL »» Лада Калина, Калина 2 »» Лада Ларгус »» Лада Приора »» Лада 4х4 (Нива) »» Шевроле/Лада Нива »» ВАЗ 2108, 2109, 21099 »» ВАЗ 2110, 2111, 2112 »» ВАЗ 2113, 2114, 2115 »» ВАЗ 2101-2107 (Классика) »» Иномарки » Комплектующие для установки » Насадки на глушитель » Виброкомпенсаторы (Гофра) Турбо раздел » Приводные компрессоры АвтоТурбоСервис » Интеркулеры » Турбины » Турбоколлектор КПП / Коробка передач » Главные пары » Спортивные ряды » Блокировки КПП » Усиленные полуоси / валы / привода » Сцепление » Сцепление металлокерамика » Карданчик кулисы КПП » Короткоходные кулисы » Раздаточная коробка и комплектующие Подвеска » Стойки и амортизаторы DEMFI » Стойки и амортизаторы SS20 » Стойки и амортизаторы АСТОН » Опоры стоек / усилители опор » Пружины » Проставки развала / шпильки колес » Шумоизоляторы и отбойники »» ВАЗ 2108-2115 »» ВАЗ 2110-2112 »» Лада Калина, Лада Гранта » Полиуретановые сайлентблоки и втулки » Комплектующие » Подшипники » Поворотные кулаки и комплектующие » Ступицы и комплектующие » Задний мост Рулевое управление » Электроусилители руля (ЭУР) » Комплектующие ЭУР » Гидроусилители руля » Рулевой промежуточный вал » Рулевая рейка » Комплектующие рулевой рейки Тормозная система » Гидравлический ручной тормоз » Вакуумные усилители тормозов / ГТЦ » Задние дисковые тормоза » Тормозные диски » Тормозные колодки » Комплектующие тормозной системы » Задние тормозные барабаны Растяжки / защита / упоры / усиление жесткости кузова » Растяжки » Опоры двигателя » Подрамники » Защита картера » Рычаги передней подвески » Рычаги задней подвески » Стабилизатор устойчивости » Поперечины » Усилители кузова » Упоры капота и багажника » Крабы / гитары » Реактивные штанги » Комплектующие Внешний вид/обвесы » Бампера передние »» Лада Веста »» Лада Иксрей »» Лада Приора »» Лада Гранта »» Лада Калина 1/2 »» Датсун »» Лада Нива 4×4 »» ВАЗ 2108-2109-21099 »» ВАЗ 2113-2114-2115 »» ВАЗ 2110-2111-2112 »» ВАЗ 2101-2105-2107 »» Рено Дастер » Бампера задние »» Лада Веста »» Лада Иксрей »» Лада Приора »» Лада Гранта »» Лада Калина 1/2 »» Датсун »» Лада Нива 4×4 »» ВАЗ 2108-2109-21099 »» ВАЗ 2113-2114-2115 »» ВАЗ 2110-2111-2112 »» ВАЗ 2101-2105-2107 » Решетки радиатора »» Лада Веста »» Лада Иксрей »» Лада Приора »» Лада Гранта »» Лада Калина 1/2 »» Лада Нива 4×4 »» ВАЗ 2108-21099 »» ВАЗ 2113-2114 »» ВАЗ 2110-2112 »» Датсун »» ВАЗ 2101-2105-2107 »» Лада Ларгус »» Рено Дастер »» KIA »» Лада Нива (ВАЗ 2123), Шевроле Нива (ВАЗ 2123) » Решетки бампера нижние »» Лада Веста »» Лада Приора »» Лада Калина »» Лада Ларгус »» Датсун » Кузовные детали »» Лада Приора »» Лада Гранта »» ВАЗ 2110-2111-2112 »» ВАЗ 2113-2114-2115 »» ВАЗ 2108-2109-21099 »» Лада Нива 4х4 »» Лада Ларгус »» Шевроле Нива »» Лада Веста »» Лада Иксрей »» ВАЗ 2101-2105-2107 » Реснички на фары »» Лада Приора »» Лада Гранта »» Лада Калина »» Лада Ларгус »» ВАЗ 2110-2111-2112 »» ВАЗ 2113-2114-2115 »» ВАЗ 2108-2109-21099 » Накладки на фонари » Боковые зеркала и стекла »» Лада Веста »» Лада Иксрей »» Лада Приора »» Лада Гранта »» Лада Калина 1/2 »» Шевроле Нива »» Лада Нива 4×4 »» ВАЗ 2108-2115 »» ВАЗ 2110-2112 »» Лада Ларгус »» Датсун »» ВАЗ 2101-2105-2107 (Классика) » Накладки на зеркала »» Лада Веста »» Лада Приора »» Лада Гранта »» Лада Калина 1/2 »» Лада Нива 4×4 »» Датсун »» ВАЗ 2108-2109; 2113-2115 »» ВАЗ 2110-2111-2112 »» Шевроле Нива »» Ларгус, Дастер » Евроручки » Накладки на ручки » Сабли (планки номера) » Молдинги » Накладки на пороги внешние » Накладки кузова / бампера / Cross » Спойлера » Рамки ПТФ » Жабо » Плавники на крышу » Фаркопы » Защита порогов »» Лада Нива 4×4 »» Шевроле Нива »» Лада Иксрей » Навесная защита » Рейлинги и комплектующие » Дефлекторы » Автобоксы / автопалатки » Рамки на номера » Знаки и наклейки » Брызговики и подкрылки » Автостекла » Прочее для внешнего тюнинга » Материалы для установки » Шноркели Салон » Европанели и комплектующие » Обивки дверей »» Лада Приора »» Лада Калина »» Лада Гранта »» ВАЗ 2110-2111-2112 »» ВАЗ 2108-2109-2115 »» Лада Нива 4х4 »» Шевроле Нива »» ВАЗ 2101-2105-2107 » Комплектующие обивок дверей » Обивка багажника и капота » Бесшумные замки ВАЗ » Центральная консоль » Коврики в салон »» Лада Веста »» Лада Иксрей »» Лада Приора »» Лада Гранта »» Лада Калина »» Лада Нива 4х4 »» Datsun on-Do, mi-Do »» Шевроле Нива | Нива Тревел »» Лада Ларгус »» ВАЗ 2110-2111-2112 »» ВАЗ 2108-2114-2115 »» ВАЗ 2101-2105-2107 »» УАЗ »» Renault »» Nissan »» Chevrolet »» Mitsubishi »» Mercedes »» Opel »» Peugeot »» Porsche »» Audi »» BMW »» Citroёn »» Daewoo »» Ford »» Hyundai »» Kia »» Volkswagen » Ковролин пола / багажника » Рули »» Лада Веста »» Лада Иксрей »» Лада Приора »» Лада Гранта »» Лада Калина »» Лада Нива 4х4 »» Datsun on-Do, mi-Do »» Шевроле Нива »» ВАЗ 2110-2111-2112 »» ВАЗ 2108-2114-2115 »» ВАЗ 2101-2105-2107 » Муляжи подушек / подушки безопасности » Кожух руля » Подрулевые переключатели » Ручки КПП и ручника » Накладки на педали » Сидения, чехлы и комплектующие » Обогрев сидений » Подлокотники / подголовники » Выкидные и заводские ключи / чипы » Блоки управления / Кнопки » Ремни безопасности » Накладки на пороги » Уплотнители дверей | багажника | стекол »» Лада Веста »» Лада Икс Рей »» Лада Гранта, Гранта FL »» Лада Калина, Калина 2 »» Лада Приора »» Лада 4х4 (Нива) »» Шевроле/Лада Нива »» ВАЗ 2108, 2109, 21099 »» ВАЗ 2110, 2111, 2112 »» ВАЗ 2113, 2114, 2115 »» ВАЗ 2101-2107 (Классика) » Обивка потолка »» Лада Гранта, Гранта FL »» Лада Калина, Калина 2 »» Лада Приора »» Лада 4х4 (Нива) »» Шевроле/Лада Нива »» ВАЗ 2108, 2109, 21099 »» ВАЗ 2113, 2114, 2115 »» ВАЗ 2110, 2111, 2112 »» ВАЗ 2101-2107 (Классика) »» Лада ОКА » Плафоны | подсветка салона » Солнцезащитные козырьки » Облицовки | обшивки | прочее для салона »» Лада Веста »» Лада Иксрей »» Лада Приора »» Лада Гранта »» Лада Калина »» Лада Нива 4х4 »» Datsun on-Do, mi-Do »» Шевроле Нива »» ВАЗ 2110-2111-2112 »» ВАЗ 2108-2114-2115 »» ВАЗ 2101-2105-2107 »» Лада Ларгус Полки, подиумы, короба » Лада Веста » Лада Приора » Лада Калина » Лада Гранта » Лада Ларгус » Шевроле Нива » ВАЗ 2110-2112 » ВАЗ 2113-2115 » ВАЗ 2108-21099 » ВАЗ 2105-2107, Нива 4х4 » Ford » Chevrolet » KIA » Hyundai » Разное (Mazda, Opel, Skoda, Renault, Daewoo) Автомобильная оптика » Стандартная оптика »» Лада Веста »» Лада Икс Рей »» Лада Гранта, Гранта FL »» Лада Калина, Калина 2 »» Датсун »» Лада Ларгус »» Лада Приора »» Лада 4х4 (Нива) »» Шевроле/Лада Нива »» ВАЗ 2108, 2109, 21099 »» ВАЗ 2110, 2111, 2112 »» ВАЗ 2113, 2114, 2115 »» ВАЗ 2101-2107 (Классика) » Фары передние тюнинг »» Лада Веста »» Лада Приора »» Лада Гранта »» Лада Калина »» Лада Нива 4х4 »»» Передние фары »»» Подфарники »» Шевроле Нива »» ВАЗ 2108-2109-21099 »» ВАЗ 2113-2114-2115 »» ВАЗ 2110-2111-2112 »» ВАЗ 2101-2105-2107 » Задние фонари тюнинг »» Лада Веста »» Лада Приора »» Лада Гранта »» Лада Калина »» Лада Нива 4х4 »» Лада Ларгус »» ВАЗ 2108-2109-2115 »» ВАЗ 2110-2111-2112 »» ВАЗ 2101-2105-2107 » Противотуманные фары (ПТФ) »» Лада Веста »» Лада Икс Рей »» Лада Гранта, Гранта FL »» Лада Калина, Калина 2 »» Лада Ларгус »» Лада Приора »» Лада 4х4 (Нива) »» Шевроле/Лада Нива »» ВАЗ 2110, 2111, 2112 »» ВАЗ 2113, 2114, 2115 »» Иномарки »»» Renault (Рено) »»» Ford (Форд) »»» Volkswagen (Фольксваген) » Поворотники (повторители поворота) » Дневные ходовые огни » Ангельские глазки » Ксенон » Галогеновые лампы » Электрокорректоры фар » Комплектующие для установки » Светодиодные балки » Светодиодные лампы Электроника » Бортовые компьютеры » Электронные комбинации приборов » Стробоскопы » Блоки управления двигателем (ЭБУ) » Блоки управления двигателем для Е-газа » Радар-детекторы » Корректоры Е-газа ВАЗ, ГАЗ, УАЗ » Корректоры Е-газа Иномарки » Камеры заднего вида » Парктроники » Блоки управления подушкой безопасности » Реле, автосвет, прочее » Музыка Сигнализации и противоугонные системы » Автосигнализации » Блокираторы руля » Чехлы для брелков Тонировка / шторки / пленка для кузова » Съемная тонировка » Тонировочная пленка » Солнцезащитные шторки » Пленки для кузова » Тонировочный лак » Водоотталкивающая пленка Стандартные запчасти ВАЗ » Топливная система / бензобаки »» Баки топливные »» Бензонасосы и комплектующие »» Крышки и клапаны » Крышки двигателя » Уплотнители / утеплители / шумоизоляция » Стеклоподъемники » Шкивы коленвала » Толкатели гидравлические » Радиатор / система кондиционирования » Стартеры » Модули и катушки зажигания » Бачки омывателя » Высоковольтные провода » Водяные помпы » Датчики скорости » Жгуты проводов »» Жгуты проводов для ВАЗ 2101-2107 »» Жгуты проводов для ВАЗ 2108-21099 »» Жгуты проводов для ВАЗ 2113-2114 »» Жгуты проводов для ВАЗ 2110-2112 »» Жгуты проводов для Lada Kalina 1/2 »» Жгуты проводов для Lada Priora »» Жгуты проводов для Lada 4х4 »» Жгуты проводов для Сhevrolet Niva »» Жгуты проводов для Lada Granta »» Жгуты проводов для Lada Largus »» Жгуты проводов для Lada Xray »» Жгуты проводов для Lada Vesta »» Жгуты проводов для UAZ Patriot » Генераторы и комплектующие » Фильтры » Шаровые опоры » Резисторы электронного вентилятора отопителя » Свечи зажигания » Электродвигатели отопителей » Буксировочные крюки » Замки зажигания » Щетки стеклоочистителя » Вентиляторы и комплектующие » Система смазки. Комплектующие » Маховики и комплектующие » Термостаты и комплектующие Аксессуары » Звуковые сигналы » USB зарядники » Компрессоры / Насосы » Комплектующие колес » Автоодеяла

    Производитель:
    ВсеMotorRing

    Новинка:
    Вседанет

    Спецпредложение:
    Вседанет

    Результатов на странице: 5203550658095

    Найти

    Ремонт двигателя ВАЗ 11183 Лада Гранта

    В зависимости от комплектации на автомобили Лада Гранта, Лада Приора, Лада Калина и другие модели может быть установлен двигатель ВАЗ 11183

    Восьмиклапанные двигатели рабочим объемом 1,6 л созданы на базе двигателя ВАЗ-2111.

    Они имеют увеличенный по высоте на 2,3 мм блок цилиндров и оригинальный коленчатый вал. диаметр цилиндров оставлен прежний — 82 мм, ход поршня увеличен до 75,6 мм в отличие от 71 мм у базового двигателя.

    В опорах коренных подшипников установлены масляные форсунки.

    В головке блока цилиндров установлены один распределительный вал, восемь клапанов и восемь толкателей клапанов с регулировочными шайбами.

    Опоры распределительного вала выполнены в головке.

    К верхней плоскости головки болтами крепятся два корпуса подшипников распределительного вала.

    Сверху газораспределительный механизм закрыт крышкой с маслозаливной горловиной.

    Привод распределительного вала и насоса охлаждающей жидкости осуществляется зубчатым ремнем от зубчатого шкива, установленного на коленчатом вале двигателя.

    Натяжение ремня и направление его движения по шкивам осуществляется натяжным роликом.

    Блок цилиндров — чугунный, с выточенными в нем цилиндрами.

    Внутренние полости блока для охлаждающей жидкости образованы при его литье, а каналы подачи масла выполнены сверлением.

    В нижней части блока цилиндров расположены пять опор коренных подшипников коленчатого вала.

    Крышки коренных подшипников не взаимозаменяемы и имеют маркировку порядкового номера подшипника, начиная от шкива коленчатого вала.

    В крышке второго коренного подшипника выполнены два резьбовых отверстия под болты крепления маслозаборника.

    В опоры и крышки установлены сталеалюминиевые вкладыши коренных подшипников.

    По обеим сторонам опоры третьего коренного подшипника выполнены гнезда для установки упорных полуколец, препятствующих осевому перемещению коленчатого вала.

    Переднее полукольцо — сталеалюминевое, заднее — металлокерамическое, желтого цвета с обеих сторон.

    Поршни отлиты из алюминиевого сплава. На каждом поршне установлено два компрессионных и одно маслосъемное кольцо.

    Нижнее компрессионное кольцо скребкового типа с проточкой и острой кромкой на нижней плоскости.

    Внутрь маслосъемного кольца устанавливается пружинный расширитель.

    Пальцы — плавающего типа (фиксируются в поршнях двумя пружинными стопорными кольцами) или зафиксированы в верхнюю головку шатуна методом «горячей посадки».

    В верхней головке шатуна запрессована сталебронзовая втулка.

    Крышки шатунов не взаимозаменяемы и устанавливаются на шатун только в одном положении.

    Снизу к блоку цилиндров крепится поддон картера.

    Система смазки двигателей комбинированная — под давлением и разбрызгиванием.

    Масляный насос — шестеренного типа с внутренним зацеплением и приводом от переднего конца коленчатого вала.

    Через маслозаборник, насос забирает масло из поддона картера и под давлением нагнетает в каналы системы смазки двигателя.

    Для контроля за количеством масла в поддоне установлен измерительный щуп — указатель уровня.

    Масляный фильтр — полнопоточный, с бумажным фильтрующим элементом и обратным клапаном, препятствующим вытеканию масла из каналов системы смазки в поддон картера после остановки двигателя.

    В опорах коренных подшипников установлены масляные форсунки.

    Масло из форсунок подается на внутренние поверхности поршней для их охлаждения.

    Часть масла попадает на верхние головки шатунов и через выполненные в них конические отверстия стекает на поршневые пальцы, смазывая их.

    В теле коленчатого вала просверлены каналы. По ним масло поступает к шатунным шейкам, смазывая их.

    В каналы коленчатого вала масло поступает из блока цилиндров через отверстия во вкладышах коренных подшипников и коренных шейках.

    Технологические отверстия каналов закрыты стальными штампованными заглушками.

    С левой стороны блока выполнена полость для установки насоса охлаждающей жидкости и прилив для установки масляного фильтра.

    Генератор приводится в действие поликлиновым ремнем от шкива коленчатого вала двигателя.

    Ресивер впускного трубопровода выполнен из пластмассы. Выпускной коллектор — стальной, совмещен с каталитическим нейтрализатором, Его соединение с головкой уплотняется двухслойной металлической прокладкой.

    Статьи по ремонту двигателя объединены в один раздел.

    Снятие и установка распределительного вала ВАЗ-11183

    Как отрегулировать зазоры клапанов двигателя 11183

    Замена ремня привода ГРМ двигателя 11183

    Особенности двигателя ВАЗ — 11183

    11183120300820 Коллектор 11183 2114 выпускной (дв.1.6 8 кл 2 датчика) без нейтрализатора LADA

    • Главная /
    • Бренды /
    • Lada /
    • Lada 11183120300820 Коллектор 11183 2114 выпускной (дв.1.6 8 кл 2 датчика) без нейтрализатора
    Штрихкод2000403141780, 2200000828187

    Информация для покупателей

    Информация по аналогам имеет исключительно справочный характер и не гарантирует совместимость с вашим автомобилем! Если Вы не уверены в том, что выбранная Вами деталь подходит к Вашему транспортному средству — обратитесь за помощью к менеджеру по подбору запчастей. Цены указаны при заказе физическими лицами на сайте.

    Фильтр

    • срок доставки
    • Доступное количество
    • Сбросить

    Размещённая на сайте информация (описание, технические характеристики а так же фотографии) приведена для ознакомления и не является публичной офертой. Не может служить основанием для предъявления претензий в случае изменения характеристик, комплектности и внешнего вида товара производителем без уведомления.

     

    Почему покупают 11183120300820 Коллектор 11183 2114 выпускной (дв.1.6 8 кл 2 датчика) без нейтрализатора LADA у нас:

    «Автолюбитель» — крупнейший автомобильный супермаркет на Юге Кузбасса. Он открыт в 1987 году и с тех пор является центром автомобильной торговли в городе Новокузнецке. Являемся поставщиком товарной марки LADA на территории Новокузнецка, Кемеровской области РФ, у нас несколько складов по наличию и имеем запчасти на редкие автомобили и готовы дать хорошую цену на Коллектор 11183 2114 выпускной (дв.1.6 8 кл 2 датчика) без нейтрализатора 11183120300820 бренда LADA.

    На все детали бренда LADA предоставляется гарантия.

     

    Цена на 11183120300820 Коллектор 11183 2114 выпускной (дв.1.6 8 кл 2 датчика) без нейтрализатора:

    Получить цену на оригинальную или аналоговую запчасть Коллектор 11183 2114 выпускной (дв.1.6 8 кл 2 датчика) без нейтрализатора, и знать лучший срок доставки, которая будет удобна для вас, можно позвонив нашему менеджеру. Наши продавцы-консультанты всегда рады видеть Вас и всегда готовы оказать Вам квалифицированную услугу.

    Телефон: 

    +7 (906) 924-13-37

    Или отправить VIN-запрос на нашем ресурсе и менеджер вам сам перезвонит.

     
    Как заказать LADA 11183120300820:

    1. Определиться со сроками, выбрать количество и добавить Коллектор 11183 2114 выпускной (дв.1.6 8 кл 2 датчика) без нейтрализатора в корзину.

    2. Оформить заказ, выбрать тип получения товара и тип оплаты.

    3. Если товар в наличии — Вы можете буквально сразу получить свой товар в нашей точке выдачи.

    11183340001001 Механизм рулевой ВАЗ-11183 АвтоВАЗ — 11183-3400010-01 11183340001001

    11183340001001 Механизм рулевой ВАЗ-11183 АвтоВАЗ — 11183-3400010-01 11183340001001 — фото, цена, описание, применимость. Купить в интернет-магазине AvtoAll.Ru Распечатать

    5

    1

    Применяется: ВАЗ

    Артикул: 11183-3400010-01еще, артикулы доп.: 11183340001001скрыть

    Код для заказа: 105410

    Добавлено пользователем

    9 115 ₽

    В корзину

    Способы оплаты: Наличные при получении VISA, MasterCard, МИР, Google Pay Долями Оплата через банк Производитель: LADA Получить информацию о товаре или оформить заказ вы можете по телефону 8 800 6006 966. Есть в наличии

    Доступно для заказа5 шт.Данные обновлены: 01.04.2022 в 16:30

    Код для заказа 105410 Артикулы 11183-3400010-01, 11183340001001 Производитель LADA Каталожная группа: ..Управление рулевое
    Механизмы управления
    Ширина, м: 0.2 Высота, м: 0.1 Длина, м: 1.2 Вес, кг: 9.1

    Отзывы о товаре

    Вопрос-ответ

    Задавайте вопросы и эксперты
    помогут вам найти ответ

    Где применяется

    Сертификаты

    Обзоры

    Статьи о товаре

    • «Хрустальные» ВАЗы: Лада Гранта и Лада Ларгус 9 Апреля 2013

      Сегодня в очередной статье серии ««Хрустальные» ВАЗы или типичные поломки отечественных автомобилей» речь пойдёт о последних разработках Волжского автомобильного завода: Ладе Гранте и Ладе Ларгус. Расскажем об истории создания этих моделей, а также об их характерных неисправностях.

    • «Хрустальные» ВАЗы: «Восьмёрка», Калина, Приора 26 Марта 2013

      Серия статей ««Хрустальные» ВАЗы, или типичные поломки отечественных автомобилей» рассказывает о характерных проблемах и неполадках машин, выпускаемых Волжским автомобильным заводом. Сегодня мы поговорим о переднеприводном семействе «Самара», а также его современных аналогах.

    • Механизм рулевой ВАЗ-11183 АвтоВАЗ Артикул: 11183-3400010-01, 11183340001001 Код для заказа: 105410

      9 115 ₽

      или оформите заказ по телефону 8 800 6006 966
    Наличие товара на складах и в магазинах, а также цена товара указана на 01.04.2022 16:30.

    Цены и наличие товара во всех магазинах и складах обновляются 1 раз в час. При достаточном количестве товара в нужном вам магазине вы можете купить его без предзаказа.

    Интернет-цена — действительна при заказе на сайте или через оператора call-центра по телефону 8 800 6006 966. При условии достаточного количества товара в момент заказа.

    Цена в магазинах — розничная цена товара в торговых залах магазинов без предварительного заказа.

    Срок перемещения товара с удаленного склада на склад интернет-магазина.

    Представленные данные о запчастях на этой странице несут исключительно информационный характер.

    883d3c831ceb08cd09d5241b261410c0

    Добавление в корзину

    Код для заказа:

    Доступно для заказа:

    Кратность для заказа:

    Добавить

    Отменить

    Товар успешно добавлен в корзину

    !

    В вашей корзине на сумму

    Закрыть

    Оформить заказ

    Слайд-гитара… | Fender Stratocaster Guitar Forum

    Что ж, слайд — это моя фишка. Я играю 7 различных строев (все открытые строи связаны между собой), а также сам научился играть на металлической пластине. То, о чем вы говорите, — это двойное демпфирование, демпфирование за слайдом пальцем и использование пальца на отдельных струнах для подавления шума вашей рукой. Это сложно понять, но как только вы это сделаете, ваши лиды станут очень чистыми. Если вы умеете играть пальцами, вы уже на верном пути. Вам нужно сконцентрироваться на том, чтобы поочередно класть палец на неиспользуемые струны.Что-то вроде курицы. Просто потренируйтесь с 4-й и 3-й струнами, используя большой и 1-й пальцы, попеременно играя на каждой, помещая нещипковый палец на неиспользуемую струну, чтобы заглушить ее. как только вы освоитесь с этим, переходите к другим струнным группам с другими пальцами — через некоторое время вы можете играть на банджо, грабли и многое другое, что люди делают в стандарте.

    Теперь, если вы используете кирку, это становится сложнее, но не невозможно. Если у вас уже есть гибридный медиатор, используйте основание руки для демпфирования, перемещая всю руку вверх или вниз во время игры.

    Вы также можете использовать эту технику, если используете только кирку.

    Я предпочитаю пальцы, но многие игроки очень хорошо играют медиатором, так что выбирайте то, что вам удобно.

    В отношении других указателей: никогда не двигайтесь прямо к заметке — скользите вверх или вниз по заметке.
    3 лада вверх — это волшебство — скажем, вы играете в открытой соль (мой любимый) и играете аккорд E на 9-м ладу, скользите по 2-й или 3-й струне до 12-го, что приводит вас к предложенной ноте Em7.Это дает вам душу!

    Не нажимайте: сделайте слайд с достаточным весом, чтобы издавать звук, слайд должен скользить по струнам a little

    Иногда не быть прямо над ладом тоже может звучать круто, с двумя гит-игроками это создает небольшой эффект хора вживую.

    Позвольте слайду сделать всю работу — расслабьте руку, а иногда просто водите ею по струнам во время игры, чтобы посмотреть, что получится.Также очень важно в вибрато: расслабьтесь и взмахните слайдом, и ваше вибрато будет выгибаться над струнами вместо того, чтобы быть прямым на всех струнах.

    СЛУШАЙ! это гораздо важнее, чем быть технически точным, скольжение зависит больше от прикосновения и ощущения, чем от того, чтобы быть на месте — закройте глаза, скользите вверх по шее, пока не услышите, что правильно. Подыграйте уже знакомой вам песне — вы будете удивлены тем, как легко и весело играть слайдом, как только вы освоите всего несколько приемов.

    Если вы хотите играть слайд и стандарт на одном и том же гитаре, поднимите действие на четверть оборота хвостовика или седла, если это не сработает, сделайте еще четверть оборота.На самом деле я могу играть на любом мерзавце, несмотря на экшен, но я давно этим занимаюсь.

    Я надеюсь, что это поможет

    Чтобы понять, о чем я говорю: Перейдите на You Tube и посмотрите грузовики Дерека или Уоррена Хейнса (правительственный мул), они очень хороши в этом.

    Sargeslide

    В тренде: рост Кеселовски в социальных сетях — В тренде — ESPN Playbook

    Мы сделали это!#NASCAR twitter.com/keselowski/sta…

    — Брэд Кеселовски (@keselowski) 18 ноября 2012 г.

    Брэд Кеселовски (@Keselowski) доминировал в NASCAR в этом году как на трассе, так и в Твиттере, собирая больше более 265 000 подписчиков после его твита о взорвавшемся бензовозе во время задержки из-за дождя первой Daytona 500 в прайм-тайм в феврале.Он набрал более 135 000 подписчиков в ночь на 500, а его взрывной пост и последовавшая за ним переписка в Твиттере с фанатами стали буквально горячей точкой для продвижения спорта в социальных сетях. Ожидается, что этот цифровой привод ускорится еще больше после того, как 1 января NASCAR приобретет веб-сайт NASCAR.com, а в 2014 году, возможно, даже появится «цифровая кабина». Miami Speedway и не стал ждать, чтобы поделиться этим моментом со своими более чем 330 000 подписчиков, опубликовав вышеприведенную фотографию из своей машины после гонки.В день чемпионата он набрал около 6000 подписчиков.

    На прошлой неделе Кеселовски был оштрафован на 25 000 долларов за то, что опубликовал в Твиттере фотографию во время задержки гонки NASCAR Phoenix. В течение недели он сказал, что не собирается оспаривать штраф, который по совпадению последовал за ненормативной лексикой во время его пресс-конференции после гонки, но был озадачен штрафами, сказав, что он «много запутался. Я просто добавлю это к список.» Он был оштрафован в соответствии с правилом NASCAR (разделы 12-1 и 20-6.7A), которое запрещало водителям перевозить портативные электронные устройства в своей машине, а не, по словам официальных лиц, конкретно за твиты.

    «Итог: после Дейтоны наши участники соревнований сообщали каждой гоночной команде в течение следующих нескольких соревнований, что телефоны не разрешены в автомобилях», — сказал Playbook на прошлой неделе исполнительный вице-президент NASCAR Стив О’Доннелл. «Водителям разрешено твитить во время красного флага, если они находятся вне своих машин. Это было первое визуальное доказательство того, что у нас был водитель с телефоном в машине во время мероприятия. … Это не имеет ничего общего с твитом, скорее потенциальное конкурентное преимущество, которое может быть получено на основе сегодняшней технологии.

    Штраф на прошлой неделе вызвал крики лицемерия со стороны болельщиков, водителей и даже Ричарда Петти, поскольку NASCAR использовала вирусный успех его твитов во время Daytona 500 в качестве трамплина. ., и во время задержки из-за дождя в Ричмонде, штат Вирджиния, в начале этого сезона, каждый раз избегая штрафов. Кеселовски опубликовал свой последний твит перед гонкой в ​​воскресенье примерно за 45 минут до ее начала. Затем он сдал свой телефон и хранил молчание в социальных сетях до тех пор, пока его праздничный пост, в котором не хватало только хэштега #Чемпион.

    Не ожидайте, что NASCAR наложит здесь какие-либо штрафы или дополнительные санкции, поскольку этот пост был опубликован после гонки, а Кеслевски является чемпионом Кубка спринта, хотя официально он находится на испытательном сроке до 31 декабря.

    Кеселовски был осыпан похвалы в социальных сетях вместе с владельцем Роджером Пенске, еще одним первым победителем Sprint Cup. Клинт Бойер занял второе место в турнирной таблице, несмотря на аварию в Фениксе, вызванную Джеффом Гордоном:

    Поздравляем @keselowski и всех в Penske Racing.Удивительно видеть, как КАПИТАН получает заслуженный титул! #props

    — Клинт Бойер (@ClintBowyer) 19 ноября 2012 г.

    Джимми Джонсон, который занял второе место в воскресной гонке в погоне за кубком спринта, финишировал третьим после того, как покинул гонку за 40 кругов до финиша из-за механических проблем.

    Ты покупаешь пиво в Вегасе. @clintbowyer: Не могу поверить, что мы заняли второе место. Я даже не знал, что это математически возможно.

    — Джимми Джонсон (@JimmieJohnson) 19 ноября 2012 г.

    Бугити, бугити … неважно:

    @keselowski Если бы я был на 20 лет моложе, я бы хотел отпраздновать с вами, ребята, сегодня вечером, не ждите, лучше сделайте это на 30 лет моложе! Время летит!

    — Даррелл Уолтрип (@AllWaltrip) 19 ноября 2012 г.

    Теперь, если бы они только могли вернуть Мичиганский футбол в национальный чемпионат, фото:

    ПОЗДРАВЛЯЕМ @keselowski с победой в первом кубке @nascar Sprint Cup! Стоит поспешить из Юджина, чтобы быть здесь и увидеть это лично.

    — Десмонд Ховард (@DesmondHoward) 18 ноября 2012 г.

    Кеселовски — уроженец Рочестера, штат Мичиган.

    @Keselowski чирикает, не волнуйтесь. До Daytona 500 2013 года осталось всего 97 дней. Но вполне вероятно, что в промежутке вы будете много слышать от него.

    В другом месте:

    • Это заставляет задуматься, как мы выживали все эти годы без Твиттера и Интернета, если уж на то пошло.

    RT @mckaylamaroney Я только что сделал лицо «Не впечатлен» с президентом..? // Да. twitter.com/whitehouse/sta…

    — Белый дом (@whitehouse) 17 ноября 2012 г.

    Эта фотография, опубликованная Белым домом в субботу, была сделана во время визита в четверг в Белый дом с участием МакКайлы Марони и ее » Товарищи по команде Fierce Five, завоевавшие золотые медали по олимпийской гимнастике. Они пропустили более ранний визит других олимпийцев в этом году из-за своего гастрольного графика. Аппетит подогрел этот пост после поездки:

    Я только что сделал лицо Не впечатлило с президентом..?

    — McKayla Maroney (@McKaylaMaroney) 15 ноября 2012 г.

    Национальный тур гимнасток завершился в воскресенье вечером выступлением в Barclays Center в Бруклине:

    Очень жаль, что тур закончился!!! Буду очень скучать по всем

    — Кайла Росс (@kyla_ross96) 19 ноября 2012 г.

    • Сарказм возобладал над сочувствием в Твиттере в воскресенье вечером, когда появились новости о тайт-энде Патриотов Робе Гронковски, который сломал руку во время попытки набрать дополнительное очко. после финального приземления победы Новой Англии над Кольтами со счетом 59–24.Ожидается, что Гронковски пропустит не менее четырех недель.

    Гронк ломает руку, когда Беличик набирает очки. Это как Дарт Вейдер отрубил Люку руку? #DarkSide

    — CaptainTouchback (@CaptTouchback) 19 ноября 2012 г.

    • Нападающий «Юты» Коулман Петерсен забил гол в этой предсказанной фальшивой попытке броска с игры после того, как получил мгновенный пас от игрока/заполнителя Шона Селлвуда во время субботнего проигрыша со счетом 34-24 Аризона. Игра дала Юте раннее преимущество 7-3.

    Будьте замечены.Если вы видите в сети что-то, что должно быть в тренде, спортивные видеоролики, достойные вируса, или необычные спортивные твиты, передайте их мне @billsperos или [email protected]

    Взаимодействие домена аполипопротеина E4 в живых нейрональных клетках, определяемое переносом энергии флуоресцентного резонанса

    https://doi.org/10.1074/jbc.M311256200Get rights and content Хотя механизмы еще предстоит определить, пагубные эффекты апоЕ4 в нейробиологии должны быть основаны на его уникальных структурных и биофизических свойствах.Одним из таких свойств является доменное взаимодействие, опосредованное солевым мостиком между Arg-61 в N-концевом домене и Glu-255 в C-концевом домене апоЕ4. Это взаимодействие, которое не происходит в ароЕ3 или ароЕ2, заставляет ароЕ4 предпочтительно связываться с определенными липопротеиновыми частицами 90-128 in vitro 90-129 и 90-128 in vivo 90-129 . Здесь мы использовали перенос энергии флуоресцентного резонанса (FRET), чтобы определить, происходит ли взаимодействие домена апоЕ4 в живых нейронных клетках. Клетки Neuro-2a трансфицировали конструкциями, кодирующими ароЕ3 или ароЕ4, в которых желтый флуоресцентный белок (YFP) был слит с N-концом, а голубой флуоресцентный белок (CFP) был слит с С-концом.Чтобы генерировать сигнал FRET, который можно обнаружить с помощью спектральной конфокальной микроскопии, меченые концы N и C должны находиться в непосредственной близости (<100 Å). Сигналы FRET возникали в клетках, трансфицированных YFP-apoE4-CFP, но не в клетках, трансфицированных YFP-apoE3-CFP, что свидетельствует о том, что N- и C-концы ароЕ4 находятся в непосредственной близости в живых клетках, а концы апоЕ3 - нет. Сигналы FRET не возникали в клетках, котрансфицированных YFP-apoE4 и apoE4-CFP, что позволяет предположить, что FRET в клетках, трансфицированных YFP-apoE4-CFP, был внутримолекулярным.Мутация Arg-61 в Thr или Glu-255 в Ala в apoE4, которая нарушает взаимодействие доменов, отменяет FRET в клетках Neuro-2a, убедительно указывая на то, что FRET в клетках YFP-apoE4-CFP был вызван взаимодействием доменов. Клетки, продуцирующие ApoE4, секретировали меньше фосфолипидов, чем клетки, продуцирующие ароЕ3, но после нарушения взаимодействия доменов в ароЕ4 секреция фосфолипидов увеличивалась до уровней, наблюдаемых с ароЕ3, что указывает на то, что взаимодействие доменов снижает способность апоЕ4 связывать фосфолипиды. Таким образом, взаимодействие домена ароЕ4 происходит в живых нейрональных клетках и может быть молекулярной основой нейродегенерации, связанной с апоЕ4.

    Рекомендуемые статьи

    © 2004 ASBMB. В настоящее время издается Elsevier Inc.; первоначально опубликовано Американским обществом биохимии и молекулярной биологии.

    {{ Страница.название() }}

    Переключить навигацию
    • Авторизоваться
    • Зарегистрироваться
    • Выход
    • {{Логин (Email}} {{счетчик сообщений}}
      • Личный дом
      • Мои активные объявления
      • Мои сообщения {{счетчик сообщений}}
      • Избранные объявления
      • Сохраненный поиск
      • Мои премиальные объявления
      • Пользовательские платежи и кредиты
      • Мои настройки
      • Выход
    • Разместить бесплатное объявление
    • Авторизоваться
    • Зарегистрироваться
    • Выход
    • {{Логин (Email}} {{счетчик сообщений}}
    • Управление моими объявлениями
    • Разместить бесплатное объявление
    СПРОСИТЕ ЗАБРОНИРОВАТЬ

    {{место нахождения}}

    Предыдущее объявление Список Следующее объявление {{showSubcatname}} Изменить сведения о своем объявлении

    Назад

    • Поиск
    × × × Дома Авторизоваться Продавать Мои объявления Чат Дома Продавать Мои объявления Чат {{счетчик сообщений}} Настройки
    • Условия и положения Политика листинга Политика конфиденциальности Советы по безопасности Помощь и часто задаваемые вопросы Карьера О нас Правила размещения объявлений

    ESP TA-204 Обзор | Хордер.ком

    Как голос Slayer, Том Арайя должен быть на вершине своей вокальной игры каждый раз, когда группа выходит на сцену или в студию. Кроме того, он был и остается единственным басистом группы с момента ее образования в 1981 году. И имея репутацию самой быстрой, громкой и агрессивной группы в металлическом сообществе, Том должен держать свои отбивные на грифе свежими и более чем хорошо отрепетированными.В 2015 году серия подписей Тома ESP и LTD становится богаче, поскольку ESP представляет новый LTD TA-204. Это прочная бас-гитара с двойной насечкой, мензурой 35 дюймов, ультраагрессивным дизайном и простой конструкцией. Массивный и скошенный корпус из липы этой модели соединен со стандартным грифом из клена с помощью болтового соединения. ESP устанавливает хамбакеры ESP Designed LH-301.Эти пассивные мыльницы поставляются с небольшим, но очень универсальным блоком управления громкостью, мастер-тоном и тремя позициями.Также стоит отметить такие особенности, как: мензура 35 дюймов, современные колки LTD и инкрустации пентаграммы на головке грифа.

    Chorder.com


    ESP TA-204 еще не оценен.0

    Нажмите на звезды, чтобы оценить

    Вы оценили звезды из 5, Убери это

    Вы оценили звезды из 5, Убери это

    Вы оценили звезды из 5, Убери это

    Надежность/ценность 0.00/5

    Вы оценили звезды из 5, Убери это

    Произошла ошибка при настройке пользовательского файла cookie

    Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности.Если ваш браузер не принимает файлы cookie, вы не можете просматривать этот сайт.


    Настройка браузера для приема файлов cookie

    Существует множество причин, по которым файл cookie не может быть установлен правильно. Ниже приведены наиболее распространенные причины:

    • В вашем браузере отключены файлы cookie. Вам необходимо сбросить настройки браузера, чтобы принять файлы cookie, или спросить вас, хотите ли вы принимать файлы cookie.
    • Ваш браузер спрашивает, хотите ли вы принимать файлы cookie, и вы отказались.Чтобы принять файлы cookie с этого сайта, нажмите кнопку «Назад» и примите файл cookie.
    • Ваш браузер не поддерживает файлы cookie. Попробуйте другой браузер, если вы подозреваете это.
    • Дата на вашем компьютере в прошлом. Если часы вашего компьютера показывают дату до 1 января 1970 г., браузер автоматически забудет файл cookie. Чтобы это исправить, установите правильное время и дату на своем компьютере.
    • Вы установили приложение, которое отслеживает или блокирует установку файлов cookie.Вы должны отключить приложение при входе в систему или проконсультироваться с системным администратором.

    Почему этому сайту требуются файлы cookie?

    Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности, запоминая, что вы вошли в систему, когда переходите со страницы на страницу. Предоставить доступ без файлов cookie потребует от сайта создания нового сеанса для каждой посещаемой вами страницы, что замедляет работу системы до неприемлемого уровня.


    Что сохраняется в файле cookie?

    Этот сайт не хранит ничего, кроме автоматически сгенерированного идентификатора сеанса в файле cookie; никакая другая информация не фиксируется.

    Как правило, в файле cookie может храниться только та информация, которую вы предоставляете, или выбор, который вы делаете при посещении веб-сайта. Например, сайт не может определить ваше имя электронной почты, если вы не решите ввести его. Разрешение веб-сайту создавать файлы cookie не дает этому или любому другому сайту доступ к остальной части вашего компьютера, и только сайт, создавший файл cookie, может его прочитать.

    Медленный перенос протона в сочетании с разворачиванием объясняет загадочные результаты экспериментов с одной молекулой BBL, парадигматическим белком, складывающимся вниз по склону

    Abstract

    Ряд термодинамических, кинетических и структурных подходов показал, что малый α-спиральный белок BBL складывается-разворачивается по сценарию с одним состоянием.Тем не менее, спектроскопия флуоресценции одиночных молекул предлагает более противоречивую точку зрения. Эксперименты с одной молекулой при pH 6 показывают уникальный полуразвернутый конформационный ансамбль при средней денатурации, тогда как другие эксперименты, проведенные при более высоком pH, показывают бимодальное распределение, как и ожидалось для сворачивания в двух состояниях. Здесь мы используем термодинамические и лазерные эксперименты по кинетике Т-скачка в сочетании с теоретическим моделированием для исследования зависимости от рН стабильности ББЛ, кинетики и механизма сворачивания в диапазоне рН 6–11.Мы обнаружили, что разворачивание BBL тесно связано с протонированием одного из его остатков с кажущимся pK a , равным ~7. Следовательно, в экспериментах по химической денатурации при нейтральном pH BBL постепенно разворачивается, а также бинарно превращается в протонированные частицы. Более того, в условиях эксперимента с одной молекулой (средняя точка денатурации и 279 К) мы наблюдаем, что перенос протона происходит намного медленнее, чем кинетика складывания-развертывания BBL, составляющая ~15 микросекунд. Кинетика релаксации явно двухфазная, а общее время релаксации (т.е. 0,2–0,5 мс) становится контролируемой стадией переноса протона. Затем мы показываем, что простая теоретическая модель фолдинга белка в сочетании с переносом протона количественно объясняет все эти результаты, а также два набора экспериментов с одной молекулой, включая их более загадочные особенности. Интересно, что этот анализ предполагает, что BBL разворачивается по механизму нисходящего сворачивания с одним состоянием при любых условиях. Соответственно, источником бимодальных распределений, наблюдаемых при денатурации при рН 7–8, является расщепление уникального конформационного ансамбля ББЛ на две медленно взаимопревращающиеся протонирующие частицы.И непротонированные, и протонированные формы разворачиваются постепенно (односостояние вниз по склону), но они демонстрируют разную степень развертывания в любых заданных условиях, потому что нативная структура менее стабильна для протонированной формы.

    Образец цитирования: Черминара М., Кампос Л.А., Раманатан Р., Муньос В. (2013) Медленный перенос протона в сочетании с разворачиванием объясняет загадочные результаты экспериментов с одной молекулой на BBL, парадигматическом белке, сворачивающемся вниз по склону. ПЛОС ОДИН 8(10): е78044.https://doi.org/10.1371/journal.pone.0078044

    Редактор: Emanuele Paci, University of Leeds, United Kingdom

    Получено: 25 июля 2013 г.; Принято: 17 сентября 2013 г.; Опубликовано: 28 октября 2013 г.

    Авторские права: © 2013 Cerminara et al. Это статья с открытым доступом, распространяемая в соответствии с лицензией Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания оригинального автора и источника.

    Финансирование: Работа выполнена при поддержке грантов BFU2008-03237, BIO2011-28092 и CONSOLIDER CSD2009-00088 Министерства экономики и конкурентоспособности Испании (MINECO) и гранта MOLRHEOSTAT AG-ERC 323059 Европейского исследовательского совета. Спонсоры не участвовали в разработке исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

    Конкурирующие интересы: Авторы заявили об отсутствии конкурирующих интересов.

    Введение

    В течение десятилетий наш взгляд на фолдинг белков ограничивался отсутствием информации о фундаментальных аспектах, что ограничивало интерпретацию экспериментальных данных. Наиболее важная проблема связана с определением того, насколько кооперативным является фолдинг белка, или, другими словами, насколько тесно он связан с процессом с двумя состояниями. Ранние кинетические эксперименты показали, что многие однодоменные белки сворачиваются от секунд до минут [1]. По сравнению с бимолекулярными газофазными реакциями такие медленные скорости фолдинга были приняты как свидетельство того, что развернутое и нативное состояния разделены высоким барьером свободной энергии в соответствии с двухуровневой моделью [2].Последующее обобщение модели с двумя состояниями для анализа термодинамических [3] и кинетических данных [4] укладки белков привело к чрезмерно упрощенному представлению, согласно которому любые отклонения от двух состояний объяснялись экспериментальной неопределенностью. Тогда экспериментаторы естественно предположили, что фолдинг однодоменных белков должен быть кооперативным по своей природе [1]. Напротив, теория энергетического ландшафта предположила, что источником складывания барьеров свободной энергии является несинхронная компенсация между уменьшением конформационной энтропии и энергии стабилизации, связанной с реакциями складывания, и, таким образом, эти барьеры по своей природе малы [5].Теория также предсказала, что в некоторых случаях складчатость может происходить путем диффузии в безбарьерном ландшафте свободной энергии (нисходящая складчатость) [6]. Эти идеи совпали с наблюдениями ранних компьютерных симуляций с использованием крупнозернистых моделей, которые систематически давали крайне низкую кооперативность фолдинга [7]. Как следствие, существовал глубокий разрыв между экспериментом и теорией укладки белков.

    Такое положение вещей резко изменилось за последние 15 лет. Развитие сверхбыстрых кинетических методов позволило измерить временные масштабы образования вторичной структуры [8], [9], закрытия петли [10] и гидрофобного коллапса [11], что привело к оценкам предела скорости складывания около 1 мкс [12] ( я.е. примерно на 7 порядков медленнее, чем столкновения молекул в газовой фазе). Такой же предел скорости фолдинга был независимо получен при наблюдении быстрой «молекулярной» фазы в кинетических экспериментах с белками микросекундного фолдинга [13]. Дальнейшее независимое подтверждение предела скорости около 1 мкс было получено в результате наблюдения сильного эффекта масштабирования размера на скорости фолдинга однодоменных белков [14]. Преобразование этих пределов скорости в предэкспоненциальный член для выражения характеристической скорости сворачивания () позволило провести термодинамический анализ свободной энергии активации, так что вклады от конформационной энтропии, энтальпии стабилизации и свободной энергии сольватации могут быть отсеяны [15].Такой анализ, примененный к нескольким белкам с медленным сворачиванием, эмпирически подтвердил, что барьеры фолдинга действительно возникают из-за ранней потери конформационной энтропии и также довольно малы, как и предсказывает теория. Точно так же ограничение скорости ~1 мкс сразу же приводит к классификации многих микросекундных сворачивающихся белков, идентифицированных в последние годы, как нисходящие или почти нисходящие папки [16].

    Параллельно достижения в аналитических процедурах, основанных на статистической механике, привели к появлению новых процедур для интерпретации данных термодинамического развертывания.Эти процедуры интерпретируют определенные отклонения от поведения двух состояний с точки зрения населенностей конформационного ансамбля, отделяющего нативное состояние от развернутого (т.е. термодинамического барьера свободной энергии для сворачивания) [17]. Например, анализ многозондовых данных о разворачивании равновесия с помощью модели статистической механики обеспечил первую экспериментальную идентификацию складчатости вниз [18]. Отнесение к складчатости вниз было позже подтверждено с полным атомным разрешением с помощью ядерного магнитного резонанса (ЯМР) [19].Аналогичные подходы, примененные к экспериментам по дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК), показали, что можно преобразовать эти идеи в аналитические методы оценки складывающихся поверхностей свободной энергии (по крайней мере, одномерных) и термодинамических барьеров [20]. Полученные таким образом термодинамические барьеры коррелируют со скоростями фолдинга, определенными кинетически [21], подтверждая прямую связь между быстрой кинетикой и равновесными проявлениями маргинальных барьеров и нисходящего фолдинга [17].

    Возможно, наибольший практический интерес представляет глобальный предел складывания вниз по склону, при котором отсутствует значительный барьер свободной энергии (т.е. барьеры ниже 1 RT ) при любых условиях эксперимента [22]. По этому сценарию белок разворачивается постепенно, заполняя единый конформационный ансамбль, демонстрирующий степень нативной структуры, которая пропорциональна уровню денатурирующего стресса (складывание вниз по склону в одном состоянии) [23], [24]. Таким образом, в средней точке денатурации белки с одноуровневым сворачиванием демонстрируют единый ансамбль полуразвернутых конформаций, а не смесь 50–50 нативных и развернутых молекул [23]. Важно отметить, что, хотя по своей природе постепенное, развертывание в одном состоянии все же дает сигмоидальные равновесные кривые развертывания [25].Основное отличие состоит в том, что пред- и постпереходные области кривой денатурации содержат значительные степени развертывания, а не являются феноменологическими базовыми линиями, предсказанными моделью с двумя состояниями [26].

    Свертывание вниз в одном состоянии было подробно изучено на маленьком α-спиральном белке BBL с использованием различных методов и подходов [27]. Например, BBL демонстрирует широкое сигмоидальное развертывание с сильно скошенными пре- и постпереходами как при температурной, так и при химической денатурации [25].Широкие кривые развертывания также связаны с зависимостью от структурного зонда, который используется для наблюдения за развертыванием [18], и чрезвычайно широким распределением поведения атомов при развертывании [19]. Точно так же термограмма ДСК для BBL характерно широкая и со значительной избыточной теплоемкостью при низких температурах, демонстрируя ее постепенное развертывание [20]. Кинетика микросекундного сворачивания BBL также была исследована с использованием кинетических методов лазерного T-скачка в сочетании с множественными структурными зондами [28].Эти кинетические эксперименты показали, что нисходящие процессы могут производить одноэкспоненциальные затухания с одинаковой скоростью для нескольких структурных зондов, а не растянутые экспоненциальные затухания, ожидаемые для неровных нисходящих энергетических ландшафтов [6]. Вместо этого поведение BBL в одном состоянии проявлялось в кинетических амплитудах, которые сильно различались для зондов, чувствительных к вторичной (IR) и третичной (FRET) структурам, что указывает на большую развязку между ними [28]. В качестве еще одного диагностического проявления сворачивания вниз в одном состоянии недавно было показано, что скорость релаксации сворачивания, измеренная для BBL, сильно зависит от величины возмущения [29].

    Особенности сворачивания в одном состоянии должны быть наиболее очевидны на уровне одной молекулы, где можно измерить распределение молекулярного поведения. Например, FRET-спектроскопия одиночной молекулы, которая повторяет традиционные эксперименты по химической денатурации отдельных молекул [30], может в принципе определить, разворачивается ли белок как постепенно смещающееся одиночное состояние или путем преобразования между двумя конечными состояниями. Однако существуют технические препятствия, поскольку типичные временные масштабы нисходящего сворачивания (микросекунды) слишком малы даже для самых передовых методов SM-FRET, которые едва могут обнаружить ∼1 фотон в мкс от одной молекулы [31].Для BBL эту проблему удалось обойти, выполнив эксперименты SM-FRET при температуре, достаточно низкой, чтобы замедлить кинетику его складывания почти в 100 раз. Эксперименты SM-FRET, проведенные при pH 6, однозначно продемонстрировали одностадийный сценарий развертывания BBL [32]. Однако аналогичные низкотемпературные эксперименты SM-FRET, проведенные ранее на BBL при более высоком pH, выявили индуцированную денатурантом конверсию между двумя видами с более высокой и более низкой эффективностью FRET ( E ) [33].

    Различия между двумя наборами экспериментов SM-FRET очень озадачивают, поскольку они кажутся несовместимыми друг с другом. В качестве возможных объяснений этого несоответствия утверждалось [34] и возражали [35], что гистограммы унимодальной эффективности FRET ( E ), наблюдаемые при pH 6, могут соответствовать экспериментально неразрешенной смеси нативных и развернутых частиц. . С другой стороны, было отмечено, что эксперименты, в которых было получено бимодальное распределение, демонстрируют несколько нетрадиционных особенностей [36].Например, два вида, обнаруженные в последнем экспериментальном наборе, демонстрируют заметное снижение E с денатурантом [33], что позволяет предположить, что каждый вид претерпевает частичное разворачивание. Кроме того, средняя точка денатурации, полученная из популяций SM-FRET, не согласуется с точкой, определенной в объемных экспериментах [36]. Другим загадочным общим результатом является сильная температурная зависимость кинетики сворачивания BBL, которая, по-видимому, замедляется до 200 раз при понижении температуры примерно на 50 K [32], [33].

    В связи с этим недавно было высказано предположение, что ответ на загадку BBL может быть связан с эффективной связью между разворачиванием и переносом протона [35]. Эта идея была выдвинута после осознания существенного изменения стабильности ББЛ в диапазоне рН 6–9 [34], [35]. Такое изменение стабильности может быть весьма значительным, учитывая, что влияние ионного денатуранта хлорида гуанидиния (GdmCl) на pK a буферов и на показания pH стеклянных электродов предполагает, что Huang et al.на самом деле эксперименты проводились при pH~8 вместо 7 [35] по сравнению с pH 6 в Liu et al. Сильные изменения стабильности между pH 6 и 9 весьма необычны, поскольку ни кислотные, ни основные остатки свернутых белков не титруются в этом диапазоне. Более того, в отличие от температурных и химических денатурантов, рН-денатурация представляет собой по существу бинарный процесс, опосредованный конверсией между непротонированной и протонированной формами белка. Двойной характер наиболее очевиден, когда разворачивание вызывается протонированием одной ионизируемой группы с большим сдвигом pK a .Таким образом, протонирование может расщепить ансамбль с одним состоянием на два различных, постепенно разворачивающихся вида [35]. Интересно, что потенциальная роль pH в определении степени кооперативности развертывания BBL была подтверждена ранее на основании различий в структурах ЯМР, полученных в условиях слабокислого и нейтрального pH [24].

    Здесь мы решили исследовать роль переноса протона в разворачивании BBL. Наше основное внимание двоякое. Сначала мы стремимся определить, действительно ли разворачивание BBL связано со специфическим протонированием в необычном диапазоне pH 6–11; и, во-вторых, изучить, может ли такой эффект количественно объяснить оба набора экспериментов с одной молекулой, а также все ранее доступные экспериментальные данные по BBL.Для этого мы объединяем эксперименты и статистическое механическое моделирование. Мы проводим термодинамические и лазерные эксперименты по кинетике Т-скачка, чтобы выяснить роль переноса протона в химическом развертывании BBL. Затем мы исследуем термодинамические, кинетические и одномолекулярные последствия связи между развертыванием и переносом протона в сценарии сворачивания вниз по склону с одним состоянием. Для последнего мы используем те же одномерные модели поверхности свободной энергии, которые мы использовали ранее для: 1) анализа термодинамики и кинетики фолдинга белка [28], [37], [38], 2) интерпретации отклонений от двух -состояние кинетики быстро сворачивающихся белков [17], 3) анализировать эксперименты DSC [39] и 4) предсказывать скорости сворачивания и разворачивания однодоменных белков [40], [41].Наконец, мы демонстрируем, как простой механизм переноса протона в сочетании с разворачиванием хорошо объясняет все существующие экспериментальные данные о BBL в контексте сценария нисходящего сворачивания с одним состоянием.

    Результаты и обсуждение

    Стабильность нативного BBL демонстрирует необычную зависимость от pH

    Небольшой белок BBL разворачивается при слабокислых значениях рН за счет ионизации двух скрытых гистидинов (h23 и h47) в сочетании с протонированием нескольких кислотных остатков [42], [43].Здесь мы заинтересованы в изучении возможных эффектов дестабилизации в диапазоне pH от нейтрального до щелочного. Во-первых, важно отметить, что при комнатной температуре и между pH 6 и 11 нативное состояние BBL стабильно в соответствии с двухуровневым анализом данных термической денатурации [43]. Стабильность ББЛ будет еще выше при ∼279 К (температура, представляющая интерес для сравнения с предыдущими экспериментами SM-FRET). Таким образом, чтобы исследовать влияние pH на стабильность BBL при 279 K, мы исследовали его устойчивость к дополнительным термодинамическим возмущениям при различных постоянных значениях pH в интересующем нас диапазоне.В частности, мы измерили кривые химической денатурации с использованием GdmCl в качестве денатуранта, чтобы лучше сравнить их с экспериментами SM-FRET. Наш выбор GdmCl вместо мочевины был продиктован малой чувствительностью BBL к мочевине [32] и необходимостью достижения его полного развертывания в условиях pH высокой внутренней стабильности нативного состояния. Однако из-за ионного характера GdmCl мультимолярные концентрации, необходимые для развертывания BBL, вызывают большие изменения pH белковых растворов, приготовленных с буферными условиями, используемыми для стандартных экспериментов по денатурации белков [44].Кроме того, оценка этих изменений рН с использованием обычных методов требует тщательной коррекции влияния GdmCl на показания стеклянных электродов [44]. Чтобы быть максимально точными, мы корректировали рН для каждого образца кривой денатурации индивидуально, используя показания стеклянного электрода, скорректированные с помощью таблиц Гарсиа-Мира и Санчеса-Руиса [44]. Мы отслеживали развертывание с помощью КД в дальнем УФ, который чувствителен к степени содержания нативной α-спирали, присутствующей в BBL.

    Рис.1 показана исходная вероятность BBL, полученная из обычных двухсостояний аппроксимации кривых денатурации GdmCl при различных значениях pH. Подгонки показывают, что, согласно модели с двумя состояниями, нативное состояние BBL стабильно в отсутствие химических денатурантов во всем диапазоне рН 6–11. Тем не менее, данные показывают сильную стабилизацию BBL при переходе от pH 6 к 8. Стабилизация проявляется увеличением C m (концентрация денатуранта, при которой белок разворачивается наполовину), начиная с 2.от 7 до 4,5 М (рис. 1, верхняя панель). Выше рН 8 изменения стабильности ББЛ идут в противоположном направлении и более мягкие. В этом втором режиме дестабилизация проявляется в более низких значениях m (чувствительности к денатурантам), которые снижаются от максимума рН 7 4,5 кДж·моль -1 · М -1 до ~2,9 кДж·моль — 1 · М -1 при самом высоком рН. Напротив, C m демонстрирует минимальные изменения в этом диапазоне pH (рис. 1, нижняя панель). Общие тенденции лучше видны на врезке нижней панели рис.1, который перекрывает кривые, полученные для подгонки двух состояний для всех значений pH, а не экспериментальные данные.

    Рис. 1. Равновесная химическая денатурация BBL при различных значениях pH в диапазоне 6–11.

    Данные показаны с точки зрения вероятности естественного состояния, полученного путем подгонки экспериментальных точек данных (кружки) к модели с двумя состояниями. Вставка на нижней панели показывает два состояния для всех данных вместе, чтобы облегчить сравнение.

    https://дои.org/10.1371/journal.pone.0078044.g001

    Сильная стабилизация между pH 6 и 8 предполагает наличие ионизируемой группы с очевидным pK a ~7, которая дестабилизирует нативное состояние BBL при протонировании. Тот факт, что чувствительность к денатурации GdmCl также максимальна при pH 7 (значение m = 4,5 кДж·моль −1 ·M −1 при pH 7 против ∼3,7 кДж·моль −1 ·M − 1 как при pH 6, так и при 8) еще больше подтверждает идею о том, что протонирование этого остатка действительно способствует разворачиванию BBL.Такая зависимость от pH весьма необычна для белков, поскольку большинство ионизируемых групп титруются либо при более низком, либо при более высоком pH. Мы можем исключить два скрытых гистидина как источник такого поведения, потому что они имеют более низкую кажущуюся pK a согласно определению двух независимых групп [42], [45]. Различные глутаматы и аспартаты, присутствующие в BBL, также демонстрируют гораздо более низкие значения pK a [43]. Путем простого исключения титруемая группа (или группы) должна принадлежать основному остатку в BBL (лизин или аргинин).Большинство положительно заряженных остатков в BBL подвергаются воздействию растворителя. Однако расчет электростатического потенциала структур ББЛ, полученных методом ЯМР при рН 7 [46] и рН 5,3 [19], показывает, что боковые цепи R28 при рН 7 и R31 при рН 5,3 вовлечены в третичные контакты и окружены сильный положительный потенциал, который может быть структурным источником сильного понижения передачи в нативном состоянии. Понижение на полностью нативной структуре должно быть еще больше, так как кажущиеся pK a ∼7 соответствуют средневзвешенному между нативными pK a и развернутыми BBL (предположительно близко к pK a ∼12 невозмущенного аргинина).Другими словами, простые физические рассуждения показывают, что нативное состояние BBL стабилизирует незаряженную форму этого остатка. Таким образом, протонирование очень тесно связано с разворачиванием BBL. Очень легкая дестабилизация при более высоких значениях pH может отражать начало титрования некоторых оставшихся основных остатков в BBL, что может дестабилизировать нативное состояние BBL за счет неспецифического электростатического отталкивания из-за положительного суммарного заряда белка в этих условиях.

    В дополнение к необычным эффектам стабильности pH, по-видимому, вызывает структурные изменения в нативном состоянии BBL.Этот результат также несколько своеобразен и, по-видимому, несовместим с анализом двух состояний. Данные на рис. 1 показаны в нормализованном виде (т. е. исходная вероятность из двух состояний), чтобы подчеркнуть, что BBL достигает полностью естественного состояния при всех значениях pH в отсутствие химического денатуранта, как показано термодинамическим анализом двух состояний. (включая pH 6, который имеет самый низкий C m ). Однако непосредственная проверка абсолютного сигнала КД в дальнем УФ-диапазоне для каждого условия показывает резкое увеличение общего сигнала α-спирали нативного ансамбля BBL между pH 6 и 8, за которым следует почти плоская горизонтальная тенденция при более высоком pH (рис. .2, кружки, правая шкала). Невозможно разрешить другой конец предположительно сигмоидального титрования, потому что два гистидина, глутаматы и аспартаты начинают титровать ниже pH 6, участвуя, таким образом, в постепенном развертывании BBL [45]. Следует также отметить, что изменения КД в дальнем УФ-диапазоне имеют четкие спектральные характеристики, указывающие на то, что термодинамическое нативное состояние BBL (определяемое в соответствии с анализом двух состояний) постепенно становится неструктурированным ниже pH 8 (вставка к рис. 2).Более того, кривая, показанная на рис. 2, согласуется с кажущимся pK a ~7, оцененным по изменениям стабильности BBL, что указывает на то, что собственный сигнал α-спирали BBL тесно связан с его стабильностью. Таким образом, влияние pH на нативный BBL аналогично тому, о чем сообщалось ранее для температуры [22] и химических денатурантов [25]. Такое поведение в точности совпадает с общим ожиданием односостоятельных нисходящих складчатых переходов, при которых степень структурированности населенного ансамбля изменяется пропорционально денатурирующему напряжению даже в предпереходной области [23].Дополнительные доказательства постепенной деструктуризации нативного состояния ББЛ в этом диапазоне рН можно получить при сравнении ЯМР-структур при рН 5,3 [19], [47] и рН 7 [46].

    Рисунок 2. Изменения в нативном состоянии BBL в зависимости от pH.

    Правая ось и кружки соответствуют средней эллиптичности остатка в спектрах кругового дихроизма 222-УФ BBL при 279 K, в которых цвет означает pH, в соответствии с тем же кодом, что и на основном рисунке и на рис. 1.

    https://дои.org/10.1371/journal.pone.0078044.g002

    Кинетическая связь между процессами складывания-разворачивания BBL и переноса протона

    Одной из интригующих характеристик, наблюдаемых для кинетики релаксации свертывания-развертывания BBL, является ее довольно сильная температурная зависимость. Время релаксации сворачивания-разворачивания ББЛ при комнатной температуре составляет около 20 мкс [28]. Однако при 279 К оно снижается до 200 мкс [32] или даже 350 мкс [33] в зависимости от фактического рН исследуемого образца [35].Такие изменения скоростей с температурой эквивалентны энергии активации для предэкспоненциального фактора ~110 кДж/моль, что в 3 раза больше, чем ожидалось для быстросворачивающегося белка из 40 остатков [17]. Термодинамический анализ, описанный в предыдущем разделе, указывает на связь между разворачиванием BBL и переносом протона как на предполагаемый источник этого необычного поведения. Процессы переноса протонов между водой и аминогруппами контролируются скоростью бимолекулярных столкновений между донором и акцептором протонов [48] и, таким образом, становятся относительно медленными при нейтральном pH, где общая концентрация H 3 O + плюс OH является самым низким.Например, при нейтральном рН и комнатной температуре скорость переноса протона для боковой цепи аргинина, измеренная с помощью экспериментов ЯМР с переносом намагниченности, составляет ~ 1200 с -1 [49]. Более того, скорости переноса протонов демонстрируют значительную температурную зависимость [48] [49]. Следовательно, при нейтральном pH общая кинетика сворачивания-развертывания BBL в присутствии химических денатурантов может контролироваться протонированием-депротонированием одного основного остатка, особенно при низких температурах, используемых в экспериментах SM-FRET.

    Чтобы проверить эту гипотезу, мы изучили кинетику релаксации свертывания-разворачивания BBL вблизи средней точки денатурации в рассматриваемом диапазоне pH. Для достижения соответствующего временного разрешения и динамического диапазона мы использовали метод лазерно-индуцированного температурного скачка, реализованный в конфигурации накачка-зонд. Эта конфигурация позволяет легко получать кинетические данные за логарифмическое время от наносекунд до миллисекунд [11]. В качестве зонда нативной структуры в BBL мы использовали флуоресцентный перенос энергии Фёрстера (FRET) между парой красителей Alexa 564 (A564) и Alexa 647 (A647) в качестве донора и акцептора соответственно.Эти красители были включены в цистеины, добавленные к концам последовательности BBL, которая также включает гибкие хвосты из 4 остатков [32]. Преимущество этого подхода в том, что он повторяет предыдущие измерения SM-FRET [32]. Мы выполнили эксперименты с лазерным Т-перескоком, в которых мы индуцировали скачки ~5 К до конечной температуры ~280 К (т.е. аналогично экспериментам SM-FRET) при концентрациях GdmCl вблизи средней точки денатурации BBL для каждого значения рН в пределах диапазон 6-11. Эксперименты проводились в средней точке денатурации, потому что в этих условиях BBL имеет одинаковую стабильность во всем диапазоне pH и, следовательно, кинетика сворачивания должна быть эквивалентной.Более того, именно в этих условиях ожидается, что изменения в протонировании будут наибольшими по величине, если действительно существует сильная связь между сворачиванием и переносом протона.

    Результаты таких экспериментов суммированы на рис. 3–5. Мы провели глобальный анализ разложения по сингулярным числам (SVD) матрицы, содержащей весь набор экспериментальных данных зависящих от времени спектров флуоресценции BBL при различных значениях pH. Эта процедура визуализировала два основных компонента (рис.3). Первый компонент представляет собой средний спектр образцов BBL при всех значениях pH, показывающий флуоресцентное излучение донора (A564) и акцептора (A647). Второй компонент показывает антикорреляцию между эмиссией флуоресценции двух красителей, что указывает на изменение сигнала FRET во время кинетических экспериментов (красный цвет на рис. 3). Амплитуда второй компоненты СВД отражает кинетические спады при различных экспериментальных значениях рН (рис. 4). Все кинетические распады показывают уменьшение FRET при нагревании BBL от 275 до 280 K вблизи средней точки химической денатурации; я.е. общее изменение амплитуды идет от положительных значений до нуля, что (при умножении на спектральную сигнатуру второго компонента svd, показанного красным на рис. 3) представляет уменьшение излучения акцептора, связанное с увеличением излучения донора. Кинетические затухания обнаруживают четкую зависимость от pH, даже несмотря на то, что они были измерены в условиях изостабильности для BBL. Другое интересное наблюдение заключается в том, что все затухания, измеренные в логарифмическом масштабе времени от 1 мкс до 10 мс, явно неэкспоненциальны.На самом деле они лучше всего соответствуют двойной экспоненциальной функции (черные кривые на рис. 4). Это важный результат, поскольку это временное окно не включает наносекундные временные масштабы, характерные для конформационных движений развернутых полипептидов [16], которые также наблюдаются в экспериментах по FRET T-скачку белков с гибкими хвостами [28].

    Рис. 3. Основные компоненты разложения по сингулярным числам (svd) экспериментов по индуцированному лазером T-скачку BBL, помеченного A564 и A647.

    Первый компонент (синий) показывает средний спектр флуоресценции за все время при всех значениях pH. Второй компонент (красный) показывает изменения флуоресценции во времени.

    https://doi.org/10.1371/journal.pone.0078044.g003

    На панелях показаны экспериментальные затухания при различных значениях pH (окрашены в соответствии с кодом предыдущих рисунков), полученные из амплитуды второй компоненты svd (красный на рис.3). Черные линии соответствуют двойной экспоненциальной функции. Отдельные экспоненциальные затухания, полученные из подгонок, показаны серым цветом. Вертикальная серая линия показывает время релаксации медленной фазы при рН 9.

    https://doi.org/10.1371/journal.pone.0078044.g004

    Рисунок 5. Зависимость от pH двух фаз, наблюдаемая в экспериментах по T-скачку BBL при 279 К вблизи средней точки химической денатурации.

    Быстрая фаза показана красным цветом, а медленная — синим.Столбики погрешностей обозначают ошибки подгонки к двойным экспоненциальным подгонкам на рис. 4. Синие и красные кривые — это предсказания одномерной модели поверхности свободной энергии (см. рис. 6).

    https://doi.org/10.1371/journal.pone.0078044.g005

    Таким образом, две наблюдаемые кинетические фазы напрямую связаны с релаксацией складывания-развертывания BBL. В соответствии с биэкспоненциальной подгонкой быстрая фаза практически не зависит от pH со скоростью ~1/(15 мкс) для всех условий.Напротив, медленная фаза идет от максимальной скорости ∼1/(90 мкс) при pH 6 до минимума ∼1/(435 мкс) при pH 9, снова ускоряясь до ∼1/(150 мкс) при pH 9. pH 11. Общую зависимость кинетики релаксации свертывания BBL от pH можно наблюдать путем сравнения с вертикальными линиями на панелях рисунка (которые указывают на самое медленное время релаксации). Также следует отметить, что медленная скорость, которую мы измеряем при рН 8 (т.е. 1/(340 мкс)) идентична той, о которой ранее сообщали Фершт и его коллеги [33], что еще раз подтверждает наше предыдущее утверждение о том, что их экспериментальные условия соответствуют рН 8. [35].Конкретные изменения скоростей быстрой и медленной фаз, вызванные рН, определенные с помощью биэкспоненциальной аппроксимации, показаны на рис. 5. Относительные амплитуды также демонстрируют зависимость от рН (см. подгонку быстрого и медленного спада для каждого значения рН серым цветом). тонкие кривые на панелях рис. 4). В частности, медленная фаза имеет максимальную амплитуду в области рН 7–9, где она составляет ~85% от общей амплитуды, и уменьшается при обоих экстремумах рН.

    Все эти наблюдения указывают на кинетику, контролируемую взаимодействием между сворачиванием-развертыванием и протонированием-депротонированием остатка, титруемого около pH 7.Наблюдение двухфазной кинетики для BBL в условиях, использованных для экспериментов SM-FRET, выявляет лежащую в основе сложность, которая контрастирует с одноэкспоненциальной микросекундной кинетикой, ранее наблюдавшейся в экспериментах с лазерным T-скаком, выполненных несколькими авторами при высокой температуре [28] [50]. ]. Теми же группами сообщалось о более медленной, но все же явно одноэкспоненциальной кинетике при комнатной температуре вблизи средней точки химической денатурации [28], [50]. Кроме того, предыдущие эксперименты с лазерным T-скаком, выполненные в тех же условиях, что и здесь, и при pH 6 [32] или pH ∼8 [33], также давали явно одиночные экспоненциальные затухания.Это несоответствие вызывает недоумение. Основное отличие состоит в том, что предыдущие кинетические затухания были получены в линейном, а не в логарифмическом времени. Таким образом, возможно, что кинетические эксперименты с линейным временем не смогли разрешить быструю фазу ∼1/(15 мкс) с ограниченным отношением сигнал/шум в экспериментах с Т-скачками. Быструю фазу может быть особенно трудно разрешить при низкой температуре, когда медленная фаза происходит в 30 раз медленнее. Чтобы исследовать эту возможность, мы измерили кинетику T-скачка для образца с pH 8 в районе C m и между 280 K и комнатной температурой (рис.6). Как и ожидалось, при 298 К общая релаксация становится намного быстрее (т.е. 1/(50 мкс), что прекрасно согласуется со скоростями, определенными ранее в эквивалентных условиях [28], [50]). Кинетическое затухание при комнатной температуре также является по существу одноэкспоненциальным, даже при измерении в логарифмическом масштабе (нижняя левая панель на рис. 6). С другой стороны, затухание релаксации при более низкой температуре явно имеет двойную экспоненциальную зависимость от логарифмического времени, но хорошо согласуется с одной экспоненциальной функцией с тем же временем релаксации медленной фазы при измерении за линейное время (верхняя и средняя панели на рис. .6).

    Рис. 6. Кинетика релаксации свертывания-развертывания T-скачка BBL при различных конечных температурах, измеренная при pH 8 и вблизи средней точки химической денатурации.

    На левых панелях показаны экспериментальные затухания, измеренные в логарифмическом масштабе и соответствующие двойной (зеленый) и одинарной (красный) экспоненциальным функциям. На правых панелях показаны те же экспериментальные данные, построенные в линейном временном масштабе и подогнанные под одноэкспоненциальную функцию.

    https://doi.org/10.1371/журнал.pone.0078044.g006

    Эксперименты, показанные на рис. 6, подтверждают, что наши текущие данные совместимы со всеми предыдущими данными T-скачка, и подтверждают существование двух фаз в кинетике складывания-разворачивания BBL. Быстрая фаза демонстрирует независимую от pH скорость, которая совпадает с временными шкалами фолдинга, ожидаемыми для ниспадающих фолдинговых белков [17]. Параболическая зависимость медленной фазы от рН указывает на процесс, ограниченный стадией медленного переноса протона, проявляющей кислотный и основной катализ [48].Такая зависимость от рН значительно слабее, чем измеренная для скоростей переноса протона в свободных аминокислотах [49], по-видимому, потому, что мультимолярные растворы GdmCl действуют как эффективный катализатор протонного обмена [48]. Субмиллисекундные скорости медленной фазы также сравнимы со скоростями переноса протона, ожидаемыми для аминогрупп при нейтральном рН [48], [49]. Точно так же удивительно сильная температурная зависимость, наблюдаемая для кинетики релаксации сворачивания BBL в этом диапазоне pH, может отражать переключение между высокотемпературным режимом, в котором перенос протона происходит быстрее или сравним со скоростью сворачивания-разворачивания, и режимом, происходящим при низких температурах. в котором стадия протонного обмена становится лимитирующей.

    Простая теоретическая модель складывания вниз по склону в сочетании с переносом протонов

    Равновесие и кинетические результаты, обсуждавшиеся в предыдущих двух разделах, эмпирически демонстрируют, что разворачивание BBL в диапазоне pH 6–11 тесно связано со специфическим процессом протонного обмена. Однако на данном этапе очень важно объяснить эти результаты на количественном уровне и выяснить, совместимы ли они с предыдущим набором данных и анализов, которые идентифицировали BBL как нисходящую папку с одним состоянием.В конечном счете, мы хотели бы объяснить резкие различия между результатами SM-FRET, полученными на этом белке нами (унимодальное распределение частично развернутых молекул) [32] и группой Фершта (бимодальное распределение в средней точке денатурации) [33]. ].

    Лучше всего достичь этих целей, анализируя экспериментальные данные с помощью простых, ни к чему не обязывающих теоретических моделей. В этом случае мы модифицировали нашу ранее разработанную одномерную модель поверхности свободной энергии сворачивания белка, чтобы включить равновесные и кинетические эффекты протонирования-депротонирования.Эта модель основана на подходе энергетического ландшафта [51] и напрямую учитывает эффекты масштабирования при сворачивании белков [14]. Несмотря на свою аналитическую простоту, модель оказалась чрезвычайно эффективной для количественной интерпретации огромного количества экспериментов по сворачиванию белков. Например, он был полезен для интерпретации отклонений от поведения двух состояний в кинетике релаксации фолдинга быстро фолдинговых белков [17], для извлечения термодинамических барьеров фолдинга из данных дифференциальной сканирующей калориметрии [39] и для глобального количественного анализа. данных о равновесии и кинетике фолдинга в целом [37], [38], а также характеристику одностадийного режима нисходящего фолдинга в белке BBL на основе многозондовых данных кинетики Т-скачков [28] и, в конечном счете, на однократных -молекулярные эксперименты FRET [32].Более того, модель продемонстрировала значительную прогностическую способность, которая была продемонстрирована путем прогнозирования стабильности белка и поведения нисходящего фолдинга по размеру белка [40], а также путем прогнозирования абсолютных скоростей фолдинга и разворачивания белка с использованием размера и структурного класса (всего 10 бит). как только белок-специфический вход [41].

    Таким образом, мы взяли эту модель и модифицировали ее, включив связь между фолдингом и протонированием-депротонированием одной титрующей группы. Подробное описание этих модификаций модели приведено в разделе «Экспериментальные методы и теоретическая модель».Вкратце, модель разделяет дискретизированную одномерную поверхность свободной энергии в зависимости от характерного параметра порядка (то есть нативности) на две разные поверхности, соответствующие протонированной и непротонированной формам белка. Поверхности свободной энергии для двух форм определяются общими энергетическими параметрами BBL и простыми соотношениями равновесия ионизации между эквивалентными микросостояниями (равная нативность), как определено конкретными значениями pK a .Связь между общим сворачиванием и ионизацией возникает из-за разницы между средневзвешенными pK и для микросостояний, определяющих нативный и развернутый ансамбли.

    Для простоты мы определили линейно убывающую зависимость pK a с параметром порядка. В частности, мы выбрали шкалу, которая идет от эффективных pK до значений ∼11 для полностью развернутого ансамбля (т.е. <нативность> = 0.3) до ∼6 для нативного ансамбля (<нативность> = 0,9). Этот диапазон в pK a согласуется с остатком аргинина или лизина, который испытывает большой сдвиг своего ионизационного равновесия в сторону непротонированного состояния в нативной трехмерной структуре. После реализации с таким простым описанием укладки в сочетании со связыванием модель генерирует кривую рН-титрования в отсутствие химических денатурантов, которая хорошо соответствует тенденции экспериментальных данных (серая линия и левая шкала на рис.2). Здесь важно отметить, что изменения средней нативности в зависимости от pH, производимые моделью, соответствуют сдвигу одного состояния единственного «нативного» ансамбля BBL в сторону меньшей степени структурированности в ответ на более низкий pH, скорее чем преобразование между сложенным и развернутым состояниями. Рассчитанный нативный сигнал показывает плато при pH ~ 5, поскольку модель не включает ионизацию дополнительных остатков BBL. Мы опустили дополнительные ионизационные равновесия для простоты, поскольку они не являются центральными для поведения в диапазоне pH 6–11, которое мы пытаемся понять.

    Кинетическая реализация модели требует только определения набора кинетических переходов, соединяющих протонированную и непротонированную формы белка. Здесь мы следовали наиболее консервативному определению, согласно которому перенос протона происходит только между структурно идентичными микросостояниями (т. е. видами с одинаковой нативностью). Таким образом, мы определили матрицу скоростей, которая рассматривает конформационную динамику на протонированных и непротонированных поверхностях как диффузионную и соединяет две поверхности посредством скоростей включения и выключения протонного обмена между эквивалентными микросостояниями (т.е. равное происхождение). Единственными новыми параметрами являются скорости включения и выключения для реакций протонного обмена. Мы определили микроскопические скорости протонного обмена как сумму трех микроскопических констант скоростей второго порядка для учета: 1) кислотного катализа (пропорционального [H + ]), 2) основного катализа (пропорционального [OH ]), 3) процессы аминопереноса (здесь пропорциональны [гуанидинию]) [48]. Скорости высвобождения (выключения) протонов затем непосредственно определяются с помощью подробного баланса в соответствии с pK a для каждого микросостояния нативности.Для моделирования кинетических экспериментов нам просто нужно было найти значения для трех микроскопических скоростей протонного обмена (скорости переноса кислоты, основания и амино), которые согласуются с экспериментальными наблюдениями (см. раздел «Экспериментальные методы и теоретическая модель»).

    Используя параметризованную матрицу скоростей, мы смоделировали эксперименты с Т-скачками вблизи средней точки денатурации на рис. 4. В этих симуляциях мы интегрировали зависящие от времени вероятности для всех состояний в модели, чтобы вычислить среднюю нативность как функцию времени (примечание что вероятность каждого значения нативности равна сумме протонированных и непротонированных форм).Этот расчет можно непосредственно сравнить с экспериментами, в которых используется структурный зонд, линейно изменяющийся в зависимости от степени складчатости. Это на самом деле не является необоснованным предположением для описания сигнала FRET между донором и акцептором, расположенным на концах белка, используемых в наших экспериментах на рис. 4. Однако мы должны также подчеркнуть, что мы не заинтересованы в точном сопоставлении экспериментальных сигналов, поскольку эти усилия будут включать использование дополнительных (нечетко определенных) параметров для описания сквозного расстояния для каждого микросостояния.Наша цель — просто сравнить эксперимент и теорию на количественном уровне, но в самом общем виде. Тем не менее результаты моделирования Т-скачка очень точно воспроизводят экспериментальные данные. Моделируемые затухания являются биэкспоненциальными при всех условиях (рис. 7), с быстрой фазой, которая не зависит от рН, и медленной фазой с характерной экспериментальной зависимостью от рН (линии на рис. 5). Как было показано ранее экспериментально, амплитуда медленной фазы максимальна между рН 7 и 9, тогда как быстрая фаза становится более преобладающей при экстремальных значениях рН.Нет точного согласия между моделированием и экспериментом с точки зрения относительных амплитуд для двух фаз. В частности, моделирование имеет тенденцию давать немного большую амплитуду для быстрой фазы (сравните серые линии на рис. 4 и 7). Однако мы не могли реально ожидать лучшего совпадения, учитывая, что мы напрямую сравниваем затухание параметра порядка модели с экспериментальным сигналом FRET.

    Рис. 7. Кинетика релаксации свертывания-развертывания BBL, предсказанная одномерной моделью поверхности свободной энергии, реализованной с развертыванием, связанным с механизмом переноса протона.

    Панели показывают зависящие от времени изменения средней нативности в зависимости от pH. Цветовой код и кривые как на рис. 4.

    https://doi.org/10.1371/journal.pone.0078044.g007

    Общая согласованность между моделированием и экспериментом обеспечивает прямую интерпретацию двухфазной экспоненциальной кинетики BBL, зависящей от pH (рис. 8). Согласно модели, фаза 1/(15 мкс) соответствует разворачивающейся вниз релаксации непротонированной и протонированной популяций в ответ на наносекундный Т-скачок (левая панель на рис.8). Повышение температуры наклоняет сворачивающуюся поверхность свободной энергии обоих состояний протонирования в сторону большего развертывания, так что каждый вид протонирования диффузно релаксирует к своему новому минимуму свободной энергии. Медленная фаза, зависящая от pH, включает повторное уравновешивание между непротонированной и протонированной формами, вызванное повышением температуры. Он запускается реакцией переноса протона субмс, за которой немедленно следует диффузионная релаксация вновь протонированных молекул до их (более неупорядоченного) минимума свободной энергии (правая панель на рис.8). Следовательно, двухфазная кинетика, которую мы наблюдаем для BBL, по-видимому, является следствием сильной связи между переносом протона и постепенным разупорядочением белков, укладывающихся вниз.

    Рисунок 8. Интерпретация двухфазной кинетики складывания-разворачивания BBL.

    На рисунке показаны расчеты с помощью модели FES релаксации Т-скачка до условий денатурации, близких к средней точке при pH 8. На нижних панелях показаны поверхности свободной энергии для протонированной и непротонированной форм до (более темные цвета) и после (более светлые цвета). ) Т-прыжок.На верхних панелях показаны изменения вероятности, связанные с каждой фазой, полученные из собственных векторов матрицы ставок. Красные оттенки указывают на протонированные виды, а синие оттенки указывают на непротонированные виды. Стадия переноса протона показана стрелкой плюс символ H + .

    https://doi.org/10.1371/journal.pone.0078044.g008

    Объяснение разворачивающейся гетерогенности в экспериментах по флуоресценции одиночных молекул BBL

    В предыдущих разделах мы продемонстрировали, что сворачивание-развертывание BBL термодинамически и кинетически связано со специфическим протонированием еще не идентифицированного основного остатка, которое происходит в диапазоне pH 6–11.Таким образом, денатурирующие агенты (например, GdmCl) вызывают протонирование, а более низкий pH способствует разворачиванию BBL. Более того, в этом диапазоне рН и при ∼280 К перенос протона оказывается медленным (рис. 4–5). Важный остающийся вопрос заключается в том, может ли связь между нисходящим фолдингом в одном состоянии и бинарным (и ограничивающим скорость) процессом обмена протонов объяснить кажущиеся противоречивыми наблюдения за химическим разворачиванием BBL, сделанные разными группами с использованием эквивалентных методов флуоресценции одной молекулы.

    Чтобы ответить на этот вопрос, мы рассмотрели поведение разворачивания на уровне одной молекулы, предсказанное одномерной моделью поверхности свободной энергии.Моделирование развертывания BBL при разных значениях pH показывает два очень разных режима (рис. 9). Интересно, что два режима лучше всего представлены двумя условиями pH, протестированными в экспериментах SM-FRET. При pH 6 (условия для экспериментов Liu et al. [32]) BBL проявляет характерное унимодальное односостоятельное нисходящее поведение; а именно, BBL заполняет единый ансамбль при всех условиях, включая среднюю точку, но ансамбль постепенно смещается от нативных к развернутым значениям параметра порядка по мере увеличения денатурирующего стресса (верхняя левая панель на рис.9). Однако при рН около 8 (истинные экспериментальные условия Huang et al. [33]) разворачивающееся поведение BBL является отчетливо бимодальным, наиболее очевидным в средней точке денатурации, где модель создает два частично перекрывающихся конформационных ансамбля с максимумами при 0,75 и 0,5. нативность (средняя левая панель на рис. 9). «Нативный» и «развернутый» ансамбли взаимно преобразуются в ответ на денатурирующий стресс. Но, кроме того, в двух ансамблях наблюдается постепенное развертывание (сдвиг в сторону меньших значений параметра порядка) по мере увеличения напряжения.При pH 7 модель демонстрирует несколько промежуточное поведение, при котором два пика больше перекрываются, хотя все еще различимы (верхняя правая панель на рис. 9). При самых высоких значениях рН ББЛ снова превращается в единый постепенно смещающийся ансамбль с унимодальным распределением в средней точке (нижняя правая панель на рис. 9). Таким образом, модель воспроизводит два поведения, наблюдаемых экспериментально, и постулирует сдвиг между двумя режимами в зависимости от pH, что, кстати, подтверждается данными SM-FRET, полученными Huang et al.близкий к pH 7 (см. предельно бимодальное распределение, полученное в средней точке с использованием мочевины в качестве денатуранта при pH 7, суп. мат. в [33]).

    Рис. 9. Конформационный ансамбль BBL в зависимости от pH и денатурирующего стресса, предсказанный одномерной моделью поверхности свободной энергии.

    Химическая денатурация была смоделирована, как описано в разделе «Экспериментальные методы и теоретическая модель». На панелях показаны конформационные ансамбли для пяти условий от сильно нативных до сильно денатурирующих при каждом значении pH (цветовой код, как и раньше).

    https://doi.org/10.1371/journal.pone.0078044.g009

    Помимо способности согласовать два явно противоречащих друг другу экспериментальных наблюдения, эти теоретические расчеты проливают свет на физический механизм, лежащий в основе переключения между унимодальным и бимодальным режимами в BBL. . Это важный вопрос, потому что наиболее прямая интерпретация зависимого от pH переключения будет заключаться в том, что протонирование вызывает переход от двух состояний к односостоянию сворачивания вниз по склону.Это объяснение будет соответствовать тому, что было предложено ранее на основе грубого моделирования фолдинга белка [24]. Однако наш анализ показывает, что BBL переключается с одномодального распределения на бимодальное без реального изменения лежащего в его основе механизма складывания. Бимодальный режим возникает из-за расщепления его единого конформационного ансамбля на два подансамбля с одним состоянием, которые различаются своим протонным статусом и, следовательно, внутренней стабильностью. В качестве иллюстрации этого положения на рис.10 показан конформационный ансамбль BBL вблизи средней точки денатурации, различающий протонированную и непротонированную формы белка. На этом рисунке показано, что два пика, которые проявляются вблизи средней точки денатурации в диапазоне pH 7–10, соответствуют протонированным и непротонированным видам белка, а не обычным нативному и развернутому состояниям. Два вида разрешаются в экспериментах по флуоресценции одиночных молекул, потому что они структурно различны (например,грамм. различная степень нативности) и их взаимное превращение путем протонного обмена ограничивает скорость. Однако, что наиболее важно, два вида BBL развиваются постепенно параллельно их взаимопревращению за счет протонного обмена (см. смещающиеся пики в равновесных распределениях на рис. 9). Таким образом, оба вида придерживаются нисходящего сценария с одним состоянием, как это можно ясно оценить на поверхностях свободной энергии при pH 8 вблизи средней точки денатурации, полученной с помощью параметризованной модели (рис. 8). Фактически, особые свойства сценария спада с одним состоянием — это то, что делает две разновидности протонирования структурно разными: протонированная форма по своей природе менее стабильна и, как таковая, менее структурирована при любых заданных экспериментальных условиях.Подводя итог, можно сказать, что медленный обмен протонами в сочетании со сворачиванием расщепляет ансамбль BBL с одноуровневым свертыванием вниз на два вида, которые различаются химически (с одним протоном и без него) и структурно. Оба вида развиваются постепенно по одностадийному нисходящему типу из-за действия денатурирующих агентов. Более того, поскольку денатурирующие агенты благоприятствуют более неструктурированной протонированной форме BBL, эксперимент по денатурации также вызывает бинарную конверсию между двумя видами.

    Рис. 10. Конформационный ансамбль BBL в средней точке денатурации в зависимости от pH, предсказанный одномерной моделью поверхности свободной энергии.

    Серые кривые показывают вклад протонированной (р) и непротонированной (и) форм белка в общий конформационный ансамбль.

    https://doi.org/10.1371/journal.pone.0078044.g010

    Интересно, что связь между событием переноса протона, ограничивающим скорость, и сценарием свертывания вниз по склону с одним состоянием хорошо объясняет несколько интригующих особенностей исследования Huang et al. SM-FRET эксперименты. В этих экспериментах два обнаруженных пика (т.е. «нативное» и «развернутое» состояния) продемонстрировали заметное, индуцированное денатурантами снижение E , свидетельствующее об увеличении и/или разупорядочении. Это наблюдение в настоящее время является обычным явлением для развернутого ансамбля медленных белков с двумя состояниями укладки [30] и сигнализирует о его набухании под действием химических денатурантов [52]. Однако аналогичное расширение не наблюдается для пика, соответствующего нативному состоянию в этих белках, что соответствует ожиданиям истинной модели с двумя состояниями [53]. С другой стороны, сценарий с одним состоянием, связанный с переносом протона, естественным образом дает два пика, которые постепенно разворачиваются параллельно их взаимному превращению, вызванному денатурантами.На самом деле сдвиги E , наблюдаемые экспериментально Huang et al. очень похожи на теоретические предсказания нисходящего сценария с одним состоянием в сочетании с переносом протона для BBL. На рис. 11 сравниваются экспериментальные сдвиги с постепенным развертыванием непротонированных и протонированных частиц, предсказанных моделью. Связь между нисходящим химическим разворачиванием в одном состоянии и протонированием также объясняет большое расхождение в C m между экспериментами SM-FRET (<3.5 M) и кривая разворачивания объемного CD (∼4,2 M) в Huang et al. эксперименты [33]. Объяснение простое, поскольку теоретическая модель предполагает, что два эксперимента измеряют разные вещи. SM-FRET C m получается путем интегрирования площадей двух пиков, которые, согласно модели, отражают популяции протонированных и непротонированных частиц, а не «нативных» и «развернутых» состояний. . Напротив, C m кривой объемного CD указывает на концентрацию денатуранта, при которой общее изменение вторичной структуры происходит наполовину.Для BBL это свойство будет включать совокупный эффект от постепенного развертывания каждого вида плюс их взаимное преобразование.

    Рис. 11. Постепенное развертывание двух пиков, наблюдаемых при химической денатурации BBL при pH 8.

    Кружки, правая и верхняя оси показывают экспериментальные максимумы FRET, полученные Huang et «нативный» (синий) и «развернутый» ( красные) пики. Цветные кривые, левая и нижняя оси показывают изменения нативности в зависимости от денатурирующего стресса (максимальное значение), предсказанные одномерной моделью поверхности свободной энергии для непротонированных (синий) и непротонированных (красный) форм BBL.Черная кривая представляет собой предсказанные средние изменения нативности.

    https://doi.org/10.1371/journal.pone.0078044.g011

    Наконец, четкая зависимость медленной конформационной скорости в BBL от pH (синий цвет на рис. 5) объясняет, почему Huang et al. по-прежнему наблюдали бимодальное распределение на гистограммах SM-FRET, полученных при сравнительно очень длительном времени биннинга (т.е. 0,8 мс) [33]. При более низком pH медленная скорость достаточно высока, чтобы произвести динамическое конформационное усреднение по 0.бины по 8 мс. Соответственно, мы утверждали, что гистограмма средней точки, полученная с временными интервалами 0,8 мс, должна показывать более широкий одиночный пик, а не два пика, полученные с более короткими временными интервалами [36]. Однако при фактическом рН ∼8, указанном Huang et al. В экспериментах [35] скорость переноса протонов на самом деле значительно ниже (рис. 5). Такое замедление подразумевает, что 0,8 мс все еще достаточно мало, чтобы динамическое усреднение не было доминирующим и можно было разрешить два вида протонирования BBL. Этот момент легко продемонстрировать, моделируя гистограмму одиночной молекулы, ожидаемую при pH 8 и 0.Время биннинга 8 мс с использованием стохастического кинетического моделирования с нашей теоретической моделью (рис. 12).

    Рис. 12. Гистограммы отдельных молекул в средней точке денатурации при pH 8 для BBL, рассчитанные для двух разных времен бинирования с использованием стохастического кинетического моделирования с одномерной моделью поверхности свободной энергии.

    https://doi.org/10.1371/journal.pone.0078044.g012

    Выводы

    Наблюдение унимодального и бимодального распределения во время химической денатурации белка BBL, исследованного с помощью SM-FRET, ставит интригующую загадку.Унимодальное распределение ожидается для белка, который был классифицирован как нисходящая папка с одним состоянием в соответствии с обширным набором количественных тестов. С другой стороны, наблюдение двух пиков показывает, что в химическом развертывании BBL есть два взаимопревращающихся состояния. Возникают вопросы: что это за два состояния? И почему эти два состояния не видны в экспериментах SM-FRET с более высоким разрешением при несколько иных экспериментальных условиях? Наша предпосылка заключалась в том, что эти явно несовместимые наблюдения могли возникнуть из-за связи между разворачиванием BBL и специфическим процессом переноса протона.Эксперименты и анализ, представленные здесь, демонстрируют наличие такой связи и обеспечивают интегральное объяснение всех доступных экспериментальных данных по BBL.

    Например, наши эксперименты по термодинамической химической денатурации при различных значениях pH показывают, что разворачивание BBL тесно связано с протонированием одного из его остатков с кажущимся pK a ~7. Следовательно, дестабилизация нативного состояния BBL (например, путем добавления химических денатурантов) в диапазоне pH 6–11 приводит как к разворачиванию, так и к протонированию.Другими словами, общий процесс развертывания BBL сопровождается превращением непротонированных частиц в протонированные. Эксперименты с индуцированным лазером T-скаком в средней точке денатурации показывают, что кинетика релаксации BBL является сложной (двухэкспоненциальной) и зависит от pH. В диапазоне pH 6–11 и при низкой температуре предыдущих экспериментов SM-FRET (~ 280 K) мы обнаружили, что обмен протонов происходит намного медленнее, чем кинетика сворачивания-развертывания BBL. Таким образом, этап переноса протона определяет временную шкалу общего процесса релаксации, который становится довольно медленным (до ~ 2000 с -1 при рН ~9).

    Эти наблюдения имеют большое значение для интерпретации экспериментов с одиночными молекулами по химическому развертыванию BBL. Связь между разворачиванием и переносом протона расщепляет конформационный ансамбль BBL на два химически гетерогенных вида, которые медленно взаимопревращаются. Сильная связь также делает их взаимную конверсию зависимой как от pH, так и от химического денатуранта, таким образом, являясь очевидным источником бимодальных распределений, наблюдаемых при pH ~8. Однако есть две альтернативные интерпретации лежащего в основе механизма складывания.Одна из возможностей состоит в том, что BBL с pH выше нейтрального разворачивается обычным способом с двумя состояниями, так что как химические денатуранты, так и протонирование стабилизируют полностью развернутое состояние. В этом случае этап медленного переноса протона при низкой температуре будет действовать только как кинетический замедлитель, что позволит разрешить «нативное» и «развернутое» состояния с ограниченным временным разрешением экспериментов SM-FRET. Проблема в том, что такая интерпретация двух состояний несовместима с наблюдением биэкспоненциальной кинетики (рис.6), и тот факт, что рН-независимая быстрая фаза совпадает с измеренным ранее временем релаксации для общего процесса сворачивания-разворачивания ББЛ при комнатной температуре в отсутствие химических денатурантов [28]. Эта интерпретация также потребовала бы перехода от сценария с двумя состояниями при pH 8 к сценарию с одним состоянием при pH 6, учитывая, что явно одномодальные гистограммы SM-FRET, наблюдаемые при последнем pH, не могут быть объяснены как два неразрешенных пика [32]. Кроме того, интерпретация двух состояний несовместима с серией термодинамических и кинетических экспериментов, которые были выполнены при нейтральном pH и подтверждают односостоятельный нисходящий сценарий для BBL [18], [19], [22], [28].

    Альтернативная интерпретация состоит в том, что BBL складывается-разворачивается по наклонной схеме с одним состоянием при любых условиях. По этому сценарию оба вида (непротонированные и протонированные) разворачиваются постепенно. Их взаимная конверсия индуцируется химическими денатурантами и приводит к бимодальному распределению, поскольку при каждом экспериментальном условии протонированные частицы относительно более неупорядочены. Используя статистическое механическое моделирование, мы показываем здесь, что этот сценарий количественно воспроизводит все термодинамические и кинетические данные о ББЛ, полученные в диапазоне рН 6–11.Связь между переносом протона и нисходящей складкой в ​​одном состоянии также воспроизводит унимодальные распределения, наблюдаемые SM-FRET при pH 6 [32], вместе с появлением бимодальных гистограмм SM-FRET между pH 7–8, как Huang et al. наблюдайте [33]. Еще более поразительно, что этот простой механизм также может объяснить нетрадиционные особенности экспериментальных результатов Хуанга и др.: 1) тот факт, что пик, помеченный как нативное состояние, демонстрирует значительное уменьшение E в зависимости от денатуранта; 2) несоответствие между C m измеренными объемным CD и SM-FRET; и 3) отсутствие динамического усреднения в гистограмме, полученной с использованием 0.Временные интервалы 8 мс.

    Подводя итоги, можно сказать, что наши эксперименты и анализ показывают, что традиционный механизм укладки с двумя состояниями не может объяснить термодинамическое, кинетическое и одномолекулярное поведение BBL в диапазоне pH 6–11. Конечно, всегда трудно исключить более сложные интерпретации, связанные с несколькими промежуточными состояниями в BBL. Однако мы можем однозначно заключить, что связь между стадией медленного переноса протона и развертыванием вниз по склону в одном состоянии является простейшим механизмом, который объясняет все доступные экспериментальные данные о сворачивании ББЛ на количественном уровне и, таким образом, решает загадку кажущегося непоследовательность в экспериментах с одной молекулой.

    Экспериментальные методики и теоретические расчеты

    Приготовление образцов BBL в мультимолярных растворах GdmCl

    Для всех экспериментов, проведенных в рамках этого исследования, мы использовали один и тот же длинный вариант BBL, включая короткие неструктурированные хвосты, которые мы использовали ранее для экспериментов SM-FRET [32]. Для измерения химической денатурации BBL при фиксированных значениях pH учитывалось влияние ионного хаотропа GdmCl на показания pH стеклянных электродов, а также сдвиги pK a биохимических буферов, вызванные сильно увеличивающимся ионная сила, связанная с мультимолярными концентрациями GdmCl [35], [44].Мы гарантируем, что все образцы данной кривой денатурации были установлены на одно и то же значение pH независимо от концентрации GdmCl путем индивидуальной настройки pH каждого образца. В частности, мы отрегулировали рН каждого образца путем смешивания растворов GdmCl с заданной конечной концентрацией, приготовленных на кислотном и основном компонентах буфера. Смесь варьировали до получения целевого значения рН со стеклянного электрода стандартного рН-метра. Мы рассчитали целевое значение рН как функцию GdmCl, используя формулу эмпирической коррекции, полученную Гарсиа-Мира и соавторами [44].Затем мы приготовили окончательный раствор, смешав буфер с отрегулированным рН (до конечной концентрации 50 мМ) с высококонцентрированным исходным раствором BBL (до конечной концентрации 50 мкМ) и NaCl для достижения ионной силы 250 мМ ( без учета вклада GdmCl). pH и концентрацию GdmCl каждого образца перепроверяли после опытов со стеклянным электродом и рефрактометрически соответственно. Для экспериментов при рН 6 и 7 использовали фосфатный буфер, при рН 8 — буфер MOPS, при рН 9 — боратный буфер, а при рН 10 и 11 — карбонатный буфер.Образцы BBL для экспериментов с CD готовили при концентрации белка 50 мкМ. Образцы для экспериментов по флуоресцентному Т-скачку готовили при концентрации белка 10 мкМ с использованием образцов BBL, меченных Alexa546 и Alexa647, в качестве донорных и акцепторных зондов для измерений FRET. Образцы для экспериментов с T-переходом готовили при концентрациях GdmCl, примерно совпадающих со средней точкой химической денатурации при каждом pH, и добавляли 5 мМ аскорбиновой кислоты для минимизации фотоповреждения флуоресцентных зондов.

    Кривые денатурации кругового дихроизма

    спектров КД были получены на спектрополяриметре Jasco J-815, оборудованном регулятором температуры Пельтье для поддержания фиксированной температуры образца на уровне 279 К.

    Флуоресцентные эксперименты T-Jump

    Измерения индуцированного лазером скачка температуры

    FRET проводились с использованием специально изготовленного прибора, основанного на предыдущей установке [11]. Вкратце, основная длина волны лазера Nd:YAG (Litron Nano-LG-320), работающего с частотой повторения 1 Гц, сдвинута до 1907 нм, чтобы соответствовать поглощению колебательных мод воды с использованием рамановской ячейки с длиной пути 1 м ( Лайтадж Инк.), заполненный смесью H 2 и Ar при 1500 фунтов на квадратный дюйм. Первый луч, преобразованный по Стоксу, выбирается с помощью призмы Пеллина-Брока и диафрагмы, а затем фокусируется на образце. Таким образом были получены импульсы нагрева до 20 мДж, вызывающие локальные скачки температуры около 8–10 К. Реакцию образца на это возмущение наблюдали, используя в качестве зонда флуоресценцию, испускаемую присоединенными красителями. Возбуждение донора (Alexa 546) осуществлялось второй гармоникой (532 нм) Nd:YAG-лазера (Ekspla NL202/SH).Флуоресценцию, испускаемую образцом, собирали перпендикулярно пути возбуждающего луча с помощью плосковыпуклой линзы, рассеивали с помощью спектрографа (Princeton Instruments Acton SpectraPro 2150i) и регистрировали спектры с помощью ПЗС-камеры с задней подсветкой (Princeton Instruments Pixis 100). ). Задержка между лазером накачки и зондирующим лазером устанавливалась с помощью цифрового генератора задержки (Stanford Research Systems DG535) и измерялась цифровым счетчиком (Agilent Technologies 53132A) с дрожанием между двумя импульсами около 1 нс.Спектры при различных временах задержки были собраны и проанализированы с использованием пользовательского скрипта Matlab для получения кинетики. Раствор образца хранился в кварцевой кювете со съемными окнами, имеющими оптический путь 0,5 мм, и термостатировался при надлежащей базовой температуре с использованием двух термоэлектрических охладителей Пельтье (TE Technology inc) в специально изготовленном держателе образца. Амплитуда температурного скачка калибрована по Родамину Б в качестве стандарта. После калибровки мы выполнили серию измерений, установив образцы белка при базовой температуре ~275 К (минимум, достижимый с нашей установкой) и индуцируя Т-скачки до конечной температуры около 280 К.Эти конкретные условия были выбраны так, чтобы максимально точно соответствовать температуре, используемой для измерений равновесия и предыдущих экспериментов SM-FRET, при этом имея достаточно большой T-скачок для получения кинетических кривых с хорошим отношением сигнал/шум. Подобным образом проводились эксперименты по Т-скачку при различных конечных температурах.

    Теоретическая модель и расчеты

    Для всех расчетов, включенных в эту работу, мы использовали версию одномерной модели поверхности свободной энергии, которую мы ранее разработали для анализа [17], [39] и предсказания [41] фолдинга белков.Модель определяет одномерную поверхность свободной энергии как функцию нативности параметра локального порядка ( n ), что соответствует вероятности того, что любая данная пептидная связь в белке будет находиться в своей нативной конформации (собственные двугранные углы). И конформационная энтропия, и энтальпия стабилизации линейно зависят от размера белка (количество аминокислот, N ) и определяются следующими соотношениями: (1) (2) где ΔH(n) — цепь Маркова, x — цепь Маркова. характерная скорость разрыва нативных стабилизирующих взаимодействий [41] (здесь равна 0.4 для BBL, который обеспечивает сценарий сворачивания вниз по склону в одном состоянии для этого белка), ΔS conf,res — стоимость в конформационной энтропии для фиксации остатка в нативной конформации (здесь установлено значение 16,75 Дж·моль −1 ·K -1 [17]), ΔH res — чистый прирост энтальпии стабилизации на остаток (здесь установлено значение 7 кДж·моль -1 ), N  = 40 для BBL. Статистический вес любого вида в непротонированной форме, определяемый заданным значением n , рассчитывается как (3), где Т принимается за экспериментальную температуру 279 К.Статистические веса видов, принадлежащих к протонированной форме белка, рассчитываются как (4), где pKa(n) описывается здесь простой линейной зависимостью pKa(n)  = 5+9( 1−n ) (т.е. это определение устанавливает pKa  = 5 для полностью нативного BBL и pKa ∼11 для полностью развернутого BBL с ∼0,3). Согласно этим определениям, полная статистическая сумма описывается выражением (5), которое также может быть легко вычислено для дискретизированной версии модели как сумма статистических весов выбранных дискретных значений n (т.грамм. каждые 0,01).

    Кинетическое описание модели состоит из двух компонентов. Первый член связан с кинетикой движения на поверхности свободной энергии непротонированной и протонированной форм, которая принимается как диффузионная при точно такой же трактовке, как описано ранее [17]. То есть изменения n для обеих форм протонирования во времени рассчитываются с использованием матричного формализма Сабо для одномерной диффузии [54] и установкиВторой термин включает кинетический обмен между непротонированной и протонированной формами белка, который, как мы ограничиваем, происходит только между видами с равными n . Общая скорость протонирования (on) для каждого значения нативности определяется как сумма трех скоростей второго порядка для учета процессов, катализируемых переносом кислоты, основания и аминогруппы [55], с использованием следующего выражения: (6) k A – скорость кислотного катализа (здесь установлено значение 9·10 9 M −1 ·s −1 ), k B – скорость основного катализа (установлено значение 6· 10 6 M −1 s −1 ), [G] – концентрация гуанидиния в опыте, k ex,A и k ex,B – аминоперенос скорости протонного обмена для протонированной и непротонированной форм амина в растворе соответственно (здесь установлено значение 8·10 2 M -1 · с -1 и 3·10 2 M -1 · с -1 ).Скорость депротонирования (выключения) для каждого значения нативности напрямую определяется детальным балансом:

    (6) Мы смоделировали влияние химических денатурантов при каждом значении рН путем титрования с небольшими интервалами ΔH рез от 7 кДж·моль -1 до значения 4 кДж·моль -1 , что было достаточно для достижения полного разворачивания BBL при всех условиях рН. Середину денатурации рассчитывали как максимум производной кривой развертывания [56], определяемой изменениями средней нативности в зависимости от денатурирующего стресса.Эксперименты по лазерному Т-скачку в химической средней точке моделировались путем интегрирования матрицы скоростей в средней точке денатурации для каждого условия рН с использованием в качестве начальных популяций для всех частиц, полученных при 275 К (т. е. путем установки T  = 275 в уравнении 3). . Затем зависящие от времени вероятности для всех видов в дискретизированной версии модели были объединены с временным спадом общего сигнала нативности путем вычисления: (7)

    Моделирование стохастической кинетики одиночной молекулы с помощью модели выполнялось, как описано ранее [32], но с определением трех возможных зависящих от времени переходов из каждого микросостояния (определяемого с точки зрения нативности и статуса протонирования): вперед, назад, протонирование-депротонирование, согласно следующим правилам: (8) где D — коэффициент внутримолекулярной диффузии, а Δ t выбирается достаточно малым, чтобы гарантировать, что полная вероятность перехода из любого заданного микросостояния (сумма трех вероятностей перехода) всегда < 0.1.

    Авторские взносы

    Инициатива и разработка экспериментов: В.М. Выполнены опыты: МК ЛК РР ВМ. Проанализированы данные: MC LC RR VM. Написал статью: В.М.

    Каталожные номера

    1. 1. Джексон С.Е. (1998) Как складываются небольшие однодоменные белки? Вариант складывания 3: R81–R91.
    2. 2. Хао М.Х., Шерага Х.А. (1998) Теория совместной укладки белков в двух состояниях. Accts Chem Res 31: 433–440.
    3. 3. Tanford C (1968)Денатурация белков.Adv Prot Chem 23: 121–282.
    4. 4. Икаи А., Танфорд С. (1973) Кинетика разворачивания и повторного складывания белков.1. Математический анализ. Дж. Мол. Биол. 73: 145–163.
    5. 5. Onuchic J, Luthey-Schulten Z, Wolynes PG (1997) Теория сворачивания белков: перспектива энергетического ландшафта. Annu Rev Phys Chem 48: 545–600.
    6. 6. Брингельсон Дж. Д., Онучич Дж. Н., Соччи Н. Д., Волинс П. Г. (1995) Воронки, пути и энергетический ландшафт сворачивания белков: синтез.Белки: Struct Funct Genet 21: 167–195.
    7. 7. Чан Х.С., Дилл К.А. (1998)Свертывание белков в ландшафтной перспективе: графики Шеврон и неаррениусовская кинетика. Белки: Struct, Funct, Genet 30: 2–33.
    8. 8. Уильямс С., Косгроув Т.П., Гилманшин Р., Фанг К.С., Каллендер Р.Х. и другие. (1996) Быстрые события при сворачивании белка: плавление и образование спирали в небольшом пептиде. Биохимия 35: 691–697.
    9. 9. Муньос В., Томпсон П.А., Хофрихтер Дж., Итон В.А. (1997) Динамика складывания и механизм образования бета-шпильки.Природа 390: 196–199.
    10. 10. Хаген С.Дж., Хофрихтер Дж., Сабо А., Итон В.А. (1997) Ограниченное диффузией контактное образование в развернутом цитохроме-с: оценка максимальной скорости сворачивания белка. J Phys Chem B 101: 2352–2365.
    11. 11. Садки М., Лапидус Л.Дж., Муньос В. (2003) Насколько быстро происходит гидрофобный коллапс белка? Proc Natl Acad Sci USA 100: 12117–12122.
    12. 12. Кубелка Дж., Хофрихтер Дж., Итон В.А. (2004) «Ограничение скорости» укладки белка. Curr Opin Struct Biol 14: 76–88.
    13. 13. Yang WY, Gruebele M (2003) Складывание на пределе скорости. Природа 423: 193–197.
    14. 14. Наганатан А.Н., Муньос В. (2005)Масштабирование времени складывания в зависимости от размера белка. J Am Chem Soc 127: 480–481.
    15. 15. Акмаль А., Муньос В. (2004) Природа барьеров свободной энергии для сворачивания двух состояний. Белки: Struct, Funct, Bioinf 57: 142–152.
    16. 16. Муньос В. (2007)Конформационная динамика и ансамбли в сворачивании белков.Annu Rev Biophys Biomol Struct 36: 395–412.
    17. 17. Наганатан А.Н., Доши У., Муньос В. (2007)Кинетика сворачивания белков: барьерные эффекты в экспериментах по химической и термической денатурации. J Am Chem Soc 129: 5673–5682.
    18. 18. Гарсия-Мира М.М., Садки М., Фишер Н., Санчес-Руис Дж.М., Муньос В. (2002)Экспериментальная идентификация нисходящей укладки белков. Наука 298: 2191–2195.
    19. 19. Садки М., Фушман Д., Муньос В. (2006)Поатомный анализ глобального нисходящего фолдинга белков.Природа 442: 317–321.
    20. 20. Муньос В., Санчес-Руис Дж. М. (2004) Изучение ансамблей укладки белков: модель с переменным барьером для анализа экспериментов по разворачиванию равновесия. Proc Natl Acad Sci USA 101: 17646–17651.
    21. 21. Наганатан А.Н., Санчес-Руис Дж.М., Муньос В. (2005)Прямое измерение высоты барьера при сворачивании белка. J Am Chem Soc 127: 17970–17971.
    22. 22. Наганатан А.Н., Перес-Хименес Р., Санчес-Руис Дж.М., Муньос В. (2005)Надежность нисходящего сворачивания: рекомендации по анализу экспериментов по равновесному сворачиванию небольших белков.Биохимия 44: 7435–7449.
    23. 23. Muñoz V (2002) Термодинамика и кинетика нисходящего сворачивания белка исследована с помощью простой статистической механической модели. Int J Quant Chem 90: 1522–1528.
    24. 24. Чо С.С., Вайнкам П., Волинс П.Г. (2008) Происхождение барьеров и безбарьерных складок в BBL. Proc Natl Acad Sci USA 105: 118–123.
    25. 25. Олива Ф.Ю., Муньос В. (2004)Простой термодинамический тест для различения двух состояний и складывания вниз.J Am Chem Soc 126: 8596–8597.
    26. 26. Садки М., Фушман Д., Муньос В. (2007) Структурная биология — Анализ кооперативности укладки белков — Ответ. Природа 445: E17–E18.
    27. 27. Наганатан А.Н., Доши У, Фунг А., Садки М., Муньос В. (2006)Динамика, энергетика и структура фолдинга белков. Биохимия 45: 8466–8475.
    28. 28. Ли П., Олива Ф.Ю., Наганатан А.Н., Муньос В. (2009)Динамика нисходящего сворачивания белка в одном состоянии. Proc Natl Acad Sci USA 106: 103–108.
    29. 29. Lin CW, Culik RM, Gai F (2013) Использование VIPT-jump для различения различных механизмов складывания: приложение к BBL и Trpzip. J Am Chem Soc 135: 7668–7673.
    30. 30. Шулер Б., Итон В.А. (2008)Укладка белков, изученная с помощью одномолекулярного FRET. Curr Opin Struct Biol 18: 16–26.
    31. 31. Кампос Л.А., Лю Дж., Ван Х, Раманатан Р., Инглиш Д.С. и др. (2011)Стратегия фотозащиты для флуоресцентной спектроскопии одиночных молекул с микросекундным разрешением.Нат-методы 8: 143–146.
    32. 32. Liu J, Campos LA, Cerminara M, Wang X, Ramanathan R, et al. (2012)Изучение нисходящего сворачивания белка в одном состоянии в одиночных молекулах. Proc Natl Acad Sci USA 109: 179–184.
    33. 33. Хуанг Ф., Ин Л., Фершт А.Р. (2009)Прямое наблюдение ограниченной барьером укладки BBL с помощью резонансной передачи энергии флуоресценции одной молекулы. Proc Natl Acad Sci USA 106: 16239–16244.
    34. 34. Хуанг Ф., Джонсон С.М., Петрович М., Фершт А.Р. (2013) Не тратьте хорошие методы на плохие буферы и неоднозначные данные.Proc Natl Acad Sci USA 110: E331–332.
    35. 35. Кампос Л.А., Муньос В. (2013) Ответ Хуангу и др.: медленный обмен протонами может удвоить количество видов, наблюдаемых в экспериментах по сворачиванию белков с одной молекулой. Proc Natl Acad Sci USA 110: E1242–1243.
    36. 36. Кампос Л.А., Лю Дж., Муньос В. (2009) Важность количественных показателей. Proc Natl Acad Sci USA 106: E139.
    37. 37. Фунг А., Ли П., Годой-Руис Р., Санчес-Руис Дж. М., Муньос В. (2008) Расширение области сверхбыстрой укладки белков: gpW, естественный однодоменный домен среднего размера с топологией альфа + бета, который складывается вниз.J Am Chem Soc 130: 7489–7495.
    38. 38. Наганатан А.Н., Ли П., Перес-Хименес Р., Санчес-Руис Дж.М., Муньос В. (2010) Навигация по режиму сворачивания белков вниз с помощью структурных гомологов. J Am Chem Soc 132: 11183–11190.
    39. 39. Наганатан А.Н., Перес-Хименес Р., Муньос В., Санчес-Руис Дж.М. (2011)Оценка барьеров свободной энергии свертывания белка на основе калориметрических данных с помощью многомодельного байесовского анализа. Phys Chem Chem Phys 13: 17064–17076.
    40. 40. Де Санчо Д., Муньос В. (2009)Скорость фолдинга и стабильность белков: сколько там помимо размера? J Am Chem Soc 131: 2074–2075.
    41. 41. Де Санчо Д., Муньос В. (2011) Интегрированное предсказание скорости сворачивания и разворачивания белка только по размеру и структурному классу. Phys Chem Chem Phys 13: 17030–17043.
    42. 42. Арбели Э., Резерфорд Т.Дж., Шарп Т.Д., Фергюсон Н., Фершт А.Р. (2009)Спуск вниз по сравнению с барьерно-ограниченным сворачиванием BBL 1: эффекты энергетического и структурного возмущения при протонировании гистидина с необычно низким pKa. Дж. Мол Биол 387: 986–992.
    43. 43. Arbely Er, TJ, Neuweiler H, Sharpe TD, Ferguson N, Fersht AR (2010) Значения карбоксильного pKa и кислотная денатурация BBL.Дж. Мол Биол 403: 313–327.
    44. 44. Garcia-Mira MM, Sanchez-Ruiz JM (2001)Коррекция pH и ионизация белка в воде/хлориде гуанидиния. Биофиз J 81: 3489–3502.
    45. 45. Cerminara M, Desai TM, Sadqi M, Muñoz V (2012) Складывающиеся модули для спусков в качестве каркасов для сверхбыстрых датчиков на основе белка широкого диапазона. J Am Chem Soc 134: 8010–8013.
    46. 46. Фергюсон Н., Шарп Т.Д., Джонсон С.М., Фершт А.Р. (2006)Переходное состояние для сворачивания домена, связывающего периферическую субъединицу, содержит надежные характеристики, зависящие от ионной силы.Дж. Мол Биол 356: 1237–1247.
    47. 47. Робиен М.А., Клор М., Омичински Дж.Г., Перхэм Р.Н., Апелла Э. и соавт. (1992) Трехмерная структура раствора E3-связывающего домена ядра дигидролипоамидсукцинилтрансферазы из мультиферментного комплекса 2-оксоглутаратдегидрогеназы Escherichia coli . Биохимия 31: 3463–3471.
    48. 48. Крукс Дж. Э., Хибберт Ф., Вилли А. В. (1977) Перенос протона; Bamford CH, Tipper CFH, редакторы. Амстердам: Эльзевир.
    49. 49.Лиепиньш Э., Оттинг Г. (1996) Скорости обмена протонов в боковых цепях аминокислот — последствия для контраста изображения. Magn Res med 35: 30–42.
    50. 50. Neuweiler H, Sharpe TD, Johnson CM, Teufel DP, Ferguson N, et al. (2009)Спуск вниз по сравнению с ограниченным барьером складыванием BBL 2: механистическое понимание кинетики складывания, контролируемой независимыми зондами тирптофана. Дж. Мол Биол 387: 975–985.
    51. 51. Onuchic JN, Luthey-Schulten Z, Wolynes PG (1997) Теория сворачивания белков: перспектива энергетического ландшафта.Annu Rev Phys Chem 48: 545–600.
    52. 52. Haran G (2012) Как, когда и почему белки разрушаются: связь со складками. Curr Opin Struct Biol 22: 14–20.
    53. 53. Шулер Б., Липман Э., Итон В.А. (2002)Исследование поверхности свободной энергии для укладки белка с помощью флуоресцентной спектроскопии одиночных молекул. Природа 419: 743–747.
    54. 54. Лапидус Л.Дж., Штайнбах П.Дж., Итон В.А., Сабо А., Хофрихтер Дж. (2002)Влияние жесткости цепи на динамику образования петель в полипептидах.Приложение: Тестирование одномерной модели диффузии для динамики пептидов.

Добавить комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован.